Name: Chitosan / interfering RNA Nanopartikel vermittelten Gen-Stummschaltung in Disease Vector Mückenlarven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von Chitosan/Interfering-RNA-Nanopartikeln zur Gen-Stummschaltung in Mückenlarven. Diese Methode ermöglicht funktionsverlustbedingte Phänotypanalysen in Krankheitsvektoren.

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Die Finanzierung durch die Kansas Agricultural Experiment Station und das K-State Arthropod Genomics Center an KYZ unterstützte die ursprüngliche Entwicklung von Chitosan/dsRNA-vermitteltem Gen-Silencing in A. gambiae19. Die hier beschriebene Arbeit an A. gambiae wurde teilweise durch R01-AI095842 von NIH/NIAID an KM unterstützt. Die Entwicklung von Chitosan/siRNA-vermitteltem Gen-Silencing in A. aegypti20,21 wurde durch den NIH/NIAID Award R01-AI081795 für MDS unterstützt. Der Inhalt dieser Studie liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der NIH wieder.

1. Mückenarten und Aufzucht <ol><li> Pflegen A. gambiae G3 und A. aegypti Liverpool IB12 Stämme (in den repräsentativen Studien unten verwendet) oder andere Stämme von Interesse nach Standardlaborpraxis oder wie zuvor beschrieben 23,24. </li></ol> 2. dsRNA und siRNA-Design und Produktion <ol><li> Design Primer an die dsRNA spezifisch für das Gen von Interesse Vorlagen zu konstruieren. Verwenden Sie die E-RNAi-Tool 25. Produzieren dsRNA gemß der Methode der Wahl oder, wie zuvor beschrieben 19. <ol><li> Für eine negative Kontrolle, synthetisieren dsRNA 19 entsprechend der Sequenz des grün fluoreszierenden Proteins (GFP), β-Galactosidase (β-gal) oder ein anderes Gen nicht in Moskitos ausgedrückt. Falls gewünscht, kann dsRNA dazu verwendet, die unten zusammengefaßt sind repräsentative Ergebnisse erzeugen 19 als eine positive Kontrolle verwendet werden. Shop dsRNA in RNase-freiem Wasser gelöst bei -80 °; C, bis sie benötigt. </li></ol></li><li> Alternativ Design-Gen-spezifische siRNA nach Standardlaborpraxis oder wie zuvor 10 beschrieben. Verwürfeln die Sequenz eines Zuschlags siRNA negative Kontroll-siRNA, die keinem Moskito Gen nicht entspricht entwerfen. Kaufen Sie die kundenspezifischen siRNAs, die durch eine Reihe von seriösen Anbietern zur Verfügung stehen. <ol><li> Falls gewünscht, können siRNAs verwendet, die im Folgenden zusammengefasst sind repräsentative Ergebnisse erhalten 20,21 als positive Kontrollen verwendet werden. Shop siRNA in RNase-freiem Wasser gelöst bei -80 ° C, bis sie benötigt. </li></ol></li></ol> 3. Vorbereitung Chitosan / interfering RNA Nanopartikel <ol><li> Sammeln vorgefertigten RT 100 mM Natriumsulfat (100 mM Na 2 SO 4 in deionisiertem H 2 O) und 0,1 M Natriumacetat (0,1M NaC 2 H 3 O 2 -0.1 M Essigsäure, pH 4,5, in entionisiertem H 2 O) Puffer. </li><li> Auflösen von Chitosan (≥75%deacetylierten) in 0,1 M Natriumacetat-Puffer auf 0,02% (w / v) Arbeitslösung und Halten der Lösung bei RT vor der Verwendung. </li><li> Löse dsRNA oder siRNA in 50 ul entionisiertem H 2 O und sie dem 100 mM Natriumsulfat-Puffer zu einer 100 ul Lösung von 32 ug dsRNA / siRNA pro 100 ul 50 mM Natriumsulfat bilden. </li><li> 100 l Chitosanlösung zur dsRNA / siRNA-Lösung und dann das Gemisch in einem Wasserbad bei 55 ° C für 1 min. Eine Steuer durch Zugabe von 100 ul 50 mM Natriumsulfat zu 100 ul Chitosan-Lösung zu stellen und die gleiche Vorgehensweise. </li><li> Mischen der Lösungen sofort für 30 sec mittels Hochgeschwindigkeits Verwirbeln bei RT, um die Bildung von Nanopartikeln zu erleichtern. </li><li> Zentrifugiere das Gemisch bei 13.000 × g für 10 min bei RT, nach welcher Zeit sich ein Pellet sichtbar sein soll. Den Überstand in ein neues 1,5-ml-Tube. Der Luft trocknen das Pellet für ≈10 Minuten bei Raumtemperatur, bevor Sie es an Moskito Essen zuzubereiten. </li><li> Measure die Konzentration von dsRNA / siRNA im Überstand unter Verwendung des Überstands von der Steuerung (siehe 3.5) als leer, um die Gesamtmenge an dsRNA / siRNA, die im Überstand blieb berechnen. Verwenden der Differenz zwischen den Ausgangsmengen an dsRNA / siRNA und in den Überständen verbleibende, den Prozentsatz der dsRNA / siRNA in Nanopartikel eingeschlossen berechnen Mengen. Dieser Ladeeffizienz ist in der Regel über 90%. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang, wenn mehr Nanopartikel benötigt werden. Verwenden Sie die getrockneten Nanopartikel sofort. Der Einfluss der Kühllagerung der Teilchen vor der Verwendung wurde nicht untersucht. </li></ol> 4. Vorbereitung Mosquito Lebensmittel enthalten Chitosan / interfering RNA Nanopartikel <ol><li> Herstellung von 1 ml einer 2% igen Lösung (w / v) in entionisiertem Wasser, schmelzen die Agarose und Halten geschmolzenen Agarose-Lösung in einem 55 C-Wasserbad vor dem Gebrauch. </li><li> Mix Fischfutter Flocken (47% Rohprotein, min. Rohfett 10%, max. Rohfaser 3%) und Trockenhefe in eineVerhältnis von 2: 1 (w / w). Schleifen Sie die Mischung, um kleine Partikel mit einem Mörser und Stößel (passable bis Nr 50 USA Standard-Test-Sieb). Verwenden Sie die Grundnahrung, die bräunlich gefärbt sein sollte, entweder sofort oder lagern Sie es in einem verschlossenen Behälter bei 4 ° C für mehrere Wochen. </li><li> In einer 1,5-ml-Tube, mischen 6 mg Boden Nahrung mit den getrockneten Nanopartikel aus Abschnitt 3.7 mit einem Zahnstocher. </li><li> Zugabe von 30 ul 2% vorge geschmolzener Agarose-Gel-Lösung auf die Lebensmittelnanopartikelmischung; sofort und gründlich zu rühren, indem Sie einen Zahnstocher oder Pipettenspitze. </li><li> Verwenden Sie das Gel Essen und Nanopartikel enthalten, um die Mückenlarven sofort füttern. Alternativ, wenn das Gel vollständig bei RT erstarrte, speichern das Gel bei 4 ° C lagern und am nächsten Tag oder bei -80 ° C für die spätere Verwendung. </li></ol> 5. Ernährung Mückenlarven mit Lebensmittel, die Chitosan / interfering RNA Nanopartikel <ol><li> Feeding A. gambiae Mückenlarven: <ol><li> Entfernen eines single Gel-Pellet aus der 1,5-ml-Röhrchen mit einem Zahnstocher und schneiden Sie es in 6 gleiche Scheiben mit einem sauberen Rasierklinge oder Zahnstocher. </li><li> Übertragungs 20 dritte Larvenstadium in einen 500 ml Petrischale mit 100 ml entionisiertem Wasser. </li><li> Führen Sie das Mückenlarven, indem eine Scheibe des Gels Pellet (fein in kleine Stücke gehackt) pro Petrischale einmal täglich für vier Tage. Achten Sie darauf, Larven auf dem Pellet, die in der Größe deutlich reduziert werden sollte oder am nächsten Tag völlig abwesend zu beobachten. Nach der Zeit wird Mücken in späten vierten Larvenstadium entwickeln. </li><li> Notieren Sie alle sichtbaren phänotypischen Veränderungen während des Experiments. Untersuchen Sie die Transkriptionsniveaus und andere phänotypische Veränderungen, wie in Abschnitt 6 am Ende der viertägigen Zeitraum diskutiert. </li></ol></li><li> Feeding A. aegypti Mückenlarven: <ol><li> Schneiden Sie die Gel-Pellet in 6 gleiche Scheiben mit einem sauberen Rasierklinge oder Zahnstocher. </li><li> Zeigen 50 alters synchronisiert 24 Stunden nach dem Schlüpfen Ei fierste Larvenstadium in eine Petrischale in ≈40 ml entionisiertem Wasser. </li><li> Feed-Larven eine Scheibe pro Petrischale 4 Stunden / Tag, dann Transfer Larven zurück zu den regelmäßigen Larven Ernährung von 2: 1 Bodenfischfutter Flocken und Trockenhefe für den Rest des Tages. Wiederholen Sie den Vorgang täglich während der vier Larvenstadien. </li><li> Untersuchen Sie die Transkriptionsniveaus und andere phänotypische Veränderungen, wie in Abschnitt 6 an den gewünschten Entwicklungszeitpunkten diskutiert. </li></ol></li></ol> 6. Bestätigung der Gene Knockdown <ol><li> Relative Transkript Quantifizierung durch qRT-PCR in A. aegypti und A. gambiae Larven. <ol><li> Führen und qRT-PCR-Assays zu analysieren mit drei biologischen Replikaten auf mindestens 10 gepoolten Kontroll vs. experimentelle Larven, wie beschrieben, 11,19,20, oder nach Standard-Laborverfahren. Repräsentative Ergebnisse sind unten aufgeführt. </li><li> Für die Analyse eines bestimmten Gewebetyp / Körperteil (dh., Gehirn oder Antenne), perform qRT-PCR, wie in 6.1.1 folgende Präparation beschrieben, um das Gewebe von Interesse zu erholen (siehe zB Mysore et al. 21). </li></ol></li><li> Bestätigung der Zuschlags durch in situ Hybridisierung <ol><li> Synthetisieren Digoxygenin-markierte Antisense-und Sense-Steuer Ribosonden nach Standardlaborpraxis oder wie beschrieben 26. </li><li> Ausführen der in situ Hybridisierung gemäß dem Haugen et al. 27 Protokoll zur Bestätigung der Zuschlags wie zuvor 11,20 beschriebene und in der repräsentative Ergebnisse weiter unten diskutiert. </li></ol></li><li> Bestätigung der Zuschlags immunhistochemisch <ol><li> Wenn Antikörper gegen das Proteinprodukt des Gens gezielt zur Verfügung stehen, ausführen Immunhistochemie wie zuvor beschrieben 28, die Identifizierung von Individuen mit den höchsten Niveaus der Zuschlags für Phänotypanalyse 20 erleichtert, wie in der Vertre exemplifiziertve Ergebnisse unten. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das Chitosan / interfering RNA Nanopartikel hierin beschriebenen Methodik wurde verwendet, um Gene während Larvenentwicklung in A. zielgerichteter gambiae (2, 3) und A. aegypti (Figuren 4, 5, 6, Tabelle 1, 2). Chitosan-Nanopartikeln kann entweder mit langen dsRNA oder siRNA, die beide erfolgreich in Moskitos verwendet worden, wie durch die hierin beschriebenen repräsentativen Ergebnisse zeigten weiterhin hergestellt werden. Synthese der dsRNA ist weniger teuer...

Blut-Fütterung Trägermücken der Anopheles und Aedine Gattungen übertragen Krankheitserreger für einige der schlimmsten Geißeln der Menschheit verantwortlich. Schätzungsweise 3,4 Milliarden Menschen mit einem Risiko für Malaria zu erkranken, die für mehr als eine halbe Million Todesfälle pro Jahr weltweit verantwortlich ist. Malaria Ergebnisse vor einer Infektion durch Plasmodium sp. Parasiten, die den Menschen durch den Stich infizierter Mücken auf der Gattung Anopheles, einschließlich der Hauptnischen Vektor Anopheles gambiae (übertragen werden <a href="http://www.who.int/topics/malaria/en/">http://www.who.int/topics/malaria/en/</a> , 2014) 1. Aedes aegypti ist die primäre Trägermücke für Dengue-Virus, die Dengue-Fieber, eine unspezifische fieberhafte Erkrankung, die die am weitesten verbreitete und wichtige arboviral Krankheit in der Welt ist, verursacht. Dengue-Virus ist derzeit eine Bedrohung für&gt; 2,5 Milliarden Menschen in den Tropen, mit einer jährlichen incidence von rund 50 Millionen Fällen zu ~ 24.000 Todesfälle pro Jahr ( <a href="http://www.cdc.gov/dengue/">http://www.cdc.gov/dengue/</a> , 2014) 2. Trotz der dramatischen weltweiten Auswirkungen der Moskitos übertragene Krankheiten auf die menschliche Gesundheit sind effiziente Mittel zur Prävention und Behandlung dieser Krankheiten fehlt. Moskito-Kontrolle ist derzeit die beste Methode zur Verhütung von Krankheiten. Das Potenzial für die Steuerung von Arthropoden übertragene Krankheiten, die durch die genetische Manipulation von Wirtsinsekten ist seit mehr als vier Jahrzehnten 3 anerkannt worden. Transgene Stämme von A. aegypti entwickelt, um eine reprimierbaren frauenspezifische flug Phänotyp haben in jüngster Zeit, das Potenzial für den Einsatz von transgenen Kontrollstrategien zu verwirklichen 4-6. Diese Fortschritte haben die Forscher herausgefordert, neue genetische Ziele für Vektorregelung und zusätzliche Mittel zum Manipulieren der Genfunktion in Überträgermücken zu identifizieren. Eine Veränderung der Genexpression dährend Entwicklung, wie in weiblich-flug Mücken 4 der Fall war, kann die Aufklärung von neuen Kontrollstrategien zu fördern. Jedoch hauptsächlich auf technische Herausforderungen, die Funktionen der wenigen Genen während der Entwicklung A. gekennzeichnet gambiae, A. aegypti oder andere Mückenarten. Seit ihrer Entdeckung in C. elegans 7, RNA-Interferenz (RNAi), die in Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen konserviert ist, wurde umfassend für funktionelle genetische Untersuchungen in einer Vielzahl von Organismen, einschließlich Insekten 8,9 verwendet. Die RNAi wird von Dicer, das spaltet lange dsRNA in kurze 20-25 Nukleotide langen siRNAs, die als sequenzspezifische interfering RNA funktionieren begonnen. siRNAs Stille Gene, die in der Sequenz komplementär sind durch die Förderung Transkript Umsatz, Spaltung, und die Störung der Übersetzung 9. Lange dsRNA-Moleküle (in der Regel 300 bis 600 bp) oder kundenspezifischen siRNAs eine particular Sequenz kann im Forschungslabor zur Dämpfung jedes Gen von Interesse verwendet werden. Durch die Verwaltung, wenn interfering RNA geliefert wird, können die Forscher die Zeit zu steuern, mit der Gen-Silencing-Eingeweihten. Dieser Vorteil ist nützlich, da es verwendet werden, um Herausforderungen wie die Entwicklung Letalität oder Sterilität, die die Produktion und Wartung von Stämmen Lager vererbbare Mutationen, eine kostspielige und arbeitsintensiver Prozess, der nicht in allen Insektenarten ist noch behindern überwunden werden können. Obwohl der Grad der Gen-Silencing durch RNAi von Gen zu Gen, Gewebe zu Gewebe und Tier zu Tier variieren, wird RNAi weithin für die funktionelle Analyse von Genen in Moskitos und andere Insekten 8,9 verwendet. Drei interfering RNA Lieferstrategien in Mücken verwendet: Mikroinjektion, Einweichen / topische Anwendung und Einnahme. Für eine detaillierte Geschichte und ein Vergleich der Verwendung dieser drei Techniken in Insekten, wenden Sie sich bitte an Yu et al 8 beziehen. WE erfolgreich als Mittel zur Bereitstellung von siRNAs verwendet Mikroinjektion von 10 bis Entwicklungsgenen in A. Ziel aegypti Embryos, Larven und Puppen 11-14. Diese arbeitsintensive Lieferstrategie erfordert jedoch sowohl eine Mikroinjektion Einrichtung und eine geschickte Hand. Darüber hinaus ist die Mikroinjektion stressig für den Organismus, ein Störfaktor, vor allem wenn Verhaltensphänotypen bewertet werden. Schließlich können die Mikroinjektion Lieferung nicht auf den Bereich für die Vektorregelung verlängert werden. Alternativ Einweichen der Organismus in interfering RNA-Lösung hat sich auch ein beliebtes Mittel zur Induktion Gen-Silencing, wie es bequem und erfordert wenig Ausrüstung oder die Arbeitskräfte. Einweichen wurde hauptsächlich in Insektenzelllinie angewendet wurde studiert 8, jedoch in einer neuen Studie wurde Zuschlag in A. erreicht aegypti Larven in einer Lösung von dsRNA 15, die die Tiere zu sein schien Einnahme eingetaucht. Für Studien, die Analyse von mehreren experimental Gruppen oder Phänotypen ist Einweichen ziemlich teuer. Lopez-Martinez et al. 16 beschrieben Rehydrierung angetrieben RNAi, einen neuen Ansatz für interfering RNA Lieferung, die Dehydratisierung in Kochsalzlösung und Rehydrierung beinhaltet mit einem einzigen Tropfen Wasser enthält interfering RNA. Dieser Ansatz bedeutet Senkung der Kosten mit ganzen Tiereint assoziiert, aber teurer ist als die Mikroinjektion und in ihrer Anwendung nicht auf Spezies, die eine hohe osmotische Druck tolerieren kann begrenzt werden. Darüber hinaus ist es schwierig, sich vorzustellen, wie Tauchen oder Dehydratation / Rehydratation Tauch Methode könnte zur Vektor-Kontrolle im Bereich angepasst werden. Aus diesen Gründen ist für die post-embryonale Studien, ist die Lieferung von interfering RNA mit aufgenommenen Nahrung eine Alternative Strategie. Obwohl Einnahme basierte Strategien müssen nicht in allen Insektenarten, vor allem wohl Drosophila melanogaster ist orale Verabreichung von interfering RNA mit der Nahrung vermischt Gen si gefördertlencing in eine Vielzahl von Insekten 8,17, einschließlich A. aegypti Erwachsene 18. Wir beschriebenen Chitosan-Nanopartikel vermittelten RNAi in A. gambiae Larven 19 und haben diesen Ansatz zur Reduktion der Genexpression in A. erfolgreich angewendet aegypti Larven 20,21. Hier Methodik für diese RNAi Verfahren, das Einschließen von interfering RNA durch das Polymer Chitosan umfasst, ist detailliert. Chitosan / interfering RNA Nanopartikel durch Selbstorganisation von Polykationen mit interferierenden RNA durch die elektrostatischen Kräfte zwischen den positiven Ladungen der Aminogruppen in Chitosan und negativen Ladungen von den Phosphatgruppen auf der Hauptkette des interferierenden RNA 19 durch gebildet. Das beschriebene Verfahren ist sowohl mit langen dsRNA-Moleküle (im folgenden als dsRNA bezeichnet) oder doppelsträngigen siRNA (nachstehend als siRNA bezeichnet) kompatibel. Nach der Synthese Chitosan / interfering RNA Nanopartikel mit Futtersaft gemischt und geliefertLarven bei Einnahme. Diese Methode ist relativ kostengünstig, erfordert wenig Ausrüstung und Arbeits 19 und ermöglicht Hochdurchsatz-Analyse von mehreren Phänotypen, einschließlich der Analyse der Verhaltensweisen 20,21. Diese Methodik, die für die Gen-Silencing-Studien in anderen Insekten, einschließlich anderer Krankheitsvektoren und Insekten landwirtschaftlichen Schädlingen angepasst werden kann, könnte möglicherweise für das Gen-Silencing in einer Vielzahl von anderen Tierspezies verwendet werden. Außerdem könnte Chitosan, ein kostengünstiges, nicht-toxische und biologisch abbaubares Polymer 22, möglicherweise in dem Feld für artspezifischen Moskitobekämpfung genutzt werden.

<table><tbody><tr><td>0,02 ml Pipettierer</td><td>Rainin</td><td>PR20</td><td>zur Resuspension von interferierender RNA</td></tr><tr><td>0,2 ml Pipettierer</td><td>Rainin</td><td>PR200</td><td>zur Resuspension von interferierender RNA und Herstellung von interferierender RNA/Nanopartikel</td></tr><tr><td>0,5 ml Messröhrchen&nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>05-408-120</td><td>zur Aliquotierung resuspendierter interferierender RNA</td></tr><tr><td>1 ml Pipettierer</td><td></td><td>Rainin PR1000</td><td>zur Resuspension von interferierender RNA und Herstellung von interferierender RNA/Nanopartikel</td></tr><tr><td>1,5 ml Messröhrchen&nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>05-408-046</td><td>zur Herstellung von interferierenden RNA/Nanopartikeln</td></tr><tr><td>1M Natriumacetat, pH 4,5</td><td>TEKnova</td><td>S0299</td><td>zur Herstellung von Natriumacetatpuffer</td></tr><tr><td>Essigsäure, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade</td><td>BDH</td><td>VWR BDH3092-500MLP</td><td>zur Herstellung von Natriumacetat-Puffer</td></tr><tr><td>Agarose Genetic Technology</td><td>Grade MP Biomedicals LLC.</td><td>800668</td><td>zur Beschichtung von präparierten interferierenden RNA/Nanopartikeln</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf AG</td><td>5415D</td><td>zur Pelletierung von interferierender RNA/Nanopartikel</td></tr><tr><td>Chitosan, aus Garnelenschalen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3646-25G</td><td>zur Kombination mit interferierender RNA zur Präparation von interferierenden RNA/Nanopartikeln</td></tr><tr><td>Trockenhefe</td><td>Universal Food Corp</td><td>NA</td><td>zur Zubereitung von Mückenlarvenfutter mit interferierender RNA/ Nanopartikel</td></tr><tr><td>E-RNAi-Tool</td><td>Deutsches Krebsforschungszentrum</td><td>NA</td><td>für das Design von dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//</td></tr> <tr><td>Goldfischfutter</td><td>Wardley</td><td>Goldfish FLAKE FOOD</td><td>zur Zubereitung von Mückenlarvenfutter mit störender RNA/Nanopartikeln</td></tr><tr><td>Beheiztes Wasserbad</td><td>Thermo Scientific</td><td>51221048</td><td>zur Erwärmung der interferierenden RNA>o</C</td></tr><tr><td>Eis</td><td>nicht anwendbar</td><td>nicht anwendbar</td><td>nicht anwendbar zum Auftauen von interferierender RNA und Herstellung von interferierender RNA/Nanopartikeln</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Eiskübel</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-591-44</td><td>zur Lagerung von Eis, das während des Eingriffs verwendet wird</td></tr><tr><td>Leberpulver</td><td>MP Biomedicals LLC.</td><td>900396</td><td>zur Fütterung von Mückenlarven nach der interferierenden RNA/Nanopartikel-Behandlung</td></tr><tr><td>Mikrowellenherd</td><td>Eine Vielzahl von Anbietern</td><td>nicht geeignet</td><td>für die Herstellung von 2%iger Agaroselösung</td></tr><tr><td>Petridisch (100 x 15 mm)</td><td>Fischer Scientific</td><td>875713</td><td>interferierende RNA/Nanopartikel-Fütterungskammer für Larven pH-Messgerät</td></tr><tr><td></td><td>Mettler Toledo</td><td>S220</td><td>zur Herstellung von Puffern</td></tr><tr><td>Rasierklinge</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-640</td><td>zur Teilung des interferierenden RNA/Nanopartikel-Pellets für die Fütterung</td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Thermo Scientific/Dharmacon</td><td>custom</td><td>zur Herstellung von siRNA/Nanopartikeln</td></tr><tr><td>Natriumsulfat, wasserfrei (Na2SO4)</td><td>BDH/vertrieben von VWR</td><td>VWR BDH0302-500G</td><td>zur Herstellung von 50 mM Natriumsulfatlösung, in der die interferierende RNA resuspendiertes</td></tr><tr><td>Thermometer</td><td>VWR</td><td>61066-046</td><td>zur Messung der Wasserbadtemperatur</td></tr><tr><td>Zahnstocher</td><td>VWR</td><td>470146-908</td><td>zum Rühren während der interferierenden RNA/Nanopartikel-Lebensmittelzubereitung und beim Schneiden von Gelpellets</td></tr><tr><td>Ultratiefkühlschrank</td><td>Eine Vielzahl von Anbietern</td><td>nicht geeignet</td><td>für die Lagerung von interferierenden RNA-Aliquoten und interferierenden RNAs/Nanopartikeln bei -80oC</td></tr><tr><td>Vortex-Mischer</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-216-108</td><td>zur Aufbereitung von Chitosan/interferierender RNA</td></tr><tr><td>Gewichtpapier</td><td>Fischer Scientific</td><td>NC9798735</td><td>zur Teilung des interferierenden RNA/Nanopartikel-Pellets für die Fütterung</td></tr></tbody></table>

chitosan / interfering rna nanopartikel vermittelten gen-stummschaltung in disease vector mückenlarven

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Vektor-Mücken verursachen mehr menschliches Leid als jeder andere Organismus - und tötet mehr als eine Million Menschen pro Jahr. Die Moskitogenomprojekten erleichtert die Forschung in neue Facetten Moskito Biologie, einschließlich funktionale genetische Studien in der Primär afrikanischen Malariavektor Anopheles gambiae und dem Dengue-Fieber und Gelbfieber-Vektor Aedes aegypti. RNA Interferenz- (RNAi-) vermittelte Gen-Silencing ist verwendet worden, um Gene von Interesse in beiden dieser Krankheitsvektor Mückenarten zielen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung von Chitosan / interferierenden RNA-Nanopartikel, die mit Lebensmitteln kombiniert und durch Larven aufgenommen. Diese technisch einfach, mit hohem Durchsatz und relativ kostengünstige Methode, die mit langen doppelsträngigen RNA (dsRNA) oder kleine interferierende RNA (siRNA) Moleküle kompatibel ist, ist für die erfolgreiche Knockdown von einer Anzahl von verschiedenen Genen in A. verwendet gambiae und A. aegyptiLarven. Nach Larvenernährung, Knockdown, die durch qRT-PCR und in situ Hybridisierung überprüft wird, kann zumindest durch die späten Puppenstadium fortbestehen. Diese Methode kann für eine Vielzahl von vor allem Insektenarten, darunter landwirtschaftliche Schädlinge sowie andere nicht-Modellorganismen sein. Zusätzlich zu ihrer Nützlichkeit im Forschungslabor, in der Zukunft, Chitosan, einem kostengünstigen, nicht-toxischen und biologisch abbaubaren Polymer, könnte möglicherweise in dem Gebiet verwendet werden.

<html> A. gambiae: Chitosan / dsRNA Nanopartikel aufgrund der elektrostatischen Wechselwirkung zwischen den Aminogruppen des Chitosans und der Phosphatgruppen des dsRNA gebildet. Die Effizienz der dsRNA Einbau in Nanopartikel der Regel über 90%, wie durch Abreicherung von dsRNA aus der Lösung gemessen. Rasterkraftmikroskopische Aufnahmen zeigen, dass Chitosan-dsRNA Partikelgröße im Durchschnitt 140 nm im Durchmesser reichen von 100 bis 200 nm (Abbildung 1).</...

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Hemmung der Genfunktion in Krankheitsvektor Mücken durch die Verwendung von Chitosan / interferierenden RNA-Nanopartikel, die durch Larven aufgenommen werden.

Chitosan / interfering RNA Nanopartikel vermittelten Gen-Stummschaltung in Disease Vector Mückenlarven

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Tussin-Interferenz-RNA-Nanopartikel für Gen-Silencing-Studien an Moskito-Larven zu entwickeln und anzuwenden. Dies wird erreicht, indem zunächst Tussin-Interferenz-RNA-Nanopartikel durch die Kombination von Chitin und interferierender RNA hergestellt werden, gefolgt von Erhitzen, Vortexen und Zentrifugation. Das nächste Ziel ist es, die Nanopartikel mit Larvenfutter und Aros zu vermischen, um Gel-Pellets herzustellen, die sowohl Futter als auch Nanopartikel enthalten.Das nanopartikuläre Futter wird den Mückenlarven verabreicht, und das Fressverhalten der Larven an dem Pellet wird beobachtet, gefolgt von der Bestätigung der Genstilllegung mittels quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion oder in Hefe-Zwei-Hybrid-Assays. Funktionsverlust-Phänotypen können untersucht werden.Mit dieser Methode können zentrale Fragen im Bereich der Forschung an Vektor-Mücken beantwortet werden. Beispielsweise haben wir sie genutzt, um die Funktionen von Genen während der Entwicklung des Geruchssystems, des Gehirns, des Mitteldarms und anderer für Vektoren wichtiger Gewebe zu untersuchen. Die Hauptvorteile dieser Technik liegen in ihrer hohen

chitosaninterfering-rna-nanoparticle-mediated-gene-silencing-disease

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Reverse-genetische Ansätze haben sich als äußerst nützlich für die Bestimmung, welche Gene zugrunde liegenden Widerstand gegen Vektor Krankheitserreger in Mücken. Dieses Video-Protokoll stellt ein Verfahren durch die Dimopoulos Labor verwendet werden, um dsRNA in Anopheles gambiae Mücken, die den Malaria-Parasiten Hafen zu injizieren. Die Technik die Manipulation der Injektion Setup und Injizieren dsRNA in den Brustkorb dargestellt.

Protokoll für die RNAi-Assays in Adult Moskitos (A. gambiae)

In diesem Protokoll kombinieren wir RNAi-vermittelte Gen-Silencing mit...

RNAi-vermittelte Gen-Knockdown und<em&gt; In Vivo</em&gt; Diurese Assay in Adult Female<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Moskitos

RNA-Interferenz (RNAi) ist ein äußerst wertvolles Werkzeug zur Aufdeckung der Genfunktion. Die Fähigkeit, Gene mit RNAi im präadulten Stadium anzugreifen, ist jedoch bei dem wichtigsten menschlichen Malariavektor Anopheles gambiae begrenzt. Wir beschreiben ein RNAi-Protokoll zur Verringerung der Genfunktion durch direkte Injektion während der Puppenentwicklung.

RNAi-Trigger Lieferung in<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Pupae

Wir berichten mit einer künstlichen intronischen kleine RNA Ausdruck Strategie, um eine mangelfreie rekombinante Aedes Aegypti Densovirus (AaeDV) in Vivo -Delivery-System zu entwickeln. Eine detaillierte Anleitung für den Bau, die Verpackung und die Quantitative Analyse der rAaeDV Vektoren sowie für Larven Infektion wird beschrieben.

Verwendung von einem rekombinanten Moskito Densovirus als gen Lieferung Vektor für die funktionelle Analyse von Genen in Mückenlarven

Diese Handschrift zeigt die Erschöpfung der Gen-Expression in den Mitteldarm der deutschen Schabe durch orale Einnahme von doppelsträngige RNA in Liposomen verkapselt.

Praktische Anwendung der RNA-Interferenz: mündliche Lieferung von Double-Stranded RNA in Liposomen Träger für Schaben

Dieser Artikel beschreibt neuartige Techniken für mündliche Lieferung doppelsträngige RNA (DsRNA) durch die Leitbündel Gewebe von Pflanzen für die RNA-Interferenz (RNAi) im Phloem Sap Futterinsekten entwickelt.

Double-Stranded RNA Oral Liefermethoden induzieren RNA-Interferenz im Phloem und Pflanze-Sap-Fütterung Hemipteran Insekten

Dieses Protokoll beschreibt eine Mikroinjektion Methodik, die wir standardisiert und für mehrere Jahre verwendet, um bestimmte Mengen von Nukleinsäuren liefern direkt an die Hämolymphe von Mücken und Stubenfliegen. Dieses Protokoll führt zu minimalen Injektion Sterblichkeit und ermöglicht Dosismessungen korreliert der Fruchtbarkeit.

Reproduzierbare DsRNA Mikroinjektion und Eiablage Bioassay in Mücken und Stubenfliegen

Die orale Verabreichung von dsRNA, die von Bakterien produziert wird, eine Verabreichungsmethode für RNA-Interferenz (RNAi), die routinemäßig bei Caenorhabditis elegans angewendet wird, wurde hier erfolgreich auf erwachsene Moskitos angewendet. Unsere Methode ermöglicht robuste Studien zur Umkehrgenetik und übertragungsblockierende Vektorstudien ohne den Einsatz von Injektionen.

Effektive orale RNA-Interferenz (RNAi) Verabreichung an erwachsene Anopheles gambiae-Mücken

Hier wird ein Protokoll für die Verabreichung von Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln in Seidenraupenlarven der Bombyx mori vorgestellt, um Gen-Silencing durch Verschlucken zu induzieren.

Larvale RNA-Interferenz in der Seidenraupe Bombyx mori durch Verabreichung von Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln

Beschreibung eines Virus-induzierte Gen-Silencing (VIGS)-Methode für knock-down der Genexpression...

Virus-induzierten Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana Und Tomaten

Erfahren Sie die Herstellung von Chitosan/Interfering-RNA-Nanopartikeln zur Gen-Stummschaltung in Mückenlarven. Diese Methode ermöglicht funktionsverlustbedingte Phänotypanalysen in Krankheitsvektoren.

Chitosan / interfering RNA Nanopartikel vermittelten Gen-Stummschaltung in Disease Vector Mückenlarven

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