Name: Massenspektrometrische Ansätze zur Proteinstruktur und Wechselwirkungen zu untersuchen in lyophilisierte Pulver (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit ssHDX-MS und ssPL-MS Proteinstrukturen in lyophilisierten Pulvern hochauflösend analysieren. Diese Methoden liefern wertvolle Erkenntnisse für die Formulierungsentwicklung.

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Die Autoren danken für ihre finanzielle Unterstützung durch das NIH R01 GM085293 (PI: E. M. Topp) und durch das College of Pharmacy an der Purdue University.

1. Probenvorbereitung und Gefriertrocknung <ol><li> Dialysieren des erforderlichen Volumens von Mb Stammlösung gegen einen geeigneten Puffer und filtriert durch ein 0,22 um-Sterilfilter. </li><li> Vorbereiten des erforderlichen Volumens der Hilfsstoffe und photo-Leucin (L-2-Amino-4,4-azi-pentansäure; PLeu) Stammlösungen in geeigneten Puffer. Filtern Sie die Stammlösungen durch ein 0,22 um Sterilfilter. </li><li> Verwendeten Formulierungen, wie in Tabelle 1 mit den Stammlösungen von Protein, Exzipienten PLeu und Puffer dargestellt. </li><li> Filterproben durch ein 0,22 um sterile Filter, um alle Teilchen in Schritt 1.3 gebildete entfernen. Separat Füllen Sie die Proben mit 0,2 ml in 2 ml-Glasfläschchen. Verwenden Sie Glasflaschen, die zur pleu in den SSPL-MS-Studien aktivieren transparent für UV (365 nm) Licht. </li><li> Last Fläschchen in einem Gefriertrockner und initiieren Gefriertrocknung durch die Gestaltung eines geeigneten Gefriertrocknungszyklus. <ol><li> Hier gefrier Proben bei -40 ° C, gefolgtdurch primäre Trocknen unter Vakuum (70 mTorr) bei -35 ° C für 12 h und Sekundärtrocknung bei 25 ° C für 12 Std. Andere Lyophilisierung Zyklen und Trocknungsverfahren (beispielsweise Sprühtrocknung), können ebenfalls verwendet werden. </li></ol></li><li> Verfüllen die Fläschchen mit lyophilisierten Proben mit Stickstoff vor der Deckelung. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Formulierungen </td><td colspan="5"> Zusammensetzung (mg / ml) vor der Lyophilisierung </td></tr><tr><td> Mb </td><td> Trehalose </td><td> Sorbitol </td><td> pleu c </td><td> Kalium-Phosphat, pH 7,4 </td></tr><tr><td> MbT ein </td><td> 1,7 </td><td> 3.4 </td><td> - </td><td> - </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> MbS ein </td><td> 1,7 </td><td> - </td><td> 3.4 </td><td> - </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> MbT + pleu b </td><td> 1,7 </td><td> 3.4 </td><td> - </td><td> 14,3 x 10 -3 bis 1,43 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> MbS + pleu b </td><td> 1,7 </td><td> - </td><td> 3.4 </td><td> 14,3 x 10 -3 bis 1,43 </td><td> 0.4 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1:... Zusammensetzung von lyophilisierten Formulierungen Mb ein Formulierungen zur ssHDX-MS-Studie verwendet b Formulierungen für die SspI-MS-Studie verwendet c L-2-Amino-4,4-azipentanoic Säure oder photo-Leucin (PLeu). PLeu bei fünf verschiedenen Konzentrationen (14,3 x 10 -3 bis 1,43 mg / ml) entspricht, 1x, molaren Überschuß bezüglich Mb 10x, 20x, 50x und 100x wurden mit MbT und MBS Formulierungen co-lyophilisiert. 2. ssHDX-MS für Intact Protein <ol><li> Hinzufügen einer sättigenden Menge (~ 440 g) K 2 CO 3 in 200 ml D 2 O previously angeordnet in der unteren Kammer eines Exsikkator. Verschließen Sie den Exsikkator luftdicht und lassen Sie sie bei 5 ° C, bis eine stabile relative Luftfeuchtigkeit (RH) von ca. 43% erreicht wird ins Gleichgewicht. Andere RH-Werte von Interesse kann durch die Auswahl unterschiedlicher gesättigten Salzlösungen 23,24 erhältlich. </li><li> Initiieren ssHDX Reaktionen indem uncapped Vials das lyophilisierte Protein im oberen Fach des Exsikkator. Verschließen Sie den Exsikkator luftdicht und Inkubation bei 5 ° C, damit HDX auftreten (Abbildung 2A). </li><li> Sammeln ssHDX Proben zu verschiedenen Zeiten dreifach. Für Mb Formulierungen, sammeln Proben bei neun Zeitpunkten 1, 2, 4, 8, 16, 32, 56, 92 und 144 Stunden. </li><li> Verschließen Sie die Fläschchen unmittelbar nach dem Rückzug aus dem Exsikkator und stillen die Reaktionen durch Flash Einfrieren der Ampullen in flüssigem Stickstoff. Speicher Fläschchen bei -80 ° C, bis die massenspektrometrische Analyse. </li><li> Mit einem geeigneten hochauflösende Flüssigchromatographie-Mass Spectrom Analysieren Sie die Probenmetrie (LC-MS) -Methode. Design oder Kauf einer geeigneten gekühlten LC-System zurückAustausch während der Probenanalyse zu minimieren. Verwenden Sie das Setup der Spalte Aggregat und LC-MS-Methode bereits berichtet 25. HINWEIS: Da die Geschwindigkeit der Amid-Protonen-Austausch ist abhängig von pH-Wert und Temperatur, können Deuteronen im Protein eingebaut mit vorhandenen Wasserstoff in der mobilen Phase (&quot;Rücktausch&quot;) auszutauschen, was zu einem Verlust von Informationen. Obwohl ein saurer pH-Wert (pH 2,5) des Quench-Puffer und HPLC-Lösungsmittel zurückAustausch weitgehend zu minimieren, wodurch die Temperatur (≤0 ° C) mit Hilfe einer geeigneten Säule Kühlsystems weiter zu schützen, die das Protein von der Rückseite Austausch . </li><li> Schließen Sie die Probenschleife und Protein-Trap an das Ventil, das automatisch steuert die Entsalzung und Elutionsverfahren. Kalibrieren des Massenspektrometers durch die Injektion eines TOF geringer Konzentration Tuning-Mix in das Massenspektrometer in der m / z-Bereich von 200-3,200. Das immobilisiertePepsin-Säule und Analysesäule sind nicht für intakte Protein-Analyse erforderlich. </li><li> Stellen Sie die Temperatur im Kühlsystem ° C ≤0 und warten Sie, bis das System eine stabile Betriebstemperatur von ~ 0 ° C zu erreichen. </li><li> Schnelle Übertragung der Proben von -80 ° C in flüssigen Stickstoff für die massenspektrometrische Analyse. Mit einer Pinzette vorsichtig herausziehen jede Küvette aus flüssigem Stickstoff und Rekonstitution der Probe durch Zugabe eines spezifischen Volumen eiskalter Quench-Puffer, enthaltend 0,2% Ameisensäure (FA) (pH 2,5) und 5% Methanol in Wasser in das Fläschchen. </li><li> Programmieren einer geeigneten HPLC und Massenspektrometrie-Verfahren unter Verwendung der Steuerungssoftware. Für Mb Formulierungen desalt Probe enthält 20 pmol Mb im Protein Falle für 1,7 min mit 5% Acetonitril, 95% Wasser und 0,1% Ameisensäure (FA), und Eluieren mit einem Gradienten auf 80% Acetonitril, 20% Wasser und 0,1 % FA in 3,3 min. Sammeln Massenspektren über den m / z-Bereich 200-3,200. </li><li> Zur Bestimmung der Masse der intaktenProtein, zu erwerben Daten für eine deuterierte Proteinprobe (dh Protein nicht ssHDX zogen) in wässriger Lösung unter Verwendung des Verfahrens von Schritt 2.9. </li><li> Besorgen Sie sich die Massen von undeuterierten und deuterierten Proben durch Entfalten der Rohspektren mit Datenanalyse-Software. Hier setzen Sie den Massenbereich zu 15,000-18,000 Da, die Massenauflösung bis 1,0 Da und der Peakhöhe um 90% für die Berechnung der Masse von Mb. </li><li> Berechnung der Anzahl von Deuteronen in intakten Proteins (hier Mb) eingebaut, indem die Masse der undeuterierten Proteins aus der Masse der deuterierten Protein bei jedem Austausch Zeitpunkt. </li><li> Die prozentuale Deuteriumaufnahme bezogen auf die theoretische maximale Verwendung der folgenden Gleichung zu berechnen (Gleichung 1) <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/52503/52503eq1.jpg" width="500px" /> wo Gesamtzahl der austauschbaren Amide = Gesamtzahl der Aminosäuren - Anzahl der Prolin - 2 (&quot;2&quot; Rechnungslegung für das N-terminalen Aminogruppe und Amid-Wasserstoff, die eine schnelle Back-Austausch unterzogen werden). </li><li> Montieren Sie die ssHDX kinetischen Daten mit einem geeigneten Exponentialgleichung. Biexponentiell Gleichung (Gleichung 2) ist normalerweise am einfachsten, die einen angemessenen Sitz bietet den ssHDX Daten. In dieser Studie für MBA und MBS passen die Daten an einen biexponentiellen Modell, Deuteronen zuweist &quot;schnell&quot; und &quot;langsam&quot; Austausch-Pools. <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/52503/52503eq2.jpg" width="487px" /> wobei N schnellen und langsamen N stellt die Anzahl der austauschbaren Amide in der &quot;schnellen&quot; und &quot;langsamen&quot; Austausch-Pools sind, und k eine schnelle und langsame k sind die erste Ordnung Geschwindigkeitskonstanten der beiden Pools zugeordnet. </li></ol> 3. ssHDX-MS für Protein in Peptide Ebene <ol><li> Führen ssHDX durch folgende Schritte 2.1 bis 2.8, mit folgenden Änderungen in Schritt 2.6. Schließen Sie das immobilisiert Pepsin colUMN und HPLC-Säule zu dem Ventil 25, wie zuvor berichtet, und das Protein-Trap an das Ventil mit einem Peptid Falle verbunden ersetzen. Kalibrieren des Massenspektrometers, indem die Masse-Verhältnis im Bereich von 100 bis 1700 zu berechnen. HINWEIS: Bei der Rekonstitution Schritt (Schritt 2.8), kann ein Reduktionsmittel und Denaturierungsmittel im Quench-Puffer enthalten sein, um Pepsin Verdauung der Proteine ​​mit Disulfidbrücken (zum Beispiel monoklonale Antikörper) zu erleichtern. </li><li> Programm zu einem geeigneten HPLC und Massenspektrometrie-Verfahren unter Verwendung der Steuerungssoftware. Für Mb Formulierungen verdauen Proben, die 20 pmol Mb Online mit 0,1% FA, Falle und Entsalzen von Peptiden für 1,7 min mit 10% Acetonitril, 90% Wasser und 0,1% FA in einem Peptid-Falle. Eluieren die Fragmente auf die analytische Säule mit einem Gradienten Anstieg auf 60% Acetonitril, 40% Wasser und 0,1% FA in 4,0 min. Erwerben Massenspektren über den m / z-Bereich 100-1,700. </li><li> Identifizieren Sie die Magen-Darm-Fragmente, die durch MS / MS-Analyse einundeuterierten Proteinprobe. Verwenden Massenspektrometrie Software zur experimentellen Massen von Peptidfragmentionen zu den vorhergesagten Massen von Peptidfragmente in einer benutzerdefinierten Datenbank zu vergleichen. Legen Sie einen Massenausschluss Punkt (zB 10 ppm) zu Massen mit geringen Fehler zu identifizieren. Für Peptide abgestimmt, bereiten eine Liste von (i) Peptidsequenz, (ii) Ladezustand, und (iii) Rückhaltezeit zusammen. </li><li> Verwenden Sie die in Schritt 3.3 erstellten Liste zur Karte und bestimmen Sie die durchschnittliche Anzahl von Deuteronen für je Pepsinverdau Fragment eingebaut. Dies kann durch den Einsatz geeigneter HDX-MS-Datenanalysesoftware 24 erreicht werden. </li><li> Zur Berechnung der Prozent Deuteriumaufnahme und die ssHDX kinetischen Daten für jede der Magen-Darm-Fragmente passen, führen Sie die Schritte 2.13 und 2.14. In dieser Studie HDX kinetische Daten für jede der sechs nichtredundanten Pepsinverdau Fragmente MbT und MBS-Formulierungen wurden auf einen biexponentiellen Assoziationsmodell (Gleichung 2) angebracht ist. </li></ol> 4. SSPL-MS für Intact Protein <ol><li> Um die photolytische Markierungsreaktion ersten Schalter an der UV-Vernetzer beginnen und lassen die Lampen zum Aufwärmen für 5 min. Sicherstellen, dass die UV-Quelle wird mit Lampen mit einer Wellenlänge von 365 nm, die Diazirin Gruppe pleu aktivieren ausgestattet. VORSICHT: Öffnen Sie die Tür des UV-Vernetzer, wenn die Lampen eingeschaltet sind. Schützen Sie Augen und Haut vor UV-Licht, wenn die Quelle nicht durch eine UV-Schutzglas Tür umschlossen. </li><li> Schalten Sie die UV-Vernetzungsmittel vor dem Öffnen der Tür. Sobald die Lampen ausgeschaltet sind, uncap die Fläschchen mit dem lyophilisierten Formulierung und legen Sie sie in der UV-Vernetzer Kammer wie in 2B gezeigt. Bestrahlen der Proben mit UV-Licht für 40 min. </li><li> Führen Kontrollexperimenten durch folgenden Schritt 4.1 bis 4.3 für (i) Proben lyophilisiert ohne pleu und (ii) Proben mit pleu lyophilisiert Rekonstitution in Wasser. </li><li> Cap und die Röhrchen bei -20 ° C, bis die massenspektrometrische Analyse. </li><li> ReconstitUte die feste Proben durch Zugabe eines geeigneten Volumen von Massenspektrometrie Grade destilliertem Wasser, um die Konzentration auf 2 &amp; mgr; M zu bringen. </li><li> Zur Probenanalyse beginnen, führen Sie die Schritte 2.6 und 2.9. HINWEIS: Da Back-Austausch ist nicht ein Problem mit kovalente Markierung, hat SSPL-MS keine speziellen Kühl LC-System benötigen. </li><li> Zur Bestimmung der nativen Masse des Proteins, zu erwerben Daten für eine Proteinprobe, die nicht mit SspI durch folgenden Schritt 2.9 unterzogen wurde. Besorgen Sie sich die Massen an unmarkierten und markierten Proben durch Entfalten der Rohspektren wie in Schritt 2.11 erläutert. </li><li> Berechnung der Anzahl der PLeu mischte Verwendung der folgenden Formel: <img alt="Gleichung 3" src="/files/ftp_upload/52503/52503eq3.jpg" width="438px" /> wobei M L ist die Masse des markierten Proteins, M N ist die Masse des nativen Proteins und 115 ist die durchschnittliche Masse (Da), um nativen Proteins folgenden Einzel pleu Einbeziehung aufgenommen. Beachten Sie, dass die Markierungsreaktion mit th auftritte Verlust von N 2 (28 Da). Die monoisotopischen Masse pleu ist 143,07. </li><li> Berechnen der Prozentsätze von Protein Populationen mit unterschiedlicher Anzahl von Etiketten mit Peak-Höhen von den extrahierten Ionenchromatogramme. <img alt="Gleichung 4" src="/files/ftp_upload/52503/52503eq4.jpg" width="401px" /> wobei &quot;i&quot; bezeichnet die Anzahl der Etiketten, PH i bezeichnet die Spitzenhöhe für markierte Protein L i und PH u die Peakhöhe des unmarkierten Proteins durch Massenspektrometrie beobachtet. </li></ol> 5. SspI-MS für Protein in Peptiden <ol><li> Führen SSPL indem Sie die Schritte 4.1 bis 4.4. </li><li> Für Peptid-Level-Analyse, zu rekonstruieren feste Proben in Ammoniumbicarbonat-Puffer (100 mM, pH 8,0). </li><li> Nach der Zubereitung mischen die markierten Protein-Lösung mit Trypsin bei 10: Molverhältnis von Protein Trypsin 1 und Inkubation bei 60 ° C für 16 Stunden. </li><li> Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,1% FAin Wasser, um die Probe auf eine Endkonzentration 2 uM Protein zu ergeben. </li><li> Verbinden der Probenschleife, Peptid-Falle und Analysesäule zum Ventil in die HPLC-Anlage verbunden. </li><li> Programmieren einer geeigneten HPLC und Massenspektrometrie-Verfahren unter Verwendung der Steuerungssoftware. Für Mb Formulierungen injizieren 20 pmol des verdauten Proteins in die Probenschleife und Entsalzen die Peptide in einem Peptid Falle für 1,5 min mit 5% Acetonitril, 95% Wasser und 0,1% FA, gefolgt von einer Elution in der Analysesäule mit Gefälle zu erhöhen, um 55% Acetonitril, 45% Wasser und 0,1% FA in 22 min. Sammeln Massenspektren über den m / z-Bereich 100-1,700. </li><li> Bereiten Sie eine theoretische Masse-Liste für Peptid-pleu Addukte mit einem Online-Tool wie ExPASy 26 mit Zahlen von pleu zuvor aus dem intakten Protein-Analyse berechnet. Mindestens 4 verpasst Spaltungen. Man beachte, dass die Markierungsreaktion mit dem Verlust von N 2 auftritt. Daher ist die Masse des Peptid-Addukt PLeu = Masse des unmarkierten tryptic Peptid + n (Masse PLeu) - n (Masse der N 2), wobei &quot;n&quot; die Anzahl der PLeu eingebaut. HINWEIS: Wenn die Massenanalyse von intaktem Protein zeigten bis zu drei markierten Populationen von Protein, sollten Sie bis zu drei möglichen pleu Etiketten pro Peptid. 1 (28) = 1.115 Da - für ein Peptid mit der Masse von 1000 Da wäre die theoretische Masse von Peptid-pleu Addukt mit 1 pleu Einarbeitung 1.000 + 1 (143) ist. Ähnlich können die theoretischen Massen von peptid PLeu Addukte mit 2 PLeu, 3 PLeu usw. würden 1.230 Da, 1.345 Da, etc. sind. </li><li> Verwenden Sie die Massenanalyse-Software, um den in Schritt 5.7 mit den experimentell beobachteten Massen erzeugt theoretische Masse Liste übereinstimmen. Legen Sie einen Massenausschluss Punkt (zB 50 ppm) zu Massen mit geringen Fehler zu identifizieren. </li><li> Für Peptide übereinstimmen, bestimmen die tatsächliche Anzahl von PLeu Verwendung der Formel unter Schritt 4.8 (Gleichung 3), wobei M und L M N sind die Massen von markiertem eingeund native Peptid auf. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Mehrere Studien haben vorgeschlagen, dass die lokale Umgebung in lyophilisierten Proben betrifft Proteinabbau 5,29,30. Jedoch eine direkte Beziehung zwischen Proteinstruktur und Stabilität im festen Zustand war nicht aufgrund des Fehlens von hochauflösenden analytischen Methoden denkbar. Die Anwendung der bestehenden hochauflösende Methoden wie HDX und PL zu lyophilisierte Pulver erfordert eine Modifikation der Lösung Protokolle und sorgfältige Interpretation der Daten. HDX-MS und PL-MS wurden nacheinander angenommen, um Proteinkonformationen in der Festkörper überwachen. Die vorgestellten Ergebnisse hier und anderswo 27,28,31-33 haben die Möglichkeit, diese Methoden zu Proteinkonformation mit hoher Auflösung in der festen Umgebung überwacht demonstriert. Obwohl die wichtigsten Schritte bei der Datenanalyse nicht von der Etikettierung in Lösung 34 bis 36 variieren, sind wichtige Überlegungen bei der Versuchsaufbau und die Interpretation der Daten für die Festkörper chemisch erforderlichcal Kennzeichnung. Auswahl des Markierungsreagens muss nach Größe und Mechanismus der Markierung beruhen. Die geringe Größe der Deuterium ermöglicht dem Peptid-Rückgrat, leicht untersucht werden, während die relativ größeren Größe PLeu begrenzt Kennzeichnung an den Seitenketten. Sowohl ssHDX und SspI zeigen keine Präferenz für eine beliebige Aminosäure, so dass die Kennzeichnung nur von Grundgerüst und Seitenketten-Exposition auf die Matrix. Um effektiv zu untersuchen Proteinkonformationen in der Festkörper, müssen die externen Faktoren, die die Kennzeichnung Prozess sorgfältig kontrolliert werden. Die Gesamtmenge und die räumliche Verteilung der Markierungsmittel in lyophilisierter Feststoff ist von wässrigen Lösungen. In ssHDX, kann die Menge an D 2 O in der festen Matrix die Rate der Proteinentfaltung (oder partielle Entfaltung), Rückfaltung und Deuterium-Austausch beeinflussen. Dies ist nicht der Fall mit der Lösung HDX, wobei die Proteinprobe wird normalerweise mit einem großen Volumen von D 2 O verdünntSorgfältige Screening der Wirkungen von Feuchtigkeit auf der ssHDX Rate können die Auswahl der idealen RH Bedingungen. Zur Steuerung der Geschwindigkeit der Feuchtigkeits Sorption und Zusammenbruch der Pulver in Formulierungen, die hygroskopische Hilfsstoffe (zB Saccharose und Trehalose) zu vermeiden, kann ssHDX unter Kühlbedingungen durchgeführt werden (2-8 ° C). Unsere früheren Studie bei Hydratation Wirkungen zeigten eine erhöhte Geschwindigkeit und das Ausmaß des Austausches mit Zunahme der Feuchtigkeitsgehalt, wie erwartet. Im Großteil unserer Arbeit, ein Zwischen RH von 43% bei 5 ° C hat sich als ideal, um Formulierungen in einer vernünftigen Zeit 24 zu unterscheiden. Die Reaktion wird üblicherweise durchgeführt, bis ein Plateau erreicht wird. Dies stellt sicher, dass Feuchtigkeit Sorption und Diffusion in der festen nicht den HDX Rate zu steuern. Die Verwendung von kleinen festen Probengrößen mit vorge Lyophilisierung Volumen ≤2 ml hilft auch zu gewährleisten, dass D 2 O Dampfsorption wesentlichen vollständig ist früh im Wechselperiode. Obwohl ssHDX-MS bietetquantitative Informationen über die Konformation des Proteins in der Festkörper, gibt es bestimmte Bedingungen, bei denen Interpretation der Daten kann nicht vollständig auf dem ssHDX Studie basieren allein. Es ist möglich, dass die verringerte Deuteriumaufnahme in einer Probe (im Vergleich zur Kontrolle) aufgrund der höheren Retention der Proteinstruktur oder die erhebliche Menge an in der Probe vorhandene Proteinaggregaten beobachtet kann. In einem solchen Fall Interpretation der Daten erfordert ssHDX Ergebnisse anderer komplementäre Methoden. Peakverbreiterung in deuteriertem Massenspektren wurde für mehrere Mb Formulierungen 27,28 beobachtet. Dies könnte aufgrund von verschiedenen Faktoren, wie der Anwesenheit von teilweise ungefalteten Proteinpopulation, räumliche Heterogenität in der Probe oder die räumlichen Gradienten in der D 2 O-Konzentration sein. Allerdings wurden diese Faktoren nicht in ssHDX-MS aus und bedarf weiterer Untersuchungen. Wie SSPL-MS ist relativ neu im Vergleich zu anderen Methoden, kontinuierliches Lernen abihre Anwendungen und Beschränkungen erforderlich. In SspI wird das Photovernetzungsmittel mit dem Protein lyophilisiert. Der Mangel an Feuchtigkeit schränkt die Mobilität der Komponenten innerhalb der festen Matrix, und die Teilstruktur Entspannung, die mit Feuchtigkeitssorption in ssHDX auftreten können, ist kein Phänomen in SSPL. Dies begrenzt die Kennzeichnung in SspI in die unmittelbare Nähe des Photovernetzungsmittels. Jedoch anders als HDX-MS, MS / MS-Analyse der kovalent markierten Proteins rückstands Ebene Strukturinformationen bereitzustellen. Seit SSPL Kennzeichnung kovalente und irreversible, zurück Austausch nicht auf, und Proben vorbereitet und ohne Rücksicht auf Verluste von Etiketten analysiert werden. Zur Verbreitung von Markierungsmittel erleichtern und verbessern Markierungseffizienz in der Festmatrix kann SSPL mit zunehmender% rF durchgeführt werden. PLeu Aufnahme kann auch durch Erhöhung der Konzentration der photoreaktiven Mittels verbessert werden. Das molare Verhältnis von Protein zu PLeu kann wie gewünscht variiert werden. Im allgemeinen wird ein molarer Überschuß von 100x PLeu zu ProProtein wird für eine ausreichende Kennzeichnung. Allerdings können hohe PLeu Konzentration im Verlust der Proteintertiärstruktur in der festen Matrix führen. Daher Neben Kennzeichnung Kinetik und Formulierungszusammensetzung, Auswahl der PLeu Konzentration muss auch auf die Erhaltung Protein strukturelle Integrität basieren. Wie pleu selektiv Etiketten XH (X = C, N, O) -Gruppe, ist es möglich, dass Hilfsstoffe mit ähnlichen Kennzeichnung Websites kann großen Einfluss auf die Höhe der Proteinmarkierung. Die Interferenz der Hilfsstoffe in der Verfügbarkeit von PLeu Proteinmarkierung ist noch zu charakterisieren. Es ist bekannt, dass das aus Diazirin Aktivierung erzeugte Carben ist nicht restspezifischen jedoch eine Studie berichtet Tendenz zu Asp und Glu 36. Während es gut, etwa Rest-spezifische Wechselwirkungen zu lernen ist, ist Peptid-Pegelinformation auch nützlich und können zur Hilfsstoffen zu entwerfen, um Regionen mit hoher Belichtungsmatrix im festen Zustand zu sperren. SSPL-MS bietet detaillierte qualitative Informationen jedochquantitative Daten müssen gewonnen werden und robuste Messdaten entwickelt werden, um Formulierungsunterschiede in einer Vielzahl von gefriergetrockneten Systeme zu analysieren gilt. Die Verwendung eines rückstandsspezifischen Etikett in Verbindung mit MS / MS-Analyse weiter ausbauen kann Auflösung zu der Aminosäureebene. Markierungsreagenzien, wie 2,3-Butandion beschriften Arg, N-Hydroxysuccinimid-Derivate für Lys und N -alkylmaleimide Derivate für Cys verwendet, um genau abzubilden molekularen Wechselwirkungen in lyophilisiertes Pulver sein. Allerdings sind diese Reagenzien sind pH-abhängig und die Reaktionen nicht als photolytische Kennzeichnung in der Festkörper sowie gesteuert werden. Ein alternativer Ansatz besteht darin, die Photovernetzungsmittel in der Proteinsequenz mit der Verwendung von auxotrophen Zellinien, ortsgerichtete Mutagenese oder Seitenkette Derivatisierung integrieren. Unsere früheren ssHDX-MS und SspI-MS-Studien haben gezeigt, dass die Kennzeichnung von Protein hängt von der Art und Menge der Hilfsstoffeverwendet 24,27,28,31-33,37,38. ssHDX-MS von Mb mit Guanidinhydrochlorid (Gdn.HCl) co-lyophilisiert zeigte eine größere Deuteriumaufnahme als Mb mit niedrigem Molekulargewicht aus zucker 32 co-lyophilisiert. In einem separaten SSPL-MS-Studie, Mb colyophilisierten mit Gdn.HCl zeigten einen größeren Schutz vor photolytische Kennzeichnung als Mb mit Saccharose 33. Ferner quantitative Messungen ssHDX-MS wurden stark von der Stabilität des Proteins während der Langzeitspeicher 28 korreliert. Diese Studien legen nahe, dass ssHDX oder SspI Protein spiegelt das Ausmaß der Strukturretention des Proteins in lyophilisierter Pulver. Wir glauben, dass die Beibehaltung der Sekundärstruktur in lyophilisierte Pulver bietet günstiges Umfeld für die Seitenkette der Markierung mit pleu und den Schutz von Amid Wasserstoff aus Deuterium-Austausch. , Detaillierte Gegenüberstellung der Informationsgehalt von diesen Methoden muss jedoch in der Zukunft durchgeführt werden. Obwohl die Gründung der Nützlichkeit ssHDX-MS-MS und SSPLals Formulierung Screening-Tool wird letztlich verlangen, dass sie zu viele Proteine ​​angewendet werden, ergibt sich aus unserer jüngsten Studien unterstützt ihre weitere Verbreitung. Mit der Weiterentwicklung werden diese Methoden erwarten weithin nützlich für die Charakterisierung von Festkörperproteinformulierungen in der biopharmazeutischen Industrie zu sein.

Proteinwirkstoffe sind die am schnellsten wachsende Sektor in der biopharmazeutischen Industrie und bieten vielversprechende neue Behandlungsmöglichkeiten für bisher hartnäckigen Krankheiten, darunter hormonelle Störungen, Krebs und Autoimmunerkrankungen ein. Im Jahr 2012 wird der weltweite Markt Biotherapeutika erreicht 138.000.000.000 $ und wird voraussichtlich auf 179 Milliarden Dollar bis zum Jahr 2018 zu erreichen 2. Die Proteine ​​sind größer und zerbrechlicher als herkömmliche Medikamente aus kleinen Molekülen und so sind anfälliger für viele Arten von Abbau 3. Um eine ausreichende Haltbarkeit und Stabilität zu gewährleisten, sind Proteinwirkstoffe oft formuliert als lyophilisierte (dh gefriergetrocknet) feste Pulver. Jedoch kann ein Protein noch abgebaut werden im festen Zustand, insbesondere wenn seine native Struktur wird während des Gefriertrocknungsprozesses 4,5 erhalten. Sicherzustellen, dass Struktur wurde beibehalten machbar ist, nur wenn es analytischen Methoden, die Protein-Konformation in der Festkörper mit sufficien Sonde kannt Auflösung. NMR 6 und Röntgenkristallographie 7 sind die allgemein üblichen Hochauflösungsverfahren, um die Proteinstruktur in Lösung und kristalline Feststoffe 8 beurteilen. Aufgrund der Art der Hilfsstoffe und Verarbeitungsverfahren sind lyophilisierten Proteinformulierungen üblicherweise eher amorph als kristallin 9. Der Mangel an Homogenität und mikroskopische Ordnung macht die oben erwähnten Techniken unpraktisch für Proteine ​​in amorpher Festkörper. Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie (FTIR) 10, Raman-Spektroskopie 11 und Nahinfrarotspektroskopie (NIR) 12 wurden regelmäßig vom biopharmazeutischen Industrie verwendet, um Sekundärstruktur in lyophilisierter Pulver zu der des nativen Lösungs-Struktur zu vergleichen. Allerdings sind diese Verfahren mit niedriger Auflösung und kann nur Informationen über die globalen Veränderungen in der Sekundärstruktur. Solid-State-strukturelle Charakterisierung mittels FTIRhat entweder schwach 13,14 oder arm 15 Korrelation mit langfristiger Lagerstabilität gezeigt. Diese Einschränkungen machen die Notwendigkeit einer geeigneten hochauflösende Methoden zur Proteinstruktur Störungen in der Festkörper identifizieren. Chemische Kennzeichnung in Verbindung mit der Proteolyse und massenspektrometrische Analyse wurde als ein leistungsfähiges Konzept für die Überwachung von Proteinstrukturen und molekularen Wechselwirkungen in wässriger Lösung entstanden. In der pharmazeutischen Entwicklung hat HDX-MS für Epitopkartierung in Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen 16,17 verwendet, um Rezeptor-Arzneimittel-Wechselwirkungen 18 zuzuordnen, um die Effekte von posttranslationalen Modifikationen auf die Konformation des Protein-Arzneistoffe 19 zu überwachen und zu vergleichen, Charge-zu-Charge-Änderung in den Entwicklungs Biosimilars 20. Ähnlich photoaktivierbaren Liganden verwendet worden, um Medikamentenziele zu identifizieren und um die Bindungsaffinität und Spezifität der Wirkstoff-Rezeptor-Wechselwirkungen 21,22 bestimmen. Extend die Anwendung dieser Methoden, um lyophilisierte Formulierungen, hat uns entwickelte Festkörper Wasserstoff Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (ssHDX-MS) und Solid-State-photolytischen Kennzeichnung Massenspektrometrie (SSPL-MS) zu Proteinkonformationen und Hilfsstoff-Interaktionen in lyophilisierten Proben studieren mit hoher Auflösung. In beiden ssHDX-MS und SspI-MS wird das Protein unter idealen Reaktionsbedingungen in lyophilisierter Feststoffe bezeichnet, und die Proben werden dann rekonstituiert und durch Massenspektrometrie mit oder ohne proteolytischen Verdau analysiert. ssHDX-MS informiert über Hauptkette Exposition gegenüber Deuterium Dampf, während SSPL-MS liefert Informationen über die Umgebung der Seitenketten (Abbildung 1). Beide Methoden können somit komplementäre Informationen über Proteinkonformation in der Festkörper bieten. Hier stellen wir eine allgemeine Protokoll für die Untersuchung von Proteinen in lyophilisierter Feststoffe mit ssHDX-MS und SspI-MS (Abbildung 2), wobei Mb alsein Modellprotein. Wir zeigen die Fähigkeit der beiden Verfahren, um Unterschiede in Formulierungen mit zwei unterschiedlichen Hilfsstoffen zu unterscheiden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig1.jpg" /> Fig. 1: ssHDX und SspI Maßnahme Proteinstruktur in lyophilisierter Feststoffe durch unterschiedliche Markierungsmechanismen (A) In HDX das Rückgrat Amidwasserstoffe Austausch mit Deuterium als Funktion der Proteinstruktur und D 2 O Zugänglichkeit. In der Festkörper, die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Deuterium-Austausch sind abhängig von der Höhe des D 2 O Sorption, Protein Mobilität (Entfaltung und Rückfaltung Ereignisse) und der Art der in der festen Matrix vorhandenen sonstigen Bestandteile. (B) In PL, UV-Bestrahlung bei 365 nm veranlasst die Bildung eines reaktiven Carben-Intermediats aus dem Diazirin funktionelle Gruppe PLeu und unspezifisch in jedes XH-Bindung (X = beliebiges Atom) oder ad eingeüber eine C = C-Bindung in ihrer unmittelbaren Umgebung ded. Bei dem Festzustand die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Markierung hängt von der lokalen Konzentration des Markierungsmittels, Bestrahlungszeit, Proteinstruktur und der Art der in der festen Matrix vorliegende Hilfsstoffe. Die Abbildungen A und B zeigen die maximale theoretische Kennzeichnung, die sich auf Grundgerüst und Seitenketten jeweils in Protein auftreten können. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig2.jpg" /> Abbildung 2: Schematische Darstellung zeigt Festkörper HDX-MS (A) und PL-MS (B) für die Protein in lyophilisierten Formulierung.

<table><tbody><tr><td>Pferde-Myoglobin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0630-5G</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Trehalose-Dihydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#T9531</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#240850</td><td></td></tr><tr><td>L-Photo-Leucin</td><td>Thermo Scientific</td><td>#22610</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P0662</td><td></td></tr><tr><td>Kalium Phosphat zweibasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P3786</td><td></td></tr><tr><td>Deuteriumoxid</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>#DLM-4-PK</td><td>Alternate (Kat. Nr.: 151882, Sigma-Aldrich)</td></tr><tr><td>Immobilisiertes Pepsin</td><td>Applied Biosystems</td><td>#2-3132-00</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>#V511A</td><td>Chymotrypsin (Kat. Nr.: #V1062, Promega) kann zusätzlich verwendet werden</td></tr><tr><td>Wasser, Optima LC/MS Grade</td><td>Fisher Chemical</td><td>#7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#34998</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Thermo Scientific</td><td>#28905</td><td></td></tr><tr><td>ESI-TOF Calibrant</td><td>Agilent Technologies</td><td>#G1969-85000</td><td>Leicht entzündliche Flüssigkeit</td></tr><tr><td>Protein</td><td>Microtrap Michrom Bioresources</td><td>TR1/25108/03</td><td></td></tr><tr><td>Peptid-Mikrofalle</td><td>Michrom Bioresources</td><td>TR1/25109/02</td><td></td></tr><tr><td>Analytische Säule</td><td>Agilent Technologies</td><td>Zorbax 300SB-C18</td><td></td></tr><tr><td>Gefriertrockner</td><td>VirTis AdVantage Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stratalinker ausgestattet mit fünf 365-nm-Lampen</td><td>Stratagene Corp.</td><td>Stratalinker 2400</td> HPLC Agilent Technologies 1200 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Serie LC</td><td>Gekühltes LC-System für HDX-MS</td></tr><tr><td>ESI-qTOF MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>6520 qTOF</td><td></td></tr><tr><td>HDExaminer (HDX-MS-Datenanalysesoftware)</td><td>Sierra Analytics</td><td></td><td>http://www.massspec.com/HDExaminer.html</td></tr></tbody></table>

massenspektrometrische ansätze zur proteinstruktur und wechselwirkungen zu untersuchen in lyophilisierte pulver

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Amid Wasserstoff / Deuterium-Austausch (ssHDX-MS) und Seitenketten photolytische Kennzeichnung (SspI-MS), gefolgt von Massenspektrometrie-Analyse kann nützlich für die Charakterisierung lyophilisierte Formulierungen von Proteintherapeutika. Kennzeichnung, gefolgt von geeigneten proteolytischen Abbau kann der Proteinstruktur und Wechselwirkungen mit dem Peptid-Level-Auflösung abgebildet werden. Da die Proteinstrukturelemente werden durch ein Netzwerk von chemischen Bindungen von den Hauptketten und Seitenketten von Aminosäuren, spezifische Markierung von Atomen in den Aminosäureresten gibt einen Einblick in die Struktur und Konformation des Proteins stabilisiert. Im Gegensatz zu den Routineverfahren verwendet werden, um Proteine ​​in gefriergetrockneten Feststoffe (zB FTIR), ssHDX-MS und SspI-MS quantitative und ortsspezifische Informationen zu studieren. Das Ausmaß der Deuteriumeinbau und kinetischen Parameter können bezogen werden, schnell und langsam den Austausch von Amid-Pools (N schnell, N langsam) und spiegelt unmittelbar die degree der Proteinfaltung und Struktur in lyophilisierte Formulierungen. Stabile photolytische Kennzeichnung nicht zurück Austausch, einen Vorteil gegenüber ssHDX-MS unterzogen werden. Hier stellen wir ausführliche Protokolle sowohl ssHDX-MS und SspI-MS, mit Myoglobin (Mb) als Modellprotein bei lyophilisierten Formulierungen, die entweder die Trehalose oder Sorbit.

Hier ssHDX-MS und SspI-MS verwendet worden, um die Wirkung von Hilfsstoffen auf die Konformation und Festkörper-Wechselwirkungen der lyophilisierten Mb Formationen zu untersuchen. Die Konzentrationen von Protein und Exzipienten in dieser Studie sind in Tabelle 1 angegeben. Repräsentative Ergebnisse aus der ssHDX-MS und SspI-MS-Analyse von lyophilisierten Mb mit der oben angegebenen Protokollen dargestellt erhalten. Deuteriumaufnahme bei intakten Proteinebene ssHDX-MS in der Lage, zwischen Mb Formulierungen bei intakten Ebene unterscheiden. Der entfaltet Massenspektren intakter Mb folgenden 144 h ssHDX von Formulierung MbS zeigte eine größere Deuteriumaufnahme als Formulierung MbT (3A). Im Durchschnitt zeigte MbS 46% größer als Deuterium Aufnahme MbT (Tabelle 2). <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig3.jpg"/&gt; Abbildung 3: ssHDX-MS für intakte Mb: (A) Dekonvoliertes Massenspektren von deuterierten intakt Mb von Formulierungen MbT (durchgezogene Linie) und MBS (gestrichelte Linie) nach 144 h ssHDX. Die entfalteten Massenspektrum undeuterierten intakten Mb ist ebenfalls gezeigt (gestrichelte Linie). (B) ssHDX Kinetik für intakte Mb in Formulierungen MbT (durchgezogene Linie) und MBS (gestrichelte Linie). Der zeitliche Verlauf der ssHDX wurde für zwei Phase exponentiellen Verein mit Graph Pad Prism Software-Version 5 (n = 3, ± SD) zu einer Gleichung ausgestattet. Die Deuterierung Kinetik für intakte MBS MbT sind ähnlich zu frühen Zeitpunkten (1-4 h), aber MbS zeigten erhöhte Deuteriumaustausch mit Zunahme der Zeit (8-144 h) (3B). Dies legt die Bedeutung der Auswahl mehr Zeitpunkte für ssHDX bei niedrigeren RH und Temperaturbedingungen. Auch kann die D 2 O Sorption und Diffusion der Rate der ssHDX zum Früh-Zeitpunkt po beeinflussenints. Unsere frühere Studien haben gezeigt, dass Feuchtigkeitssorption in ssHDX vollständig in einem Zeitraum von Stunden, und hat einen minimalen Beitrag zur Kinetik über diese Zeit auszutauschen. Die beobachtete Geschwindigkeit und das Ausmaß des Austausches sind daher nicht einfach Maßnahmen aus D2O Adsorption 27,28. Die kleinen Fehlerbalken in Figur 3b, in dem die Standardabweichungen von drei unabhängigen ssHDX-MS-Proben zeigen, dass das Experiment in hohem Maße reproduzierbar. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Deuterium Uptake (%) b </td><td> N Schnell c </td><td> k schnellen c </td><td> N langsam c </td><td> k langsam c </td></tr><tr><td> MbT ein </td><td> 15,9 ± 0,5 </td><td> 13,1 (0,8) </td><td> 0,43 (0,03) </td><td> 11,0 (0,9) </td><td> 0.019 (0.001) </td></tr><tr><td> MbS ein </td><td> 23,2 ± 0,5 </td><td> 15,4 (0,7) </td><td> 0,49 (0,04) </td><td> 19,2 (0,6) </td><td> 0,024 (0,002) </td></tr><tr><td> Veränderung in% d </td><td> 46% </td><td> 18% </td><td> 14% </td><td> 75% </td><td> 26% </td></tr></tbody></table> Tabelle 2:. Quantitative Messungen von Deuterium-Aufnahme in ssHDX Studien von Mb Formulierungen a Siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung b Percent Deuteriumaufnahme relativ zum theoretischen Maximum von intakten Mb nach 144 h HDX bei 5 ° C, 43% RH (n = 3. , Mittelwert ± Standardabweichung). c Parameter durch nichtlineare Regression der ssHDX-MS kinetischen Daten ermittelt. Zeitlicher Verlauf der Deuterium-Austausch für intakte Mb wurde einem biexponentiellen Assoziationsmodell (Gl. 2) ausgestattet. Die Werte in Klammern sind die Standardfehler der Regressionsparameter. D Die prozentuale Veränderung der Messungen waren calculATED als 100 x [(Wert aus MbS - Wert von MBT) / (Wert aus MBT)]. Die Regressionsparameter (N schnell, langsam N, k schnellen und langsamen k) für Deuterium Aufnahmekinetik MBT und MBS sind in Tabelle 2 angegeben. Obwohl die N schnellen und langsamen N Werte größer MBS als MbT, Unterschiede in den N Zeit Werte waren größer als Unterschiede in den N-Werte schnell. Insbesondere ist die N schnell Wert in MB nur 18% größer als in MbT, während die N langsam Wert in MB 75% größer als in MbT. Dies deutet darauf hin, daß die kleineren Werte in N langsamen MbT kann aufgrund der höheren Retention Mb Struktur oder zum Schutz von Amidgruppen durch Hilfsstoffe, die nach D 2 O in MbS ausgesetzt sind. Allerdings sind die detaillierten Mechanismen nicht klar verstanden. Die Geschwindigkeitskonstanten (k schnellen und langsamen k) für beide Formulierungen sind sehr ähnlich. Deuteriumaufnahme auf der Peptidebene Nach Pepsinverdau wurden insgesamt 52 Peptiden identifiziert. Sechs nichtredundanten Fragmente, entsprechend 100% der Mb-Sequenz wurden für die Analyse verwendet, die hier berichtet. Weitere Informationen finden Sie unter Verwendung von überlappenden Fragmenten erhalten werden, wie von unserer Gruppe bereits 24 ausgewiesen. Die prozentuale Deuteriumaufnahme für jedes Peptid wurde berechnet und die Ergebnisse von 144 hr Proben aufgetragen (4A). HDX Kinetik für die sechs peptischen Fragmente zeigten biexponentiellen Verhalten (4B), was mit Subpopulationen Amidwasserstoffe läuft &quot;schnell&quot; und &quot;langsam&quot; Austausch. <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig4.jpg" /> Abbildung 4: ssHDX-MS für Mb an der Peptidebene: (A) Prozent Deuteriumaufnahme für 6 nicht redundant Magen Fragmente aus Mb in Formulierungen MbT (grau) und MBS (weiß) nach 144 h HDX. (B) ssHDX Kinetik sechs nicht-redundanten Magen Fragmente aus Mb in Formulierungen MbT (durchgezogene Linie) und MBS (gestrichelte Linie). Der zeitliche Verlauf der ssHDX wurde für zwei Phase exponentiellen Verein mit Graph Pad Prism Software-Version 5 (n = 3, ± SD) zu einer Gleichung ausgestattet. Die Regressionsparameter für den nicht redundanten Peptide sind in Abbildung 5 dargestellt. Wie die angepassten Geschwindigkeitskonstanten für Peptidfragmente sind nicht die durchschnittliche Geschwindigkeitskonstante für die einzelnen Amide, die beobachteten Geschwindigkeitskonstanten für die Magen-Darm-Fragmente nicht linear auf die für das intakte Protein beziehen. Die N schnell Werte für die meisten der peptischen Fragmente (außer Fragment 56-69) in Formulierungen MbS waren etwas grßer als jene in MbT (5A). Ebenso zeigten die k-Werte in der Regel schnell kaum einen Unterschied zwischen formulations und in verschiedenen Regionen des Mb Molekül (5B). Allerdings sind die N langsam und k langsam Werte für MBS in allen Fragmenten als für MbT (Abbildung 5C und 5D) deutlich größer. Die erhebliche Steigerung der N langsam und k langsam für MBS-Anleihen können eine größere Mobilität der Amid-Gruppen in den &quot;langsamen&quot; Austausch-Pools zu reflektieren. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig5.jpg" /> Abbildung 5: ssHDX kinetischen Parameter für Mb Magen Peptide: N schnell (A), k schnell (B), N langsame (C) und k langsam Werte (D) von der nichtlinearen Regression der ssHDX-MS kinetischen Daten erhalten sechs nicht-redundanten Magen Peptide aus Mb in Formulierungen MbT (grau) und MBS ( weiß) (n = 3, ± SE). &lt;/ P&gt; Photolytische Kennzeichnung auf intakte Proteinebene Mb bestrahlt in Gegenwart von 20-fach überschüssigen PLeu gebildet mehreren Mb-PLeu Addukte, wie durch LC-MS (6A) detektiert. Die entfalteten Spektren für MbT bestrahlt 40 min mit 20x PLeu zeigte bis zu 3-Etiketten mit dem Zusatz von +115, +230 und +345 Da die Masse an unmarkiertem Mb. MbS ähnlich mit 20x bestrahlt PLeu zeigte weniger PLeu Aufnahme bei intakten Ebene mit bis zu 2 markierten Populationen durch LC-MS nachgewiesen. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig6.jpg" /> Abbildung 6: SSPL-MS für intakte Mb: (A) Dekonvoliertes Massenspektren für MbT (durchgezogene Linie) und MBS (gestrichelte Linie) mit 20x überschüssigen markierten (5% w / w) pleu. Entfaltet Massenspektrum der nativen Mb (Mb gefriergetrocknet und in der Abwesenheit von pleu bestrahlt) als gestrichelte Linie dargestellt. U </em&gt; bezeichnet eine Population von Protein, das unbeschriftete nach der Bestrahlung bleibt. Populationen tragende Protein 1, 2 und 3 PLeu Etiketten werden als 1L, 2L und 3L jeweils dargestellt. (B) SspI-MS Kinetik für intakte Mb in Formulierungen MbT (geschlossene Kreise) und MBS (offene Kreise) als Funktion der PLeu Konzentration. Alle Proben wurden für 40 min bestrahlt. Fehlerbalken sind zu den Symbolen. (C) SspI-MS Kinetik für intakte Mb in Formulierungen MbT (geschlossene Kreise) und MBS (offene Kreise), lyophilisiert und in Gegenwart von überschüssigen 100x PLeu bestrahlt (20,7% w / w) als Funktion der Bestrahlungszeit. Fehlerbalken sind zu den Symbolen. In kinetischen Untersuchungen der Prozentsatz des markierten Proteins exponentiell sowohl MbT und MBS mit zunehmender Bestrahlungszeit (6B). MbS zeigten weniger pleu Aufnahme als MbT bei jedem Bestrahlungszeit. Beide Formulierungen schien ein Plateau bei 40 min zu erreichen. Somit kann eine kinetische Untersuchung uns<html> eful, die Dauer der Bestrahlung erforderlich, um vollständige PLeu Aktivierung erhalten bestimmen. Kennzeichnungs Kinetik wurden ebenfalls als eine Funktion der Konzentration PLeu (6C) untersucht. Der prozentuale Anteil der markierten Proteins erhöht mit pleu Konzentration sowohl MbT und MBS. Jedoch 20,7% w / w PLeu zeigte MbT eine Abnahme PLeu Aufnahme. Dies kann wegen des Ausschlusses von PLeu von der Oberfläche des Proteins bei hohen PLeu Konzentration. Somit sollte eine Untersuchung mit unterschiedlicher Konzentration PLeu durchgeführt werden, um die geeignete PLeu Konzentration, die für eine ausreichende Kennzeichnung für die Proteinoberfläche erlaubt, ohne Oberflächen Ausschluss auszuwählen. In dieser Studie wurde 20x überschüssige pleu zur weiteren Peptid-Level-Studien ausgewählt. Die Gesamt verringert Kennzeichnung MbS beobachtet schlägt schlechte Seitenkette Zugänglichkeit der Matrix, die pleu. Dies ist konsistent mit einer Konformationsänderung in Gegenwart von Sorbit, das in reduzierter Kennzeichnung ergibt. Inhalt &quot;&gt; Photolytische Beschriftung auf der Peptidebene Basierend auf den intakten Proteinmarkierung Studien wurde 20x überschüssige pleu ausgewählt zu MBT und MBS in Peptiden zu vergleichen. Markierten Proben wurden mit Trypsin gespalten und durch LC-MS analysiert. MBT und MBS Proben wurden insgesamt 40 Peptide, entsprechend 100% des Mb Sequenz detektiert. In einigen Fällen kann Trypsinverdauung begrenzten Proteinsequenzabdeckung bereitzustellen, wenn Lys und / oder Arg-Reste sind stark markiert. Zur Verbesserung der Sequenzabdeckung kann auch eine Mischung von Trypsin und Chymotrypsin verwendet, um das markierte Protein zu verdauen. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig7.jpg" /> Abbildung 7: SSPL-MS für Mb auf Peptidebene: Cartoon Darstellung Mb beschriftet mit 20x überschüssige pleu (5% w / w) in Gegenwart von Trehalose (A) und Sorbit (B). Das markierte Protein wurde mit trypsi verdautn und markierten Peptide wurden auf der Kristallstruktur von Mb (PDB ID 1WLA) abgebildet. Die markierten und unmarkierten Bereiche sind magenta und grün sind. SSPL-MS mit Trypsinverdau liefert qualitative Informationen über die Peptide, abgestempelt. Angesichts der unterschiedlichen markierten Populationen am intakten Ebene die Promiscuous Mechanismus PLeu Kennzeichnung und Unterschiede in Ionisierungseffizienz von markierten und unmarkierten Peptiden, ist es schwierig, die quantitative Messwerte für SspI-MS nach Verdau erhalten. Allerdings kann die qualitative Informationen noch einen Einblick in Protein Konformationsänderungen in Peptiden. In dieser Studie zeigten beide MbT und MBS Formulierungen pleu Aufnahme in den meisten Teilen der Proteinoberfläche. Im Vergleich zu MBS-, Peptidfragmente 32-42, 134-139 und 146-153 von MbT zeigte pleu Kennzeichnung (Abbildung 7). Dies legt nahe, daß die Seitenketten dieser Aminosäuren an PLeu ausgesetzt, da der Helices in diesen regions intakt in die MBT-Matrix. Im Gegensatz dazu ist der Schutz vor pleu Kennzeichnung in der MBS-Matrix, die mit strukturellen Störungen in diesen Regionen. Insgesamt zeigen die Ergebnisse von ssHDX-MS und SspI-MS zeigen, dass die Verfahren komplementären hochauflösende Peptidebene Informationen über Backbone (ssHDX-MS) und der Seitenkette (SspI-MS) Belichtung und Trägereffekte in lyophilisierten Proteinformulierungen bereitzustellen .

Hier präsentieren wir detaillierte Protokolle für die Festkörper-Amid-Wasserstoff/Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (ssHDX-MS) und die Festkörper-Photolytische Markierungs-Massenspektrometrie (ssPL-MS) für Proteine in festen Pulvern. Die Methoden liefern hochauflösende Informationen über die Proteinkonformation und -wechselwirkungen im amorphen Festkörper, die für das Formulierungsdesign nützlich sein können.

Massenspektrometrische Ansätze zur Proteinstruktur und Wechselwirkungen zu untersuchen in lyophilisierte Pulver

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Struktur eines Proteins mit hoher Auflösung mittels Wasserstoff-Deuterium-Austausch und lysischer Seitenkettenmarkierung in Kombination mit Massenspektrometrie zu überwachen. Dies wird erreicht, indem das Protein zunächst in Gegenwart unterschiedlicher Hilfsstoffe lyophilisiert wird. Beim Wasserstoff-Deuterium-Austausch im festen Zustand wird das lyophilisierte Protein in einem verschlossenen Exsikkator unter kontrollierter relativer Luftfeuchtigkeit und Temperatur Deuteriumoxid-Dampf ausgesetzt. Bei der lytischen Markierung wird das Protein mit Hilfsstoffen und einem lichtreaktiven Agens lyophilisiert. Das Fläschchen wird anschließend mit UV-Licht bestrahlt, um das Agens kovalent an das Protein zu binden. Bei jeder Methode werden die Proben rekonstituiert und sowohl auf Ebene des intakten Proteins als auch auf Peptid-Ebene mittels Massenspektrometer analysiert.Diese beiden Methoden liefern komplementäre Informationen. Formulierungen, bei denen die Proteinstruktur stark erhalten bleibt, weisen eine verminderte Deuteriumaufnahme und eine erhöhte lytische Markierung auf, während solche mit gestörter Struktur eine erhöhte Deuteriumaufnahme und eine verminderte lytische Markierung zeigen. Chemische Markierungsverfahren, wie der Wasserstoff-Deuterium-Austausch und die photochemische Vernetzung in Kombination mit massenspektrometrischer Analyse, wurden kürzlich angepasst, um Proteinstrukturen und -wechselwirkungen in lebenden Trägersystemen zu untersuchen.Der Hauptvorteil dieser Techniken gegenüber bestehenden Methoden wie CD- und FDIR-Spektroskopie besteht darin, dass die Proteinstruktur und -umgebung im festen Zustand mit hoher Auflösung untersucht werden können. Geben Sie zunächst 200 Milliliter Deuteriumoxid in das untere Fach eines Exsikkators und fügen Sie 400 Gramm Kaliumcarbonat hinzu, um eine gesättigte Lösung herzustellen. Setzen Sie die porzellanene Exsikkatorplatte ein und verschließen Sie den Exsikkator luftdicht. Lassen Sie das System bei fünf Grad Celsius equilibrieren, um eine stabile relative Luftfeuchtigkeit nahe 43 % zu erreichen. Stellen Sie anschließend die ungekapselten Gefäße mit lyophilisiertem Protein in das obere Fach des Exsikkators, verschließen Sie den Exsikkator und inkubieren Sie bei fünf Grad Celsius.Um die Wasserstoff-Deuterium-Austauschreaktion einzuleiten und eine Probe zu entnehmen, verschließen Sie das Gefäß unmittelbar nach dem Herausnehmen aus dem Trockenschrank, und stoppen Sie die Reaktion, indem Sie das Gefäß durch Schnellgefrieren in flüssigem Stickstoff einfrieren. Lagern Sie das Gefäß bei minus 80 Grad Celsius, bis die massenspektrometrische Analyse erfolgt. Analysieren Sie die Proben mittels hochauflösender Massenspektrometrie, um den Rückaustausch zu minimieren.Wie ist das Flüssigchromatographiesystem innerhalb eines gekühlten Gehäuses aufgebaut? Verbinden Sie zunächst zur Instrumenteneinrichtung die Proben-Schleife und die Proteinfalle mit dem Ventil, das die Entsalzungs- und Elutionsprozesse steuert. Kalibrieren Sie anschließend das System, indem Sie die Tuning-Mischung mit niedriger Konzentration in das Massenspektrometer injizieren und den Massen-zu-Ladung-Verhältnis-Bereich von 200 bis 3.200 einstellen.Kühlen Sie das gekühlte System anschließend auf eine stabile Betriebstemperatur von etwa null Grad Celsius ab. Bereiten Sie den Puffer zum Abbrechen, der 0,2 % Ameisensäure und 5 % Methanol in Wasser enthält, vor und kühlen Sie ihn auf Eis. Nach dem Überführen der Proben in flüssigen Stickstoff nehmen Sie vorsichtig ein Gefäß heraus und rekonstituieren die Probe durch Zugabe von zwei Milliliter Abbruchpuffer. Laden Sie als Nächstes eine geeignete HPLC- und Massenspektrometrie-Methode. Um die Probe hier zu analysieren, desalzieren Sie 20 Pikomol Myoglobin im Proteintrapper für 1,7 Minuten mit 5 % Acetonitril und 0,1 % Ameisensäure. Eluieren Sie anschließend das Protein über ein 3,3-Minuten-Gradient, wobei der Anteil auf 80 % Acetonitril und 0,1 % Ameisensäure ansteigt.Das Probenmaterial injizieren und die Massenspektren im Bereich von 200 bis 3.200 Massen-zu-Ladungs-Verhältnis sammeln. Um die Masse des intakten Proteins als Referenz zu bestimmen, dieselbe Methode mit einer ungefilterten Proteinprobe verwenden. Die Proteinmasse durch Entfaltung der Rohdatenspektren mithilfe von Datenanalyse-Software erhalten. Bei der Analyse von Myoglobinproben den Massenbereich von 15 bis 18 Kilodalton, die Massenauflösung auf ein Dalton und die Peakbreite auf 90 % einstellen. Für die Peptidanalyse die Proben mit derselben Methode wie für intakte Proteine vorbereiten.Wenn die Proben zur Analyse bereit sind, schließen Sie eine immobilisierte Pepin-Säule und eine Analysensäule an das Ventil an und ersetzen Sie die Proteinfalle durch eine Peptidfalle. Kalibrieren Sie das System für Peptide wie für intakte Proteine, indem Sie jedoch den Bereich des Masse-zu-Ladung-Verhältnisses auf 100 bis 1700 einstellen, und kühlen Sie das gekühlte System dann auf eine stabile Betriebstemperatur von etwa null Grad. Sobald das System kalibriert ist, programmieren Sie die geeignete HPLC- und Massenspektrometrie-Methode.Hier digerieren Sie 20 Pikomol Myoglobin an der Pepin-Säule mit 0,1 % Ameisensäure in Wasser; programmieren Sie die Methode, um die Peptide 1,7 Minuten lang in der Peptid-Falle mit 10 % Acetonitril und 0,1 % Ameisensäure zu fangen und zu entsalzen und die Peptide innerhalb von vier Minuten mit einem Gradienten, der auf 60 % Acetonitril und 0,1 % Ameisensäure ansteigt, zu eluieren. Als Nächstes injizieren Sie die Probe und sammeln die Massenspektren über einen Massen-zu-Ladungsbereich von 100 bis 1700. Analysieren Sie eine nicht datierte Peptidprobe mittels Tandem-Massenspektrometrie, um die peptischen Fragmente zu identifizieren.Danach das experimentell bestimmte Fragment mit softwarebasiert vorhergesagten Massen vergleichen. Anschließend die Massentoleranz auf 10 Teile pro Million festlegen, um Massen mit hohem Fehler bei Peptiden mit Übereinstimmungen auszuschließen. Notieren Sie die Ladungsstufe der Peptidsequenz sowie die Retentionszeit.Verwenden Sie die zusammengestellten Peptid-Daten, um die durchschnittliche Anzahl an pro pepschem Fragment eingebauten Deuteriumatome zu berechnen. Mit der Datenanalyse-Software zunächst das Protein mit dem Hilfsstoff und Lucin gemäß der schriftlichen Anleitung lyophilisieren. Nach der Probenvorbereitung einen UV-Vernetzer mit 365 Nanometer UV-Lampen einschalten. Die Lampen fünf Minuten lang aufwärmen lassen.Nachdem die Lampen aufgewärmt wurden, schalten Sie sie aus und stellen Sie die ungekapselten Vials mit der Formulierung in die Vernetzungskammer. Bestrahlen Sie die Proben 40 Minuten lang mit UV-Licht, wobei Proben ohne Photo-Leucin als Kontrolle mitgeführt werden sollen. Nach der Bestrahlung verschließen und bei minus 20 Grad Celsius lagern, bis die massenspektrometrische Analyse erfolgt. Bereiten Sie die Proben zur Analyse vor, indem Sie massenspektrometriegeeignetes destilliertes Wasser hinzufügen, um eine endgültige Proteinkonzentration von zwei Mikromolar zu erreichen.Analysieren Sie anschließend die Proben mit derselben Massenspektrometrie-Methode wie für die intakten deuterierten Proteine, verwenden Sie jedoch nicht das gekühlte LC-System. Nehmen Sie Massenspektrometriedaten einer unmarkierten Proteinprobe auf, um die native Masse des Proteins zu bestimmen.Führen Sie die Datenanalyse wie bei den DERATED-Proben für die Peptid-Ebene-Analyse durch. Führen Sie zunächst eine festphasige photochemische Markierung mit intakten Proteinen durch und lagern Sie diese bei minus 20 Grad Celsius. Rekonstituieren Sie anschließend die Probe mit 100 Millimolar Ammoniumbicarbonat-Puffer, um eine endgültige Protein-Konzentration von 10 Mikromolar zu erhalten.Vermischen Sie die Probe mit Trypsin im molaren Verhältnis von 10:1 (Protein zu Trypsin) und inkubieren Sie dieses Gemisch 16 Stunden lang bei 60 Grad Celsius. Verbinden Sie derweil die Probeschleife, die Peptid-Falle und die Analysensäule mit dem Ventil des HPLC-Systems. Nach der Verdauung des Proteins beenden Sie die Reaktion durch Zugabe von 0,1 %iger Ameisensäure in Wasser, um eine endgültige Protein-Konzentration von zwei Mikromolar zu erreichen.Programmieren Sie als Nächstes das System mit den HPLC- und Massenspektrometrie-Methoden. Injizieren und desalzieren Sie hier 20 Pikomol des verdauten Myoglobins 1,5 Minuten lang in der Peptid-Falle mit 5 % Acetonitril und 0,1 % Ameisensäure, eluieren Sie die Peptide durch Erhöhung des Gradienten über 22 Minuten auf 55 % Acetonitril und erfassen Sie die Massenspektren über einen Bereich von 100 bis 1700 Massen-zu-Ladung-Verhältnis. Verwenden Sie ein Online-Tool, um die theoretische Masse des Peptids zu berechnen.Photo-Leucin-Addukt mit den Zahlen von Photo-Leucin, die zuvor aus der Analyse des intakten Proteins erhalten wurden. Berücksichtigen Sie mindestens vier ausgelassene Spaltungen. Erstellen Sie eine Massenliste in Excel für das Peptid-Photo-Leucin-Addukt.Als Nächstes wird die theoretische Massenliste durch Festlegen eines Grenzwerts mit den experimentell beobachteten Massen abgeglichen, um Massen mit geringem Fehler zu identifizieren. Während des Wasserstoff-Deuterium-Austauschs ermöglicht die Entfaltung des Proteins den Ersatz von Wasserstoff durch Deuterium; Proteine, die ihre Struktur beibehalten, sind weniger anfällig für Deuteriumaustausch. Bei der Festkörper-Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie an Myoglobinformulierungen mit Talose und Sorbitol zeigte die Sorbitol-haltige Formulierung eine um 46 % höhere Deuteriumaufnahme, was darauf hindeutet, dass die Struktur des Myoglobins in Sorbitol während des lytischen Prozesses stärker gestört wird.Photo-Leucin verbindet sich mit zugänglichen Seitenketten von Aminosäuren. Die Festkörper-Photolyse-Massenspektrometrie-Analyse der Sorbitol- und TLOs-haltigen Myoglobinformulierungen zeigte einen höheren Photo-Leucin-Einbau in der TLOs-Formulierung im Vergleich zur entsprechenden Formulierung. Dies deutet darauf hin, dass die Seitenketten in der TLOs-Formulierung weiterhin zugänglich blieben.Sowohl der Wasserstoff-Deuterium-Austausch als auch die lytische Markierung nutzen kommerziell verfügbare Reagenzien und leicht zugängliche MS-Geräte, um Proteine im festen Zustand für eine gegebene Formulierung zu charakterisieren. Die gesamte Zeitspanne von der Probenvorbereitung bis zur vollständigen Datenanalyse beträgt weniger als zwei Wochen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie hochauflösende Informationen über die Proteinstruktur gewonnen werden und welche Bedeutung diese bei der Entwicklung stabiler lyophilisierter Proteinformulierungen haben.

mass-spectrometric-approaches-to-study-protein-structure-interactions

Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Die Massenspektrometrie hat sich als wertvolles Tool für die Analyse großer Proteinkomplexe werden. Diese Methode ermöglicht Einblicke in die Zusammensetzung, Stöchiometrie und Gesamtarchitektur des Multi-Untereinheit Baugruppen. Hier beschreiben wir, Schritt-für-Schritt, wie man ein strukturelles Massenspektrometrie-Analyse durchzuführen, und Charakterisierung makromolekularen Strukturen.

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Genaue Massenmessung stellt einen wichtigen Schritt bei der Untersuchung von Proteinen. Matrix-unterstützte Laserdesorption / Ionisation (MALDI) Massenspektrometrie (MS) für eine solche Bestimmung verwendet werden, und deren wesentliche Vorteil ist die Toleranz zu Salzen, Detergenzien und Verunreinigungen. Hier veranschaulichen wir eine zugängliche Ansatz für die Analyse von Proteinen, die größer als 100 kDa durch MALDI-MS.

Matrix-assistierte Laser Desorptions / Ionisations-Flugzeit (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie-Analyse von intakten Proteinen mit mehr als 100 kDa

Konformationsänderungen Flexibilität spielt eine entscheidende Rolle bei der Proteinfunktion. Hier beschreiben wir die Verwendung von zeitaufgelöster Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie gekoppelt Wasserstoff-Deuterium-Austausch für die schnellen Strukturveränderungen Sondieren, die Funktion in geordneten und ungeordneten Proteinen treiben.

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Die Architektur von Proteinkomplexen ist essentiell für ihre Funktion. Kombination von verschiedenen massenspektrometrischen Techniken erwies sich als leistungsstarke, deren Montage zu studieren. Wir bieten Protokolle für chemische Vernetzung und native Massenspektrometrie und zeigen, wie diese komplementären Techniken helfen, die Architektur des Multi-Untereinheit Protein Baugruppen aufzuklären.

Kombination von chemische Vernetzung und Massenspektrometrie intakt Proteinkomplexe, die Architektur des Multi-Untereinheit Protein Baugruppen zu studieren

Protein-Protein und Protein-Metabolit Interaktionen sind entscheidend für alle Zellfunktionen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das parallele Analyse dieser Interaktionen mit einem Protein der Wahl ermöglicht. Unser Protokoll wurde optimiert für die Anlage Zellkulturen und verbindet Affinitätsreinigung mit Massenspektrometrie-basierte Protein und Metabolit Erkennung.

2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Montage und Demontage der Biolayer Interferometrie (BLI) mit Milzbrand-Toxin zu überwachen. Nach Montage/Demontage auf der Biosensor-Oberfläche sind von der Oberfläche zur Visualisierung und Identifikation von Komponenten der komplexe mit Elektronenmikroskopie und Massenspektrometrie, bzw. die große Proteinkomplexe veröffentlicht.

Analyse dynamischer Proteinkomplexe montiert auf und befreit Biolayer Interferometrie Biosensor mit Massenspektrometrie und Elektronenmikroskopie

Massenspektrometrie (MS) hat als ein wichtiges Instrument für die Untersuchung der Struktur und Dynamik der makromolekularen Versammlungen entstanden. Hier integrieren wir MS-basierte Ansätze, um komplexe Proteinbildung und Liganden Bindung zu befragen.

Analyse von Protein-Architekturen und Protein-Ligand-komplexen durch Integrative strukturelle Massenspektrometrie

Hier zeigen wir, wie kleine Winkel x-ray Scattering (SAXS) genutzt werden können, um Informationen auf niedriger Auflösung Umschläge repräsentieren die makromolekularen Strukturen zu erhalten. Bei Verwendung in Verbindung mit hochauflösenden strukturelle Techniken wie Röntgen-Kristallographie und magnetischen Kernresonanz bieten SAXS detaillierte Einblicke in multidomain Proteine und makromolekulare komplexe in Lösung.

Strukturelle Studien von Makromolekülen in Lösung mit kleinen Winkel Röntgenstreuung

Lanthipeptid-Synthetasen katalysieren mehrstufige Reaktionen während der Biosynthese von Peptid-Naturprodukten. Hier beschreiben wir einen kontinuierlichen, Bottom-up, Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (HDX-MS) Workflow, der verwendet werden kann, um die Konformationsdynamik von Lanthipeptid-Synthetasen zu studieren, sowie andere ähnliche Enzyme, die an der Peptid-Naturproduktbiosynthese beteiligt sind.

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Die experimentellen Verfahren zur Durchführung einer diethylpyrocarbonat-basierten kovalenten Markierung mit massenspektrometrischem Nachweis werden beschrieben. Diethylpyrocarbonat wird einfach mit dem interessierenden Protein oder Proteinkomplex gemischt, was zur Modifikation von lösungsmittelzugänglichen Aminosäureresten führt. Die modifizierten Rückstände können nach proteolytischem Aufschluss und Flüssigkeitschromatographie/Massenspektrometrie identifiziert werden.

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Die Neutronenrückstreuspektroskopie bietet einen zerstörungsfreien und markierungsfreien Zugang zur ps-ns-Dynamik von Proteinen und deren Hydratationswasser. Der Workflow wird anhand von zwei Studien zu Amyloid-Proteinen vorgestellt: zur zeitaufgelösten Dynamik von Lysozym während der Aggregation und zur Hydratationswasserdynamik von Tau bei der Faserbildung.

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Erfahren Sie, wie Sie mit ssHDX-MS und ssPL-MS Proteinstrukturen in lyophilisierten Pulvern hochauflösend analysieren. Diese Methoden liefern wertvolle Erkenntnisse für die Formulierungsentwicklung.

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