Bestimmen Membrane Protein Topologie Mit Fluorescence Protease Schutz (FPP)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Topologie von integralen Membranproteinen zu bestimmen. Dies wird durch die Expression eines Ergusses erreicht, eines Proteins zwischen grün fluoreszierendem Protein oder GFP und den Amino- oder Carboxylschwänzen der Membran. Proteine, die in Zellen zu Kontrollzwecken von Interesse sind, können in löslichen fluoreszierenden Proteinen wie RFP exprimiert werden.

Als nächstes wird die Plasmamembran einer selektiven Permeation unterzogen. Mit dem Detergens dig verlassen lösliche fluoreszierende Proteine die Zelle, während membrangebundene fluoreszierende Proteine in der Zelle zurückgehalten werden. Der letzte Schritt ist das Auftragen einer Protease auf die Permezellen und die Bestimmung der Retention oder des Verlusts des Fluoreszenzsignals.

Letztendlich werden Änderungen der Fluoreszenzintensität, die mit Hilfe der fluoreszenzmikroskopischen Bildgebung beobachtet werden, verwendet, um die Topologie und Orientierung integraler Membranproteine zu zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der Epitopkartierung, besteht darin, dass das Verfahren nicht viele spezielle Geräte oder verschiedene Reagenzien erfordert, die möglicherweise schwer zu bekommen sind. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Membranproteinbiologie zu beantworten, z. B. welche Domänen eines integralen Membranproteins sich im Zytosol befinden können und welche Domänen im Lumen von Organellen wie dem endoplasmatischen Retikulum Gold G oder Endosomen lokalisiert sein können.

Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Erzeugung und Validierung des fluoreszierenden Proteins KY, wie im Textprotokoll beschrieben. Dann transfiziert man das fluoreszierende Protein KY in menschliche embryonale Nierenzellen oder HEK 2 93-Zellen unter Verwendung einer standardmäßigen Transfektionsmethode mit hoher Effizienz und geringer Toxizität, einschließlich Lipid-, Virus- oder Elektroporationstechnologien, um eine vorübergehende oder stabile Expression zu erzeugen. Die Zellen werden dann auf Polylysin-beschichtete Deckgläser plattiert. Bewahren Sie die Zellen fünf bis 48 Stunden lang in geeigneten Gewebekulturmedien bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-fähigen Gewebekultur-Inkubator auf.

Überwachen Sie die Zellen auf Expression des GFP-Fusionsproteins mit Hilfe der Epi-Fluoreszenzmikroskopie, und das intrinsische Fluoreszenzsignal des GFP-Fluoreszenzsignals erreicht in der Regel innerhalb von 24 bis 72 Stunden ein Maximum. Nach der Transfektion. Verwenden Sie die Zellen, wenn das Fluoreszenzsignal ein maximales Niveau erreicht Die Proteinexpression kann auch durch Immunblot-Analyse überwacht werden, bei der Antikörper verwendet werden, die entweder gegen das interessierende Protein oder die GFP-Einheit gerichtet sind.

Zu Beginn wird das Schwerkraft-Perfusionssystem für die Behandlung der Zellen eingerichtet. Bereiten Sie 50-Milliliter-Spritzen für Lösungen mit Polyethylenschlauch vor, der an unabhängige Behälter und an einen Verteiler mit einem einzigen Auslass am Bad angeschlossen ist. Positionieren Sie eine Saugpipette, um ein konstantes Badvolumen aufrechtzuerhalten und einen Lösungsaustausch zu erreichen, indem Sie manuell zwischen den Perfusionsreservoirs für die Plasmamembranpermeation umschalten.

Entfernen Sie zunächst das Zellkulturmedium aus den Zellen. Waschen Sie die Zellen dreimal für jeweils eine Minute. Legen Sie die Deckgläser in KHM-Puffer auf einen Fluoreszenzmikroskoptisch und nehmen Sie das erste Bild auf, das das undurchlässige Kontrollbild zur selektiven Permierung der Plasmamembran darstellt.

Geben Sie digit toin in KHM-Puffer zu den Zellen, perfusionieren Sie die Zellen mit Buffer plus digit toin mit einer Geschwindigkeit von fünf Millilitern pro Minute für 10 bis 60 Sekunden. Die Bestätigung, dass die Plasmamembran ausreichend perme ist, kann leicht durch Expression eines löslichen GFP- oder RFP-Moleküls durchgeführt werden, das leicht aus der Zellmembran diffundiert. Die Permeation bestätigt dann, dass das interessierende GFP-Protein-Chimer membranintegriert ist, indem sie die zelluläre Retention des Fluoreszenzsignals nach dem Digo und der Permeation der Plasmamembran bestätigt.

Als nächstes exprimieren Sie ein organisches spezifisches fluoreszierendes Protein, wie z. B. ein mitochondriales Protein, wie im Textprotokoll referenziert. Bestimmen Sie wie bisher die optimalen Expressionsbedingungen. Bestätigen Sie, dass die Ausgrabung und die Konzentration für den verwendeten Zelltyp geeignet sind, indem Sie sicherstellen, dass die Morphologie der intrazellulären Organkanäle über eine längere Exposition konstant bleibt.

Um zu graben. Nachdem Sie die Zellen in KHM-Puffer gewaschen haben, geben Sie die Protease direkt auf die Zellen. Untersuchen Sie die Zellen mit einer Durchflussrate von fünf Millilitern pro Minute mit einem Schwerkraftperfusionssystem, um das Präparat kontinuierlich zu baden.

Bestimmen Sie als nächstes, ob das Fluoreszenzsignal bestehen bleibt oder sich verschlechtert. Sammeln Sie Fluoreszenzmikroskopiebilder unter den entsprechenden Filtersätzen, indem Sie die Videobildaufnahmefunktion eines computergesteuerten Fluoreszenzmikroskops verwenden. Quantifizieren Sie die Intensität des Fluoreszenzsignals in Abhängigkeit von den Inkubationsbedingungen.

Ermitteln Sie die mittlere Pixelintensität innerhalb eines Interessenbereichs, der eine einzelne Zelle umschließt. Ein Verlust von mehr als 90% der anfänglichen Signalintensität über 30 bis 60 Sekunden ist konsistent mit dem proteolytischen Abbau des GFP-Proteins ky. Ein vollständiges Verschwinden des löslichen Fluoreszenzsignals sollte innerhalb von 10 bis 60 Sekunden nach der Anwendung erfolgen.

Die Bestätigung, dass das Protein von Interesse mit intrazellulären Organellen assoziiert ist, wird durch die Feststellung der Beibehaltung des Fluoreszenzsignals nach Didon und Permeation erreicht. Der Carboxylschwanz der membranverankerten Kinase LTK zwei wurde mit GFP fusioniert und exprimierte transient fluoreszierendes ltk. Das GFP-Signal ging nach Zugabe von Proteinase K schnell verloren, was darauf hinweist, dass sich der Carboxylterminus von ltk zwei innerhalb des Zytosols befindet.

Cavi und GFP ist ein Plasmamembranprotein mit einer GFP-Einheit, die an die zytosolische Domäne gebunden ist. Wie bei LTK zwei ist das Signal von Cavi und GFP digit toin-unempfindlich, aber empfindlich gegenüber der nachfolgenden Zugabe von Protease DS red mito kodiert für das rot fluoreszierende Protein, das mit der mitochondrialen Targeting-Sequenz von Cytochrom-C-Oxidase nach Digon-Permeation fusioniert ist, sowie für die Zugabe von Proteinase K. Die Fluoreszenz, die mit DS red mito assoziiert ist, bleibt stabil. Dies stimmt mit der Tatsache überein, dass sich das Fluor vier in den Mitochondrien befindet, wo es nicht dem Zytosol ausgesetzt ist.

Wenn die fluoreszierende Einheit, die an ein Membranprotein gebunden ist, nach außen zeigt, wie bei GPI verankertem Prionprotein, das an ein gelb fluoreszierendes Protein gebunden ist. Die Proteinase-Behandlung sollte das Fluoreszenzsignal schnell löschen, ohne dass zuvor wie erwartet eine Dig-Imp-Permeation erforderlich ist. Nach der Proteinase-Behandlung verschwand das extrazelluläre Fluoreszenzsignal für Zellen, die dieses Konstrukt exprimierten, schnell.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in ein bis zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie Sie die Topologie Ihres interessierenden Membranproteins bestimmen können.