Massenspektrometrische Ansätze zur Proteinstruktur und Wechselwirkungen zu untersuchen in lyophilisierte Pulver

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Struktur eines Proteins mit Hilfe von Emitt-Wasserstoff, Deuteriumaustausch und lytischer Seitenkettenmarkierung in Verbindung mit Massenspektrometrie hochauflösend zu überwachen. Dies wird erreicht, indem das Protein zunächst in Gegenwart verschiedener Hilfsstoffe lyophilisiert wird. Beim Festkörper-Wasserstoff-Deuterium-Austausch wird das lyophilisierte Protein in einem geschlossenen Trockenmittel unter kontrollierter relativer Luftfeuchtigkeit und Temperatur Deuteriumoxiddampf ausgesetzt.

Für die lytische Markierung wird das Protein mit Hilfsstoffen und einem photoreaktiven Wirkstoff lyophilisiert. Das Fläschchen wird dann mit dem UV-Licht bestrahlt, um den Wirkstoff kovalent an das Protein zu binden. Für jede Methode werden die Proben rekonstituiert und mit einem Massenspektrometer sowohl auf der Ebene des intakten Proteins als auch auf Peptidebene analysiert.

Diese beiden Methoden liefern komplementäre Informationen. Formulierungen, in denen die Proteinstruktur stark erhalten bleibt, zeigen eine verminderte Deuteriumaufnahme und eine erhöhte lytische Markierung, während Formulierungen mit gestörter Struktur eine erhöhte Deuteriumaufnahme und eine verminderte lytische Markierung aufweisen. Chemische Markierungen, wie z. B. der Austausch von Deuteriumwasserstoff und die Photovernetzung in Verbindung mit massenspektrometrischer Analyse, wurden kürzlich angepasst, um die Proteinstruktur und Wechselwirkungen in lebendigen Trägern zu untersuchen.

Der Hauptvorteil dieser Techniken gegenüber bestehenden Methoden wie der CD- und FDIR-Spektroskopie besteht darin, dass die Proteinstruktur und -umgebung im festen Zustand mit hoher Auflösung untersucht werden kann. Geben Sie zunächst 200 Milliliter Deuteriumoxid in das untere Fach eines Trockenmittels und fügen Sie 400 Gramm Kaliumcarbonat hinzu Um eine gesättigte Lösung herzustellen, legen Sie die Trockenmittelplatte aus Porzellan hinein und verschließen Sie die Trockenplatte luftdicht. Lassen Sie es bei fünf Grad Celsius äquilibrieren, um eine stabile relative Luftfeuchtigkeit von fast 43 % zu erreichenAls nächstes stellen Sie die unverschlossenen Fläschchen mit lyophilisiertem Protein in das obere Fach der Trockenform, verschließen Sie die Trockenheit und inkubieren Sie bei fünf Grad Celsius.

Um die Wasserstoff-Deuterium-Austauschreaktion zur Entnahme einer Probe einzuleiten, verschließen Sie das Fläschchen sofort nach der Entnahme aus dem Trockenmittel und löschen Sie dann die Reaktion, indem Sie das Fläschchen und den flüssigen Stickstoff schockfrosten. Lagern Sie das Fläschchen bis zur massenspektrometrischen Analyse bei minus 80 Grad Celsius. Verwenden Sie hochauflösende Massenspektrometrie, um die Proben zu analysieren und den Rückaustausch zu minimieren.

Wie befindet sich das flüssigchromatographische System in einer Kühlbox? Um das Gerät zunächst einzurichten, verbinden Sie die Probenschleife und die Proteinfalle mit dem Ventil, das die Entsalzungs- und Elutionsprozesse steuert. Kalibrieren Sie als Nächstes das System, indem Sie die niedrigkonzentrierte Abstimmmischung in das Massenspektrometer injizieren und den Bereich des Masse-Ladungs-Verhältnisses von 200 bis 3.200 einstellen.

Anschließend kühlt das Kühlsystem auf eine stabile Betriebstemperatur von etwa null Grad Celsius ab. Bereiten Sie den Quenchpuffer mit 0,2 % Ameisensäure und 5 % Methanol in Wasser vor und kühlen Sie ihn auf Eis. Nach dem Überführen der Proben in flüssigen Stickstoff wird vorsichtig ein Fläschchen entnommen und die Probe durch Zugabe von zwei Millilitern Quenchpuffer rekonstituiert.

Laden Sie als nächstes eine geeignete HPLC- und Massenspektrometrie-Methode. Um die Probe hier zu analysieren, entsalzen Sie 20 Pikosolen Myoglobin in der Proteinfalle für 1,7 Minuten mit 5 % Acetylnitril und 0,1 % Ameisensäure. Dann eluieren Sie das Protein über einen 3,3-minütigen Gradienten auf 80 % Acetonitril und 0,1 % Ameisensäure.

Injizieren Sie die Probe und sammeln Sie die Massenspektren über einen Bereich von 200 bis 3.200 Massen-Ladungs-Verhältnis. Um die Masse des intakten Proteins als Referenz zu bestimmen, verwenden Sie die gleiche Methode mit einer falsch bewerteten Proteinprobe. Ermitteln Sie die Proteinmasse, indem Sie die Rohspektren mit Hilfe einer Datenanalysesoftware entfalten. Stellen Sie für die Analyse von Myoglobinproben den Massenbereich von 15 bis 18 ein, die Massenauflösung von Kilodalton auf ein Dalton und den Peak-Kite auf 90 %Für die Peptidanalyse bereiten Sie die Proben mit dem gleichen Protokoll wie für intakte Proteine vor.

Wenn die Proben zur Analyse bereit sind, schließen Sie eine immobilisierte Pepin-Säule und eine analytische Säule an das Ventil an und ersetzen Sie die Proteinfalle durch eine Peptidfalle. Kalibrieren Sie das System für Peptide, das für intakte Proteine durchgeführt wurde, aber indem Sie den Bereich des Masse-Ladungs-Verhältnisses von 100 bis 1700 einstellen, kühlen Sie das Kühlsystem dann auf eine stabile Betriebstemperatur von etwa null Grad ab. Sobald das System kalibriert ist, programmieren Sie die entsprechende HPLC- und Massenspektrometrie-Methode.

Hier verdauen Sie 20 Pikosolen Myoglobin auf der Pepin-Säule mit 0,1 % Ameisensäure in Wasser, programmieren Sie das Verfahren zum Einfangen und Entsalzen der Peptide in der Peptidfalle für 1,7 Minuten mit 10 % Acetylnitril und 0,1 % Ameisensäure, und um die Peptide in vier Minuten mit einem auf 60 % Acetylnitril und 0,1 % Ameisensäure ansteigenden Gradienten zu eluieren. Injizieren Sie als Nächstes die Probe und sammeln Sie die Massenspektren über einen Bereich des Masse-Ladungs-Verhältnisses von 100 bis 1700. Analysieren Sie eine undatierte Peptidprobe mit Tandem-Massenspektrometrie, um die peptischen Fragmente zu identifizieren.

Überprüfen Sie dann das experimentell ermittelte Fragment mit softwaregenerierten vorhergesagten Massen. Legen Sie als Nächstes den Massengrenzwert auf 10 Teile pro Million fest, um Massen mit hohem Fehler für Peptide mit Übereinstimmungen zu eliminieren. Notieren Sie den Ladungszustand der Peptidsequenz und die Retentionszeit.

Verwenden Sie die zusammengestellten Peptiddaten, um die durchschnittliche Anzahl der pro peptischem Fragment eingebauten Deuteros zu berechnen. Mit der Datenanalysesoftware Lyophilisieren Sie zunächst das Protein mit dem Hilfsstoff und Lucin, wie im Textprotokoll angegeben. Nach der Vorbereitung der Proben wird ein UV-Vernetzer mit 365-Nanometer-UV-Lampen eingeschaltet. Lassen Sie die Lampen fünf Minuten lang erwärmen.

Sobald die Lampen erwärmt sind, schalten Sie sie aus und stellen Sie die unverschlossenen Durchstechflaschen mit der Formulierung in die Vernetzerkammer. Bestrahlen Sie die Proben 40 Minuten lang mit UV-Licht und schließen Sie Proben ohne Photoleucin als Kontrolle ein. Nach der Bestrahlung der Kappe und lagern Sie die Fläschchen bis zur massenspektrometrischen Analyse bei minus 20 Grad Celsius. Bereiten Sie die Proben für die Analyse vor, indem Sie destilliertes Wasser in Massenspektrometriequalität hinzufügen, um eine endgültige Proteinkonzentration von zwei Mikromolaren zu erhalten.

Analysieren Sie anschließend die Proben mit der gleichen Massenspektrometrie-Methode wie bei den intakten deuterierten Proteinen. Verwenden Sie jedoch nicht das gekühlte LC-System. Erfassen Sie massenspektrometrische Daten für eine unmarkierte Proteinprobe, um die native Masse des Proteins zu bestimmen.

Führen Sie die Datenanalyse wie bei den DERATING-Proben für die Analyse auf Peptidebene durch. Führen Sie zunächst eine photolitische Festkörpermarkierung mit intakten Proteinen durch und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius. Als nächstes rekonstituieren Sie die Probe mit 100 millimolaren Ammoniumbicarbonatpuffer, um eine endgültige Proteinkonzentration von 10 Mikromolar zu erhalten.

Mischen Sie die Probe mit Trypsin in einem Verhältnis von 10 zu einem molaren Verhältnis von Protein zu Trypsin und inkubieren Sie dieses Gemisch 16 Stunden lang bei 60 Grad Celsius. Verbinden Sie in der Zwischenzeit die Probenschleife, die Peptidfalle und die analytische Säule mit dem Ventil des HPLC-Systems. Nach der Verdauung des Proteins wird die Reaktion durch Zugabe von 0,1 %iger Ameisensäure in Wasser gestillt, um eine endgültige Proteinkonzentration von zwei Mikromolaren zu erhalten.

Als nächstes programmieren Sie das System mit der HPLC und den Massenspektrometrie-Methoden. Hier injizieren und entsalzen Sie 20 Picomole des verdauten Myoglobins in die Peptidfalle für 1,5 Minuten mit 5 % Acetonitril und 0,1 % Ameisensäure, eluieren Sie die Peptide, indem Sie den Gradienten über 22 Minuten auf 55 % Acetylnitril erhöhen und sammeln Sie die Massenspektren über einen Bereich von 100 bis 1700 Massen-Ladungs-Verhältnis. Verwenden Sie das Online-Tool, um die theoretische Masse des Peptids zu berechnen.

Photoleucin-Addukt mit den Zahlen von Photoleucin, die zuvor aus der Analyse des intakten Proteins gewonnen wurden. Füge mindestens vier übersehene Dekolleté hinzu. Erstellen Sie in Excel eine Massenliste für das Peptid-Photo-Leucin-Addukt.

Gleichen Sie als Nächstes die theoretische Massenliste mit den experimentell beobachteten Massen ab, indem Sie einen Grenzwert festlegen, um Massen mit geringem Fehler zu identifizieren. Während des Austauschs von Deuteriumwasserstoff ermöglicht die Entfaltung des Proteins den Ersatz von Wasserstoff durch Deuteriumproteine, die ihre Struktur beibehalten und weniger anfällig für den Austausch von Deuterium sind. Bei der Festkörper-Wasserstoff-Deuteriumaustausch-Massenspektrometrie an talosehaltigen und Sorbitol-haltigen Myoglobin-Formulierungen zeigte die Sorbitol-haltige Formulierung eine um 46 % höhere Deuteriumaufnahme, was darauf hindeutet, dass die Struktur des Myoglobins in Sorbit während des lytischen Prozesses stärker gestört wird.

Photoleucin-Quervernetzungen zu zugänglichen Aminosäure-Seitenketten. Die photolytische Massenspektrometrie des Festkörpers der Sorbit- und TLOs, die Myoglobinformulierungen enthalten, zeigte eine höhere Photoeine-Aufnahme in der TLOs-Formulierung als in ihrem Gegenstück. Dies deutet darauf hin, dass die Seitenketten in der TLOs-Formulierung zugänglich blieben.

Sowohl der Wasserstoff-Deuterium-Austausch als auch die lytische Markierung verwenden kommerziell verfügbare Regionen und leicht verfügbare MS-Instrumente, um Proteine im festen Zustand für eine gegebene Formulierung zu charakterisieren. Die Gesamtzeit von der Probenvorbereitung bis zur vollständigen Datenanalyse beträgt weniger als zwei Wochen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie hochauflösende Informationen über die Proteinstruktur und ihre Bedeutung für das Design stabiler lyophilisierter Proteinformulierungen erhalten.