Contrast Imaging in Maus Embryonen Verwendung von Hochfrequenz-Ultraschall

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Mikrobläschen in isolierte lebende Mausembryonen zu injizieren, um eine kontrastverstärkte Ultraschallbildgebung durchzuführen. Dazu werden zunächst lebende Embryonen vom Typ E 16,5 oder E 17,5 von einer trächtigen Maus gewonnen.

Nach der Herstellung der gezielt wirkenden Mikrobläschen werden diese über das vaskuläre Netzwerk der Plazenta in den lebenden Embryo injiziert. Der letzte Schritt besteht in der Bildgebung der Mikrobläschen mittels Ultraschall. Letztendlich kann die kontrastverstärkte Ultraschallbildgebung verwendet werden, um vaskuläre Perfusionparameter zu messen und die gezielte Bindung der Mikrobläschen in Embryonen zu beurteilen.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten mit dem Umgang mit Embryonen und den Injektionsschritten des Protokolls haben, bis sie ausreichend geübt haben, den für einen erfolgreichen Versuch erforderlichen Druck mit Nadel und Pinzette anzuwenden. Die Demonstration des Verfahrens wird von Brian Nixon, einem Praktikanten aus unserem Labor, durchgeführt. Um die Target-Ready-Vials wiederherzustellen, beginnen Sie damit, 20 Mikrogramm der Antikörperlösung auf ein Endvolumen von einem Milliliter physiologischer Kochsalzlösung zu verdünnen. Bewahren Sie die Vials auf Eis auf. Füllen Sie anschließend eine Spritze mit einem Milliliter physiologischer Kochsalzlösung.

Entfernen Sie alle Luftblasen. Befestigen Sie eine 21-Gauge-Nadel und injizieren Sie die Lösung langsam in das Mikrobläschenfläschchen. Ziehen Sie langsam den Kolben zurück, um einen Milliliter Luft zu entnehmen, und ziehen Sie dann die Nadel heraus.

Vorsichtig das Gefäß schwenken und fünf Minuten auf Eis stehen lassen. Nach fünf Minuten eine neue Spritze mit der Antikörperverdünnung füllen und diese dem entsprechenden Gefäß hinzufügen. Nach dem Schwenken die Mischung vorsichtig auf zwei Milliliter einstellen.

10 Minuten auf Eis stehen lassen. Um die nicht gezielten Fläschchen erneut herzustellen, eine Spritze mit einem Milliliter Kochsalzlösung füllen. Alle Luftblasen entfernen.

Befestigen Sie eine 21-Gauge-Nadel und injizieren Sie die Lösung langsam in ein neues Mikrobläschenfläschchen. Ziehen Sie den Kolben langsam zurück, um einen Milliliter Luft zu entnehmen, und ziehen Sie dann die Nadel heraus. Schütteln Sie vorsichtig und lassen Sie die Lösung fünf Minuten lang stehen.

Nachdem ein zusätzlicher Milliliter Kochsalzlösung hinzugefügt wurde, um das Volumen auf zwei Milliliter aufzufüllen, vorsichtig schwenken und 10 Minuten lang auf Eis stehen lassen. Nach dem vorsichtigen Schwenken des gewünschten Mikrobläschenfläschchens etwa 50 Mikroliter der Lösung mit einer 21-Gauge-Nadel an einer Ein-Milliliter-Spritze aufziehen. Anschließend die Mikrobläschen in ein leeres zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen injizieren.

Pipettieren Sie anschließend eine 10-Mikroliter-Probe der Mikrobläschen-Stammlösung in 10 Milliliter Verdünnungsmittel. Nach vorsichtigem Mischen bewerten Sie mithilfe des Coulter-Zählverfahrens die Konzentration und Größenverteilung der Mikrobläschen-Population. Zählen Sie pro Vialprobe mindestens drei Messungen mit jeweils 50 Mikroliter.

Unter Verwendung einer 30-Mikrometer-Blende. Dieser Schritt wird parallel zur Injektion von Mikrobläschen in die Embryonen durchgeführt. Während der Chirurg die Embryonen injiziert, bereitet der Assistent die nächste Injektion vor, um sicherzustellen, dass der Chirurg bezüglich der Art der injizierten Bläschen geblendet ist.

Bestimmen Sie das Volumen der Stammlösung der Blasenlösung, das erforderlich ist, um eine Endkonzentration von 100 Millionen Mikroblasen pro Milliliter in einem Volumen von 400 Mikrolitern zu erzeugen. Aliquotieren Sie das entsprechende Volumen an physiologischer Kochsalzlösung in ein leeres Mikrozentrifugenröhrchen. Nachdem das ausgewählte Mikroblasenfläschchen vorsichtig geschüttelt wurde, ziehen Sie mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer 21-Gauge-Nadel ein überschüssiges Volumen der Lösung auf.

Anschließend spritzen Sie die Mikrobläschen in ein leeres Mikrozentrifugenröhrchen. Danach pipettieren Sie das erforderliche Volumen der Mikrobläschen-Stammlösung und geben Sie zu der Aliquadensalzlösung hinzu. Vorsichtig mit der Pipettenspitze umrühren, um zu mischen.

Verwenden Sie dann eine 21-Gauge-Nadel, um die verdünnte Mikrobläschenlösung in eine saubere Spritze aufzuziehen. Nach dem Entfernen der Nadel sollten Luftblasen aus der Spritze entfernt werden, anschließend werden der Köder und der Schlauch angebracht. Die Lösung langsam bis zum Ende des Schlauchs vorstoßen, wobei darauf geachtet werden muss, keine Luftblasen zu erzeugen.

Schließlich die Spritze in eine Spritzenpumpe einsetzen, die so eingestellt ist, dass sie die Mikrobläschen mit einer Geschwindigkeit von 20 Mikrolitern pro Minute abgibt. Für ein Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern eine gezogene Glasnadel an das Ende der Schlauchleitung anschließen. Die Pumpe nahe an die Injektionsplattform heranbewegen.

Verwenden Sie einen perforierten Löffel, um zufällig ein Embryo aus der gekühlten Mediumschale auszuwählen und zu entnehmen. Legen Sie den Embryo in eine Präparationsschale, die sich auf dem Ultraschallständer unter dem Stereomikroskop befindet. Suchen Sie anschließend die Seite des Embryos, die am wenigsten durchblutet erscheint.

Hier befindet sich ein Bereich mit geringer Durchblutung, der in der Regel angrenzend an den Kopfbereich liegt. Anschließend mit feiner Pinzette gerade genug die Dottersack- und Amnionmembranen schneiden oder einreißen, um das Embryo herausnehmen zu können, jedoch nicht mehr. Danach vorsichtig den Sack vom Embryo lösen.

Danach positionieren Sie das Embryo seitlich mit Plazenta und Nabelgefäßen nach vorne. Stabilisieren Sie die Präparierschale mit kleinen Plastilinstücken, indem Sie die Dotterblase und die Ränder der Plazenta mit vier Insektennadeln fixieren, wobei Sie große Gefäße vermeiden, unter Verwendung einer Spritze, die vorgewärmte Flüssigkeit enthält. 45 Grad Celsius.

Spülen Sie das Embryo mit PBS, bis Blut sichtbar in das Embryo fließt. Die Nabelarterie wird anhand des pulsierenden hellroten Blutes identifiziert. Die Nabelvene und ihr zugehöriges Gefäßnetzwerk weisen dunkleres Blut auf und liegen meist über den Strukturen der Nabelarterie auf der plazentaren Seite.

Bringen Sie die Petrischale an dieser Stelle so in Position, dass die Injektion bequem durchgeführt werden kann. Sobald sich das Embryo erholt hat, decken Sie es ab, nicht jedoch die Plazenta. Mit vorgewärmtem Ultraschallgel entfernen Sie vorsichtig mit feiner Pinzette eventuelle Luftblasen um das Embryo herum und ergänzen während des gesamten Verfahrens die Petrischale mit vorgewärmtem PBS.

Beobachten Sie den Füllstand der Lösung in den PBS- und Gel-Spritzen und ergänzen Sie bei Bedarf weitere Reservespritzen in das Heizbad. Befestigen Sie danach die Glasnadel an einem großen Plastilinball am Rand der Präparierschale und führen Sie das Nadelspitzenende in das PBS ein. Wählen Sie eine Vene an der chorionalen Oberfläche der Plazentasche, die möglichst weit entfernt von der Hauptverzweigung liegt.

Verwenden Sie dann eine Schere, um die Nadelspitze der Größe des Gefäßes anzupassen. Schneiden Sie die Spitze in einem leichten Winkel ab. Entfernen Sie mit der Schneide der Feder-Schere eventuelle gezackte Glasränder.

Jetzt langsam mit der Spritzenpumpe die Mikrobläschenlösung mit 20 Mikrolitern pro Minute in die Glasnadel injizieren, bis die gesamte Luft aus der Nadelspitze verdrängt ist und die Mikrobläschen frei in das PBS fließen können. Stoppen Sie die Pumpe und stellen Sie sie auf ein Injektionsvolumen von 20 Mikrolitern zurück. Vermeiden Sie, dass Luft in die Injektionsnadel gelangt, um eine Injektion von Luft in das Gefäßsystem des Embryos zu verhindern.

Führen Sie die Glasspitze vorsichtig in die ausgewählte Vene der Plazenta ein und stellen Sie sicher, dass sie bewegungslos sitzt. Schwenken Sie den Stereomikroskop-Kopf beiseite und positionieren Sie den Ultraschallwandler so, dass sich der Embryo gleichmäßig zwischen den Brennpunkten bei sechs und zehn Millimetern befindet. Starten Sie anschließend die Bildaufnahme und beginnen Sie nach einer Minute die Bolusinjektion der Mikrobläschen; sobald die Injektion abgeschlossen ist, starten Sie die Zeiterfassung für den Datenerfassungsschritt.

Dieses B-Modus-Ultraschallbild zeigt ein ausgelagertes Embryo im Stadium E 17,5 unmittelbar vor der Injektion gezielter Mikrobläschen. Dieses nichtlineare Kontrast-Ultraschallbild zeigt den Embryo vor der Injektion der Mikrobläschen, wobei nur stark reflektierende Grenzflächen wie Knochen sichtbar sind, während das Signal aus dem Weichgewebe minimal ist. Die Injektion der Mikrobläschen verbessert den Kontrast im gesamten Organismus, einschließlich Vena cava inferior, Herz und Gehirn.

Ein Intensitätsverlauf von Mikrobläschen als Funktion der Zeit innerhalb einer einzelnen interessierenden Region im embryonalen Gehirn ermöglicht die Bestimmung verschiedener Perfusionsparameter, einschließlich der Peak-Enhancement- oder PE-Wash-in-Rate, angegeben durch die Steigung, sowie der Zeit bis zum Peak oder TTP. Die durchschnittlichen Kontrastmittel-Mittelwert-Leistungsverhältnisse von Endoglin-gezielten Mikrobläschen waren signifikant höher als diejenigen, die für Kontrollen mit nicht gezielten Mikrobläschen erfasst wurden. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Bindung von Endoglin-gezielten Mikrobläschen in ogly plus plus-Embryonen signifikant höher war als in ogly plus minus-Embryonen.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann jedes Embryo in 15 Minuten injiziert und abgebildet werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.