Chitosan / interfering RNA Nanopartikel vermittelten Gen-Stummschaltung in Disease Vector Mückenlarven

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Hemmung der Genfunktion in Krankheitsvektor Mücken durch die Verwendung von Chitosan / interferierenden RNA-Nanopartikel, die durch Larven aufgenommen werden.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Tussin-interferierende RNA-Nanopartikel für Gen-Silencing-Studien und Mückenlarven zu entwickeln und zu verwenden. Dies wird erreicht, indem zunächst Tussin-interferierende RNA-Nanopartikel durch die Kombination von Chitin und interferierender RNA hergestellt werden, gefolgt von Erhitzung, Vortexen und Zentrifugation. Das nächste Ziel ist es, die Nanopartikel mit Larvenfutter und Aros zu mischen, um Lebensmittel und Nanopartikel mit Gelpellets zuzubereiten.

Das Nanopartikelfutter wird an die Mückenlarven verfüttert, und die Larven, die sich von dem Pellet ernähren, werden schließlich nach Überprüfung des Gen-Silencing durch quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion beobachtet. Oder in C zwei Hybridisierungsassays. Funktionsverlust-Phänotypen können untersucht werden.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Vektormückenforschung zu beantworten. Zum Beispiel haben wir es verwendet, um die Funktionen von Genen während der Entwicklung des Geruchssystems, des Mitteldarms des Gehirns und anderer Gewebe von Vektorbedeutung zu untersuchen. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie einen hohen Durchsatz hat, relativ kostengünstig und für den Organismus weniger belastend ist als die Verabreichung von störender RNA durch Mikroinjektion, die ein höheres Maß an Geschicklichkeit erfordert und nicht vor Ort implementiert werden kann.

Zusammen mit der Postdoktorandin Ava Maur wird der Techniker Ping Lee das Verfahren demonstrieren: Beginnen Sie mit dem Auflösen von Tussin in 0,1 molaren Natriumacetatpuffer, um eine 0,02%ige Arbeitslösung herzustellen. Bewahren Sie die Lösung vor Gebrauch bei Raumtemperatur auf. Dann gelöste doppelsträngige RNA oder kleine interferierende RNA, die beide im Folgenden als interferierende RNA bezeichnet werden, in 50 Mikrolitern deionisiertem Wasser.

Stellen Sie eine 100-Mikroliter-Lösung aus 32 Mikrogramm Nukleinsäure pro 100 Mikroliter 50 millimolares Natriumsulfat her. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter Tussinlösung in die interferierende RNA-Lösung. Erhitze die Mischung in einem Wasserbad bei 55 Grad Celsius für eine Minute.

Richten Sie eine Kontrolle ein, indem Sie 100 Mikroliter 50 millimolare Natriumsulfate zu 100 Mikrolitern Tustin-Lösung hinzufügen und nach dem Erhitzen das gleiche Verfahren befolgen. Mischen Sie die Lösungen sofort für 30 Sekunden durch Hochgeschwindigkeits-Vortexen bei Raumtemperatur, um die Bildung von Nanopartikeln zu erleichtern, zentrifugieren Sie die Mischung bei 13.000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur, wonach das App-Pellet sichtbar sein sollte. Übertragen Sie das Supinat auf ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen, trocknen Sie das Pellet etwa 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie es verwenden.

Um Mückenfutter mit Hilfe der UV-Spektren-Photometrie zuzubereiten, messen Sie die Konzentration der interferierenden RNA im SNAT, indem Sie den S-Überstand aus der Kontrolle als Leerzeichen verwenden, um die Gesamtmenge der interferierenden RNA zu berechnen, die im SNAT verbleibt. Verwenden Sie die Differenz zwischen den Anfangsmengen der interferierenden RNA und den in den Überständen verbleibenden Mengen, um den Prozentsatz der interferierenden RNA zu berechnen, die in den Nanopartikeln eingeschlossen ist. Dieser Ladewirkungsgrad liegt normalerweise bei über 90 %Wiederholen Sie den gleichen Vorgang, wenn mehr Nanopartikel benötigt werden.

Verwenden Sie die getrockneten Nanopartikel sofort, da die Auswirkungen der Kühllagerung von Partikeln vor der Verwendung nicht bewertet wurden. Um das Mückenfutter zuerst zu formulieren, bereiten Sie eine 2%ige Agro-Lösung in entionisiertem Wasser vor und schmelzen Sie die Aros. Bewahren Sie die geschmolzene Agrolösung vor Gebrauch in einem 55 Grad Celsius warmen Wasserbad auf.

Als nächstes Fischfutterflocken und Trockenhefe im Verhältnis eins zu zwei mischen. Mahlen Sie die Mischung mit einem Mörser und Stößel in kleine Partikel. Das gemahlene Futter hat eine bräunliche Farbe.

In einer 1,5-Milliliter-Tube mit den trockenen Nanopartikeln mit einem Zahnstocher sechs Milligramm gemahlene Nahrung herstellen. Fügen Sie dann 30 Mikroliter 2%prem geschmolzene Agros-Gellösung zur Lebensmittel-Nanopartikelmischung hinzu. Rühren Sie sofort und gründlich mit einem Zahnstocher oder einer Pipettenspitze um.

Das Gel mit Futter und Nanopartikeln ist nun bereit, um die Mückenlarven zu füttern, um Anomalien Gambi-Mückenlarven zu füttern. Entnehmen Sie mit einem Zahnstocher ein einzelnes Gelkügelchen aus der 1,5-Milliliter-Tube und schneiden Sie es mit einer sauberen Rasierklinge oder einem Zahnstocher in vier gleich große Scheiben. Übertragen Sie dann die 23. Sternlarven in eine Petrischale, die 100 Milliliter entionisiertes Wasser enthält.

Füttern Sie die Mückenlarven, indem Sie eine Scheibe des Gel-Pellets hinzufügen. Zum Schluss pro Petrischale in kleine Stücke schneiden. Achten Sie darauf, vier Tage lang einmal täglich zu beobachten, wie sich die Larven von dem Pellet ernähren, das am nächsten Tag nach einiger Zeit deutlich verkleinert oder ganz verschwunden sein sollte.

Mücken entwickeln sich in den Larven zum späten Viertel. Notieren Sie alle sichtbaren phänotypischen Veränderungen während des Experiments. Untersuchen Sie die Transkriptspiegel und andere phänotypische Veränderungen, wie sie im Textprotokoll am Ende des viertägigen Zeitraums zur Fütterung von GTI-Mückenlarven der Achtziger diskutiert werden.

Schneide das Gel-Pellet wie zuvor mit einer sauberen Rasierklinge oder einem Zahnstocher in vier gleich große Scheiben. Dann 50 h synchronisiert 24 Stunden nach dem Schlüpfen der Eier platzieren. Zuerst in Sternlarven in eine Petrischale.

In ca. 40 Millilitern entionisiertem Wasser. Füttern Sie die Larven vier Stunden pro Tag mit einer Scheibe pro Petrischale. Auch hier sollte die Scheibe fein in kleinere Stücke geschnitten werden.

Setzen Sie die Larven dann für den Rest des Tages wieder auf die reguläre Larvennahrung aus zwei zu eins gemahlenen Fischfutterflocken und Trockenhefe um. Wiederholen Sie den Vorgang täglich in den vier Larven. Untersuchen Sie die Transkriptspiegel und andere phänotypische Veränderungen, wie im Textprotokoll beschrieben, zum gewünschten Entwicklungszeitpunkt.

Die hier gezeigten Punkte zeigen eine mit Kontrolle gefütterte Anis-Gambi-Larven des vierten Stadiums, die wie erwartet normal aussehen. Die para-atrophische Matrix ist jedoch in Larven gestört, die mit Chitin-interferierender RNA gefüttert werden, die auf die Chitinsynthase eins abzielt, wie durch Dextrinblau bewiesen wird, das in die normale Expression des Magen-C-Schlüssels von Orco eingedrungen ist. Der obligate Odorierkorezeptor wird in den Antennen von Kontrolllarven beobachtet, die mit Aegypti-Larven im vierten Stadium der achtziger Jahre gefüttert wurden.

Im Gegensatz dazu fehlt die Orco-Expression bei Tieren, die mit Tussin-interferierender RNA gefüttert wurden, die auf das zielstrebige Gen abzielt, im Vergleich zu Kontrolltieren. Zielstrebige Knockdown-Tiere haben ein fehlerhaftes Odorant-Tracking-Verhalten. Nach dem Ansehen dieses Videos sollte es ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Keon-störende RNA-Nanopartikel verwendet, um Gene während der Entwicklung von Vektormücken zum Schweigen zu bringen.

Diese Technik, die möglicherweise auf die Untersuchung adulter Mücken oder anderer aufstrebender Modellorganismen ausgeweitet werden könnte, hat den Forschern den Weg geebnet, die Funktionen von Genen zu erforschen, die in Krankheitsüberträger- und Mückengenomprojekten identifiziert wurden.