Name: Beurteilung der bakteriellen Invasion von Herzzellen in Kultur und Herzkolonisation bei infizierten Mäusen mit Listeria monocytogenes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Lernen Sie die Bewertung der bakteriellen Invasion von Herzzellen in Kultur und die Herzkolonisation bei infizierten Mäusen mit Listeria monocytogenes. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Infektionsmechanismen in kardialem Gewebe.

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Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse des öffentlichen Gesundheitsdienstes AI41816 und AI099339 (N.E.F.) sowie durch F31AI094886-01 (P.D.M.) von NIAID unterstützt. Die Inhalte liegen allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht unbedingt die offizielle Meinung der Finanzierungsquellen dar.

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<li>Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+extravillous+trophoblasts+restrict+intracellular+growth+and+spread+of+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes.</a> PLoS Pathog. 7, e1002005(2011).</li>
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<li>McMullen, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+Listeria+monocytogenes+07PF0776%2C+a+cardiotropic+serovar+4b+strain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of Listeria monocytogenes 07PF0776, a cardiotropic serovar 4b strain.</a> J Bacteriol. 194, 3552(2012).</li>
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Die Autoren berichten von keinen konkurrierenden finanziellen Interessen.

L. monocytogenes ist ein weit verbreiteter und gut charakterisierter menschlicher Erreger, der in der Lage ist, eine Reihe verschiedener Krankheitserscheinungen zu verursachen15. Das Bakterium wurde zuvor für seine Fähigkeit beschrieben, über Barrieren, wie die Blut-Hirn-Barriere und Plazenta-fetale Barrieren zu translozieren, um das zentrale Nervensystem zu erreichen und zu besiedeln bzw. Fötus zu entwickeln. Die In-vivo-Fähigkeit des Organismus, diese Gewebe zu besiedeln, wird oft durch ein...

Listeria monocytogenes ist ein grampositiver intrazellulärer Erreger, der schwere Krankheiten in anfälligen Populationen verursachen kann, einschließlich älterer Menschen, Schwangerer, HIV/AIDS-Patienten und Patienten, die eine Chemotherapie erhalten1. Infektionen in diesen Populationen sind häufig das Ergebnis der Einnahme kontaminierter Lebensmittel, und die meisten Infektionen sind mit großangelegten lebensmittelbedingten Ausbrüchen verbunden2,3. Bei Menschen und anderen Säugetieren ist L. monocytogenes in der Lage, sich über die Epithelgrenze des Dünndarms zu transortieren und anschließend in die Leber transportiert zu werden4,5. Tiermodelle deuten darauf hin, dass aufgenommene Bakterien sich innerhalb der Darmzotten vermehren und durch die Portalvene in die Leber gelangen oder sich über die mesenterischen Lymphknoten in den Blutkreislauf ausbreiten, was zu einer hämatogenen Verbreitung in der Leber und Milz6,7führt. In der Leber und Milz ist das Bakterium in der Lage, sowohl in professionelle Phagozyten als auch in ansässigen parenchymalen Zellen zu vermitteln und stellt schnell Infektionen in diesen Organen her. Mit zunehmender bakterieller Belastung werden zahlreiche Bakterien wieder ins Blut verteilt, wo sie in der Lage sind, empfängliche Gewebe, einschließlich des zentralen Nervensystems und der Plazenta (sofern vorhanden), weiter zu besiedeln. Kolonisierung dieser Standorte schließt die häufigsten Manifestationen der Listeriose beim Menschen, einschließlich Meningitis, Enzephalitis, und fetale Abtreibung2.
Ausgewählte Subpopulationen von L. monocytogenes haben vor kurzem gezeigt, dass eine verbesserte Fähigkeit, in Herzgewebe eindringen und replizieren8. Manifestationen der Herzbeteiligung sind vielfältig und reichen von Endokarditis und Perikarditis bis hin zu fulminanten Myokarditis mit Leitstörungen9-13. Die Gesamtzahl der L. monocytogenes Herzfälle pro Jahr ist gering, kann aber unterschätzt werden, da diese Facette der Infektion im Allgemeinen nicht gut erkannt wird. Die Besiedlung des Herzens durch Krankheitserreger erfordert oft Wirtsveranlagungen wie bereits bestehende Valvularschäden oder künstliche Herzklappen. Es gibt jedoch Isolate von L. monocytogenes, die identifiziert wurden, die für ihre Fähigkeit, die Herzen der infizierten Tiere in Ermangelung von Herzschäden und/oder Anomalien8zu besiedeln bemerkenswert sind.
Hierin werden in vitro und in vivo Methoden zur Beurteilung der bakteriellen Besiedlung von Herzgewebe in infizierten Tieren mit Invasions-Assays in der Gewebekultur sowie lebenden Tierinfektionen beschrieben. Diese Methoden haben sich nicht nur bei der Identifizierung von Stämmen mit dem Potenzial zur Besiedlung von Herzgewebe bei infizierten Tieren als nützlich erwiesen, sondern sollten auch für die Identifizierung von bakteriellen Genprodukten nützlich sein, die dazu dienen, die Invasion von Herzzellen zu verbessern und/oder zu Veränderungen in der Herzpathologie führen. Diese Methoden erleichtern den Vergleich des Kardiographen zwischen mehreren Stämmen. Für die hier beschriebenen Methoden wird L. monocytogenes 10403S als gut untersuchter Vertreter eines nichtkardiotropen Stammes und das klinische Isolat 07PF0776 als repräsentatives Beispiel für einen kardiotropen Stamm verwendet. Diese beiden Stämme wurden ausgewählt, um einen Vergleich für die bakterielle Invasion von Herzzellen in vitro und die Besiedlung von Herzen infizierter Mäuse in vivozu liefern. Das Isolat 07PF0776 ist ein klinisches Isolat, das aus einem interventrikulären Abszess gewonnen wurde, der bei einem HIV+-Patienten eine tödliche Arrhythmie verursachte8. L. Monocytogenes-Isolate können in ihrem Virulenzpotenzial variieren, und angesichts der Neigung für Listerien, Personen mit Immunsuppression zu infizieren und Schwangere, sollten Personen innerhalb dieser Populationen bei der Beurteilung verschiedener klinischer Isolate Vorsicht walten lassen.

<table><tbody><tr><td>Difco</td><td>BHI Bouillon Base</td><td>237200</td><td>2 kg Brain Heart Infusion Pulver (ohne Agar)</td></tr><tr><td>Difco</td><td>Agar</td><td>214510</td><td>2 kg granuliertes Agar</td></tr><tr><td>Difco</td><td>BHI Agar</td><td>241810</td><td>2 kg Brain Heart Infusion Pulver mit 7,5% Agar</td></tr><tr><td>in vitrogen</td><td>LB Broce Base</td><td>12975-084</td><td>2 kg Luria Bouillon Base Pulver (ohne Agar)</td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Glass Deckgläser</td><td>12-545-80</td><td>12-mm-Deckgläser</td></tr><tr><td>aus Glas Falcon</td><td>24-Well-Gewebekulturplatte</td><td>35-3047</td><td>24-Well, plasmabehandelte Gewebekulturplatte</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>14 mL Polystyrol-Röhrchen</td><td>352051</td><td>14 ml Polystyrol-Röhrchen</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>96-Well-Platte mit U-Boden</td><td>35-3077</td><td>96-Well-Platte ohne Gewebekultur Corning</td></tr><tr><td></td><td>0,05 % Trypsin, 0,53 mM EDTA (1X)</td><td>25-052-CI</td><td>Stammlösung von Trypsin EDTA für die Gewebekultur</td></tr><tr><td>Corning</td><td>DMEM (hoher Glukosegehalt, hoher Pyruvatgehalt</td><td>)15-013-CU</td><td>DMEM-Medien ohne FBS, Glutamin oder</td></tr><tr><td>Antibiotika Corning</td><td>Pen/Strepto/Glut Lösung</td><td>30-009-CI</td><td>Stammmischung aus Penicillin, Streptomycin und L-Glutamin für die Gewebekultur</td></tr><tr><td>Corning</td><td>Gentamicin</td><td>30-005-CR</td><td>50 mg/ml Stammlösung von Gentamicin zur Herstellung von Gewebekulturen</td></tr><tr><td>Cellgro (Corning)</td><td>L-Glutamin</td><td>25005197</td><td>Stammlösung L-Glutamin ohne Antibiotika</td></tr><tr><td>Denville</td><td>75cm^2 Kolben</td><td>T1225</td><td>75 cm2 mit Gewebekultur behandelter Kolben</td></tr><tr><td>Denville</td><td>1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>2013004</td><td>1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td></tr><tr><td>ATCC</td><td>H9c2 Cardiac Myoblasten</td><td>CRL-1446</td><td>Herzmyoblasten der Ratte</td></tr><tr><td>Hyklon</td><td>Fötales Rinderserum</td><td>SH30070,63</td><td>Fötales Rinderserum</td></tr></tbody></table>

beurteilung der bakteriellen invasion von herzzellen in kultur und herzkolonisation bei infizierten mäusen mit listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes ist ein grampositiver fakultativer intrazellulärer Erreger, der in der Lage ist, schwere invasive Infektionen bei immungeschwächten Patienten, älteren Menschen und Schwangeren zu verursachen. Die häufigsten Manifestationen der Listeriose beim Menschen sind Meningitis, Enzephalitis und fetale Abtreibung. Eine signifikante, aber viel weniger dokumentierte Fortsetzung der invasiven L. monocytogenes Infektion betrifft das Herz. Die Sterblichkeitsrate durch Herzerkrankungen kann trotz Behandlung bis zu 35% betragen, allerdings ist sehr wenig über die Besiedlung von Herzgewebe und deren folgenden Pathologien bekannt. Darüber hinaus hat sich in jüngster Zeit gezeigt, dass Subpopulationen von L. monocytogenes eine verbesserte Fähigkeit haben, in Herzgewebe einzudringen und zu wachsen. Dieses Protokoll beschreibt detailliert In-vitro- und In-vivo-Methoden, die zur Beurteilung des Kardiographenvon L. monocytogenes Isolate verwendet werden können. Methoden werden zur Infektion von H9c2-Ratten-Herzmyoblasten in der Gewebekultur sowie zur Bestimmung der bakteriellen Besiedlung der Herzen infizierter Mäuse vorgestellt. Diese Methoden sind nicht nur nützlich, um Stämme mit dem Potenzial zu identifizieren, Herzgewebe bei infizierten Tieren zu besiedeln, sondern können auch die Identifizierung von bakteriellen Genprodukten erleichtern, die dazu dienen, die Invasion von Herzzellen zu verbessern und/oder Veränderungen in der Herzpathologie voranzutreiben. Diese Methoden sehen auch den direkten Vergleich des Kardiontropismus zwischen mehreren L. monocytogenes Stämmen vor.

Ausgewählte Isolate von L. monocytogenes zeigen eine verbesserte Invasion von Herzzellen in der Zellkultur und in Mausmodellen der Infektion. Abbildung 1 zeigt ein Beispiel dafür, wie bakterielle Kolonien nach der Fleckbeschichtung von Suspensionen auf Agarmedien auftreten können. Diese Methode ermöglicht eine genaue Beurteilung von KBE innerhalb einer Probe, ohne eine große Anzahl von Agar-Medienplatten zu verwenden. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für einen gewebekulturbasierte...

Listeria monocytogenes verursacht fetale Infektionen bei Schwangeren und Meningitis in anfälligen Populationen. Subpopulationen von Bakterien können Herzgewebe besiedeln, was bei Patienten und Labortieren Zufluss zu Myokarditis führt. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das beschreibt, wie L. monocytogenes Herzzellinvasion in vitro und Herzkolonisation bei infizierten Tieren zu bewerten.

Beurteilung der bakteriellen Invasion von Herzzellen in Kultur und Herzkolonisation bei infizierten Mäusen mit Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, effiziente Methoden zur Beurteilung der mikrobiellen Infektion von Herzzellen mithilfe von in-vivo- und in-vitro-Modellen der Besiedlung des Herzens und der Invasion von Herzzellen bereitzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst Bakterienkulturen angezüchtet und die Bakterienzellen gesammelt, gewaschen und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung resuspendiert werden. Anschließend werden Herzzell-Monolagen, die auf Glasdeckgläsern wachsen, mit einer bakteriellen Suspension infiziert, oder die bakterielle Suspension wird mittels Injektion in die Schwanzvene in Mäuse appliziert. Anschließend werden die Herzzellen in Gegenwart von Gentamycin inkubiert, um extrazelluläre Bakterien abzutöten, gefolgt von einer Zelllyse zur Gewinnung. Bakterien oder infizierte Tiere werden zwei bis drei Tage nach der Infektion auf ihr Wohlbefinden überwacht und anschließend getötet, um die Zielorgane zu isolieren. Schließlich werden Zell- und Organsuspensionen verdünnt und mithilfe einer Spot-Plattierungsmethode ausgestrichen, um die Anzahl lebensfähiger Bakterien zu bestimmen, die mit den Zellen oder Zielorganen assoziiert sind.Schließlich werden

assessing-bacterial-invasion-cardiac-cells-culture-heart-colonization

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Listeria monocytogenes ist ein Modellorganismus für die Untersuchung Immunreaktionen und die genetische Anfälligkeit für Bakterien bei Mäusen intrazellulär. Diese Methode ermöglicht ein bis bakterielle Belastung zu messen und generieren Single-Cell-Suspensionen der Leber und Milz von Mäusen für FACS-Analyse auf Veränderungen in Immunzellen durch Listeria-Infektion zu bestimmen.

Mess-bakterielle Belastung und Immunreaktionen in Mäuse Infizierte mit Listeria monocytogenes</em

Quelle: McMullen, P. D., Freitag, N. E. Bewertung bakterieller Invasion von Herzzellen in Kultur und Herzkolonisierung bei infizierten Mäusen mit Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video demonstriert die Injektion von Listeria monocytogenes in die Schwanzvene einer Maus, um systemische Infektionen zu etablieren. Sie zeigt die bakterielle Zirkulation, Organbesiedlung und die Quantifizierung der bakteriellen Belastung im Herzen durch Homogenisierung von Gewebe, serielle...

Quantifizierung der bakteriellen Last im Mausherz nach der Injektion von Listeria monocytogenes in die Schwanzvene

Dieses Video zeigt eine Methode zur Etablierung eines Infektionsmodells in Plazentagewebe, um die Ausbreitung von Infektionen zu untersuchen. Eine ex vivo Plazenta-Organkultur wird mit Listeria monocytogenes, einem fakultativen intrazellulären Parasiten, infiziert. Die Bakterien dringen in extravillöse Trophoblasten (EVTs) ein, um in das Plazentagewebe einzudringen und sich dann über Zell-zu-Zell-Ausbreitung auf andere Zellen zu vermehren.

Eine Technik zur Etablierung eines bakteriellen Infektionsmodells in einer ex vivo Organkultur

Dieses Video zeigt die Quantifizierung der infektiösen Bakterienlast aus dem perfundierten Mäusegehirn, das mit Listeria monocytogenes infiziert ist.

Beurteilung der bakteriellen Besiedlung in einem Mäusegehirn nach einer Infektion mit Listeria monocytogenes

Dieses Dokument beschreibt ein neues Verfahren für die orale Infektion von Mäusen...

Mündliche Übertragung von<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In Mäusen über die Aufnahme von kontaminierten Speisen

Listeria monocytogenes ist ein Gram-positiven bakteriellen Erreger häufig als ein Hauptmodell für die Untersuchung der intrazellulären Parasitismus verwendet. Imaging späten L. monocytogenes-Infektion Stufen im Rahmen der kleinen interferierenden RNA Bildschirme ermöglicht die globale Untersuchung von zellulären Wege für die bakterielle Infektion von Zielwirtszellen erforderlich.

Imaging InlC Sekretion to Cellular-Infektion durch den bakteriellen Erreger untersuchen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Streptococcus pneumoniae bildet diskrete, nicht eitrige mikroskopische Läsionen im Herzen. Dargestellt ist das Protokoll für ein Mausmodell der kardialen Mikroläsionsbildung. Es werden Anweisungen zur Visualisierung von Mikroläsionen mittels Mikroskopie, zur Unterscheidung zwischen frühen und späten Mikroläsionen und Methoden zum Nachweis des kardialen Umbaus im Herzen von Rekonvaleszenten gegeben.

Visualisierung<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Innerhalb Cardiac Mikroläsionen und anschließende Herz Remodeling

Dieses Protokoll beschreibt , wie C57BL / 6J - Mäuse mit dem Stamm EGD von Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) und zur Messung der Interferon-γ (IFN-γ) Antworten , die durch natürliche Killer (NK) Zellen, natürliche Killer - T (NKT) -Zellen zu inokulieren, und adaptive T-Lymphozyten nach der Infektion. Dieses Protokoll beschreibt auch , wie Überlebensstudien bei Mäusen mit einer modifizierten LD 50 Dosis des Erregers nach der Infektion zu führen.

Experimentelle Infektion mit<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Als Modell für die Untersuchung Host-Interferon-γ Antworten

Ein detailliertes Protokoll von einem Maus-Modell für Enterohemorrhagic E. Coli (EHEC) Besiedlung durch mit Hilfe von Bakterien mit der Bezeichnung der Biolumineszenz wird vorgestellt. Die Erkennung dieser biolumineszenten Bakterien durch eine nicht-invasive in Vivo imaging-System mit lebenden Tieren kann unser gegenwärtige Verständnis der EHEC Besiedlung voraus.

Erkennung von Enterohemorrhagic Escherichia Coli Besiedlung in murinen Host durch nicht-invasive In Vivo Biolumineszenz-System

Während der Infektion kann Listeria Monocytogenes überqueren der Blut - Hirn-Schranke um das Gehirn zu besiedeln. In diesem Protokoll veranschaulichen wir die bakterielle Besiedlung der Organe nach Infektion der Mäuse zu beurteilen. Ein Verfahren zur gesamten Organ Perfusion zur spezifischen Bestimmung der bakteriellen Zahlen in der Anwesenheit von durchführen steht zur Verfügung.

Listeria monocytogenes Infektion des Gehirns

Wir beschreiben beide in vitro und in vivo Infektion-Assays, die verwendet werden können, um die Aktivitäten des Host-Codierung Faktoren zu analysieren.

Verwenden eine bakterielle Erreger, Sonde für zelluläre und organismische Ebene Host Antworten

Lernen Sie die Bewertung der bakteriellen Invasion von Herzzellen in Kultur und die Herzkolonisation bei infizierten Mäusen mit Listeria monocytogenes. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Infektionsmechanismen in kardialem Gewebe.

Beurteilung der bakteriellen Invasion von Herzzellen in Kultur und Herzkolonisation bei infizierten Mäusen mit Listeria monocytogenes (Video) | JoVE Journal

Beurteilung der bakteriellen Invasion von Herzzellen in Kultur und Herzkolonisation bei infizierten Mäusen mit Listeria monocytogenes

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