Name: Ein Protokoll für Lentivirale Transduktion und Downstream-Analyse der Darm Organoide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Lernen Sie die lentivirale Transduktion von Darmorganoiden zur genetischen Modifikation primärer intestinaler Epithelien. Diese Methode ermöglicht stabile Transduktion für zuverlässige in-vitro-Studien der Darmbiologie.

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J. Heijmans wird durch ein Stipendium der Niederländischen Krebsstiftung (KfW) unterstützt. G.R. van den Brink wird durch eine Förderung des Europäischen Forschungsrats im Rahmen des Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Gemeinschaft (FP7/2007-2013)/des Europäischen Forschungsrats mit der Fördervereinbarung Nummer 241344 und durch ein VIDI-Stipendium der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (GvdB) unterstützt.

1. Herstellung von Polyethylenimin (PEI) als Transfektionsreagenz <ol><li> Man löst etwa 150 mg von PEI in 100 ml H 2 O. </li><li> Einstellen auf pH 7,4 durch Zugabe von HCl, bis die Lösung klar wird und rühre bis zur vollständigen Auflösung. Dieser kann zwischen 10 und 60 Minuten dauern und Wasser bis zu einer Endkonzentration von 1 mg / ml. </li><li> Wenn klar ist, filtern das PEI-Lösung durch ein steriles 0,22 um Filter und Speicher in einem -80 ° C Gefrierschrank in Aliquots von 5 ml. </li></ol> 2. Herstellung von Lentivirale Partikel Tag 1: <ol><li> Split HEK293T-Zellen zu 60% bis 80% Konfluenz in 162 cm 2 -Kolben oder große Petrischale in Zellinie Kulturmedium (DMEM mit 10% FCS, 1% Penicillin / Streptomycin und 2 mM Glutamin ergänzt Ergänzung). </li></ol> Tag 2: <ol start="2"><li> Bereiten DNA Transfektion Lösung mit 45 ug Gesamt-Plasmid-DNA durch Additionlentiviralen Verpackungsvektoren (7 ug pVSVg; 5 ug pRSV rev; 13 ug pMDL) und 20 ug lentiviralen Plasmid, der das Gen von Interesse oder shRNA von Interesse kodiert. Einzustellen, um ein Volumen von 1 ml mit DMEM. </li><li> Bereiten PEI Transfektion Lösung durch Zugabe von 90 ul 1 mg / ml PEI 930 ul DMEM und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> In DNA-Transfektion Lösung PEI-Lösung. Vortex oder Invertzucker mehrfach und Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur, um DNA-Transfektion Lösung zu erhalten. </li><li> Tropft 2 ml des DNA-Transfektions-Lösung auf die HEK293T Zellen und Inkubation für 4 Stunden in einem befeuchteten Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C. </li><li> Nach 4 Stunden, aktualisieren Sie die Kulturmediums auf PEI zu entfernen. Es ist nicht notwendig, Zellen zu waschen, bevor neues Medium. HINWEIS: PEI ist zytotoxischen und Inkubationszeiten länger als 4 Stunden kann zu Schädigungen der HEK293T-Zellen führen. </li></ol> Tag 4: <ol start="7"><li> Supe ersetzenrnatant mit neuen Kulturmedium. Halten Stand (Virus enthalten); Dies wird in Schritt 2.10 verwendet werden. </li><li> Legen Überstand in 15 ml-Kolben. Um tote Zellen, Zentrifuge für 5 Minuten bei 500 x g zu entfernen. </li><li> Schieben Stand durch ein 0,45 um-Filter unter Verwendung einer großen Spritze 60 ml. Speichern Nacht bei 4 ° C. </li></ol> Tag 5: <ol start="10"><li> Sammeln Sie die zweite Charge von Überstand; Zentrifuge und Filter, wie in den Schritten 2,8-2,9. </li><li> Pool der Überstände aus den Schritten 2.9 und 2.10 in Ultrazentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 50.000 xg in einer Ultrazentrifuge für 90 min. </li><li> Nehmen Sie die Kapseln Ultrazentrifugenröhrchen, die sehr sorgfältig und in eine Sterilbank, die Erinnerung an die Ausrichtung des Rohres in der Zentrifuge. </li><li> Offene Kapselhalteultrazentrifugenröhrchen dekantiert Medium sorgfältig in einer solchen Weise, daß das Pellet an der Oberseite des Rohrs. Da virale Pellets kann schwierig sein, zu visualisieren, zu erinnern, wasSeite des Rohrs ein Pellet gebildet haben. Werfen Sie einen Mikropipette und entfernen letzte bisschen Medium während kümmert sich nicht um die undurchsichtigen braunen Pellets, die auf der Seite der Unterseite des Ultrazentrifugenröhrchen sichtbar zu agitieren. </li><li> Resuspendieren dieses Pellet in 500 ul organoiden Kultur-Medium mit 10 mM Nicotinamid, 10 uM Chir99021, 10 uM Y27632 und 8 ug / ml Polybren ergänzt. Resuspension in diesem Medium ist wichtig, da mit hohem Titer-Virus wird verwendet, um Organoide direkt transduzieren. </li><li> Optional: einfrieren, das Virus in diesem Medium in zwei Chargen von 250 ul in -80 ° C aliquotiert. </li></ol> 3. Lentivirale Transduktion Organoide Tag 0: <ol><li> Split eine vollständige 0,95 cm 2 und der Organoide zwei Tage vor dem in eine neue und Weiterleitung mit dem Ziel, rund 50 kleine Organoide erhalten. Aufgeteilt Organoiden nach früher veröffentlichten Protokoll 1 (3A, B). </li><li> Ergänzen organoide Kulturmedium mit 10 &amp; mgr; Chir99021 und 10 mM Nicotinamid zystische Hyperproliferations Krypten (3C) zu erhalten. HINWEIS: Cystic Krypten am besten entwickeln, wenn frisch gespalten Organoide werden in Gegenwart von Chir99021 gewachsen. </li></ol> Tag 2: <ol start="3"><li> Ernte Organoide durch Auf- und Abpipettieren der Matrigel und mittlere, wodurch das Gemisch mit einer Mikropipette p1000 zu stören. Legen Sie die Mischung in einem 15-ml-Tube. </li><li> Weiter stören mit Pasteur-Pipette, in dem sich die distale Öffnung hat, durch Schmelzen verringert. Zentrifuge Organoiden für 5 min bei 100 x g pelletieren. HINWEIS: Abhängig von der Größe der Zentrifuge, verwenden Sie ein anderes Zentrifugendrehzahl. Es ist notwendig, die genaue Geschwindigkeit, mit der gestörten Organoide werden aus dem Gemisch abgetrennt finden. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 500 ul vorgewärmtes 1x Trypsin (ähnlich wie 0,25% Trypsin). Resuspendieren Organoide in Trypsin und Inkubation3 min in einem 37 ° C Wasserbad. </li><li> Inaktivierung von Trypsin durch Zugabe von 3,5 ml Zelllinie Kulturmedium (DMEM, ergänzt mit 10% FCS, 1% Penicillin / Streptomycin und Glutamin). Zentrifuge 5 min bei 500 x g. </li><li> Entfernen Sie den Überstand in Pellet in etwa 20 ul Medium zu verlassen. Übertragen Sie die Organoide in diesem letzten kleinen Menge des Mediums in einen Brunnen auf einem 48-Mulden Platte. </li><li> In hohem Titer Lentivirus in Übertragungsmedium, wie in Schritt 2.14, resuspendieren beschrieben und fahren Sie mit Schritt 3.10. In der Begegnung mit niedrigen Übertragungswirksamkeit, Schritt 3.9 hinzugefügt werden. HINWEIS: Für eine effiziente Weiterleitung, in der Regel fügen Sie ein Aliquot von 250 ul mit hohem Titer Lentivirus um eine Vertiefung Organoide. Dies entspricht 50% der gesamten Ernte Lentivirus aus einer Produktion wie in Schritt 2 dieses Protokolls beschrieben. </li><li> Optional: zu Übertragungswirksamkeit zu verbessern, führen spinoculation, indem Sie die 48 Well-Platte mit Organoide in einem vorgewärmten Zentrifuge auf 326; C und rotieren bei 600 × g für 1 Std. </li><li> Setzen organoide-Virus-Mischung in Kulturbrutschrank und Inkubation für 1 h bei 37 ° C in einem Brutschrank zum Übertragung ermöglichen. </li><li> Optional: zur weiteren Verbesserung der Wirksamkeit der Transduktion inkubieren Organoiden weitere 3 h bei 37 ° C in einem Brutschrank. </li><li> 1 ml der organoiden Kulturmedium und resuspendieren organoide-Virus-Mischung, Transfer in ein Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge in einer Mikrozentrifuge für 5 Minuten bei 850 xg pelletiert Organoide. </li><li> Überstand verwerfen und das Pellet in 20 ul eiskaltem Matrigel. Da das Material verfestigt, wenn es wärmer wird, verwenden Sie die Pipettenspitzen, die durch Auf- und Abpipettieren eiskaltem PBS für eine Reihe von mal gekühlt werden. </li><li> Setzen des Tröpfchens in der Mitte einer Vertiefung in einer 48 Vertiefungen Inkubieren in Kulturbrutschrank bei 37 ° C für 15 min zu verfestigen. </li><li> Nach 15 Minuten vorsichtig mit 250 ul organoide Kulturmedium, ergänzt10 mM Nicotinamid, 10 uM und 10 uM Chir99021 Y27632. Kleine gestört organoide Fragmente werden in kleine zystische Organoide innerhalb von 24 Stunden zu bilden. </li></ol> Tag 5: <ol start="16"><li> Aktualisieren Medium und zu ergänzen, mit einer Auswahl Antibiotikum (für Puromycin, verwenden Sie 4 ug / ml). </li></ol> 7. Tag: <ol start="17"><li> Ersetzen Medium für Standard organoide Kulturmedium, mit Auswahl Antibiotikum ergänzt. HINWEIS: Angehende wird komplett 2-3 Wochen nach Chir99021 Rückzug sein. Nach der Auswahl können Organoide ohne Selektionsantibiotikum angebaut werden. </li></ol> 4. Organoide RNA Vorbereitung Quantitative RT-PCR oder Microarray- <ol><li> Zur RNA-Präparation, mit einem kommerziellen Kit nach Herstellerprotokoll. Entfernen Sie das Medium aus Organoide und fügen Sie 350 ul Puffer RLT, mit β-Mercaptoethanol ergänzt gerade auf der Kuppel des Matrigel enthält Organoide. Resuspendieren der Material in RLT durch Pipettieren mit p1000 Mikropipette. </li><li> Der weitere RNA prep nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Optional: RNA-Ausbeute zu erhöhen durch Amplifikation mit Ovation Pico WTA Systems und schreibt erste Eingabe von 50 ug Gesamt-RNA nach Herstellerprotokoll. </li><li> Optional: für die Qualitätskontrolle vor der RNA-Microarray, laufen Proben auf einem 2100 Bioanalyzer mit einem Eukaryoten Gesamt-RNA Nano-Chip, mit dem Ziel für eine RNA Integrity Number (RIN) von 8,5 oder mehr (5) nach dem Protokoll des Herstellers. </li></ol> 5. Die Verarbeitung Organoide für Paraffinausgießstation und Immunhistochemie <ol><li> Vor Beginn der organoiden Einbindung vorwärmen ein Aluminiumblock mit Bohrungen passend Durchmesser 12 mm Glasröhrchen im Brutschrank bei 70 ° C bis Paraffin flüssig zu halten. </li><li> Werfen Sie einen einzigen gut mit ausgewachsenen Organoide und entfernen Sie das Medium, so dass die eingebetteten Organoide intakt. </li><li> 1 mlvon 4% Paraformaldehyd in PBS direkt zu gut und zu beheben bei 4 ° C überall von 1 Stunde über Nacht. </li><li> Para Ersetzen mit 1 ml eiskaltem PBS. Optional: halten fest Organoide in PBS bis zu 1 Woche bei 4 ° C nach diesem Schritt. </li><li> Resuspendieren Fest Organoide in 1 ml PBS aufnehmen und in Glasfläschchen. </li><li> Lassen Organoiden sinken nach unten für 1 min, zu dekantieren und zu ersetzen PBS mit 70% Ethanol in dem ein paar Tropfen von Eosin-Lösung gelöst, um die Visualisierung von Organoiden gesamten Einbettungsprozesses zu ermöglichen. </li><li> Verlassen Organoiden in 70% Ethanol bei Raumtemperatur. Nach 30 Minuten, entfernen Sie 70% Ethanol durch vorsichtiges Dekantieren, die Möglichkeit, die Organoide von Auge, weil der leichte rosa Farbe Eosin sichtbar zu machen. Ersetzen Sie die Einbettung Lösung mit 96% Ethanol. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 5.7 wird jedes Mal, Austausch der Einbettung Lösung mit dem nächsten. Pass Organoide durch die folgenden Lösungen anschließend: 70% Ethanol, 90% Ethanol, 96% Ethanol, 100% ethanol, 100% Ethanol, Xylol, Xylol. </li><li> Dekantiert man die letzten Xylol Wasch und gießen Paraffin in die Röhre. Das Glas sofort in der Pre erwärmt Aluminiumblock bei 70 ° C für 30 min und ersetzen Paraffin mit neuen sauberen Paraffin. </li><li> Gießen Paraffin aus und Pipetten Organoide in den Paraffinblock Form unter Verwendung einer vorgewärmten Pasteur-Pipette mit großer Öffnung. Halten Pasteur-Pipette warmen mit einem Bunsenbrenner. Legen Sie alle Organoide im Paraffinblockform in einer kleinen Schicht von flüssigem Paraffin. </li><li> So viel wie möglich, versuchen Sie, alle Organoide in Richtung der Mitte des Paraffinblocks Form unter Verwendung einer erwärmten Dissektion Nadel manipulieren. Halten Sie Dissektion Nadel warmen mit Bunsenbrenner. </li><li> Wenn Lokalisierung Organoide in der Form ist zufriedenstellend, Kokille leicht auf die Paraffinschicht verfestigt. </li><li> Beenden Sie den Block durch Gießen mehr Paraffin auf und fügen Sie ein Standard-histologische Einbettung Kassette. </li></ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+epidermal+growth+factor+%28EGF%29+on+cell+proliferation+of+the+gastrointestinal+mucosa+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv.+B%2C+Cell+Pathology+Including+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">The effect of epidermal growth factor (EGF) on cell proliferation of the gastrointestinal mucosa in rodents.</a> Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 40 (1), 63-69 (1982).</li>
<li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-spondin1%2C+a+novel+intestinotrophic+mitogen%2C+ameliorates+experimental+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">R-spondin1, a novel intestinotrophic mitogen, ameliorates experimental colitis in mice.</a> Gastroenterology. 132 (4), 1331-1343 (2007).</li>
<li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+BAC+transgenic+epithelial+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Generation of BAC transgenic epithelial organoids.</a> PLoS One. 8 (10), e76871(2013).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li>
<li>Heijmans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+stress+causes+rapid+loss+of+intestinal+epithelial+stemness+through+activation+of+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response.</a> Cell Rep. 3 (4), 1128-1139 (2013).</li>
<li>Roe, T., Reynolds, T. C., Yu, G., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+murine+leukemia+virus+DNA+depends+on+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis.</a> The EMBO Journal. 12 (5), 2099-2108 (1993).</li>
<li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476 (7360), 293-297 (2011).</li>
<li>Bahnson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+enhancement+of+retroviral+mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer.</a> Journal Of Virological Methods. 54 (2-3), 131-143 (1995).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das aktuelle Video-Protokoll beschreibt lentivirale Transduktion Organoide von der Grund Darmepithel und nachgelagerten Analyse dieser Organoide mittels quantitativer RNA-Techniken und Immunhistochemie. Lentivirale Transduktion wird oft in anhaftenden oder schwimmende Zellen in Kulturplatten durchgeführt. Da die dreidimensionale Struktur von Organoiden macht sie schwierig durch virale Partikel eindringen, sind eine Reihe von Verfahren, um die Wirksamkeit zu erhöhen. Eine Vorbehandlung der Or...

Das Darmepithel ist eine der am schnellsten vermehren Körpergewebe, die verursacht hat es großes Interesse aus der Forschung über Krebs und Stammzellen zu gewinnen. Im Jahr 2009 wurde eine Technik veröffentlicht, um lang anhaltende Kulturen von Klein Darmkrypten in Matrigel erzeugen, Erhaltung eine 3-dimensionale Struktur 1. Diese Strukturen, sogenannte Darm Organoiden, kann unter Verwendung von Standardtechniken gezüchtet werden, mit Umgebungsmedium mit einer Anzahl von definierten Wachstumsfaktoren, einschließlich BMP-Signalweg-Inhibitors Noggin (nOgh) ergänzt, die Wnt-Signalwegs Enhancer rspondin 1 (Rspo1) und epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) alle eine Darm Proliferation 2-4 verbessern. Organoide übertreffen traditionelle Krebszelllinien in den Aspekten, dass sie nicht-mutierten sind, haben Stammzellen Hierarchie beibehalten, zeigen intakten Zellpolarisation und Ausstellungs Differenzierung in allen Zelllinien in der im Entstehen begriffenen kleine int gefundenestinal Epithel. Da sie transduziert Transgene tragen oder RNA-Interferenz-Konstrukte 5, werden sie verwendet, um spezifische genetische Elemente zu untersuchen, überwiegt Experimenten mit transgenen Mäusen in Facetten Kosten und Geschwindigkeit. Transgene Expression in Organoiden kann unter Verwendung von entweder murine retroviralen oder lentiviralen Vektoren 6,7 werden. Aufgrund der Einschränkungen der murine Retroviren, in der Lage zu transduzieren mitotischen Zellen ausschließlich 8 wird lentiviralen Transduktion häufiger für Zellen, die nur schwer zu infizieren, wie Organoiden verwendet. Viral transduziert und stabil exprimierenden transgenen Organoiden kann für eine Vielzahl von Downstream-Analysen verwendet werden, einschließlich quantitative RNA-Analysen und Immunhistochemie. Zusammengenommen hat Kultur Organoide von primären intestinalen Epithelzellen in eine Routine-Technik, die einfach und ohne spezielle Laboranforderungen umzusetzen ist entwickelt, und hat sich die neue Norm in cell Kultur in Forschung auf das Darmepithel. Techniken der virale Transduktion und nachfolgende Downstream-Analyse in Organoide sind mühsam durchzuführen und um organoide Experimente helfen wir generiert dieses Video-Protokoll und zeigt Methoden zur lentivirale Transduktion der kultivierten Organoide. Wir zeigen außerdem, wie die korrekte Verarbeitung Organoide kann die Ausbeute zu erhöhen und damit die Leistung zu verbessern nachgeschalteter Analyse mittels RNA-Techniken oder die Immunhistochemie. In dem Protokoll wurden Organoiden, die von kleinen Darmkrypten abgeleitet werden ausschließlich verwendet, obwohl die beschriebenen Techniken können zum Kolon Organoide als auch angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>Polyethylenimin</td><td>Polysciences</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>BD 356231</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetyl Cystein</td><td>Sigma</td><td>A9165-1G</td><td></td></tr><tr><td>Maus Egf</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8045</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>glutamax 100x</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Chir 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td></td></tr><tr><td>Y27632&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Y0503-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Polybren</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamid</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Lonza</td><td>BE02-007E</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P 7255</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-Mercaptoethanol</td><td>Merck</td><td>8,057,400,250</td><td></td></tr><tr><td>Ovation Pico WTA System</td><td>NuGen</td><td>3300-12</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>Glasfläschchen konisch 12&nbsp; mm x 75&nbsp; mm 5&nbsp; ml</td><td>VWR</td><td>LSUKM12</td><td></td></tr><tr><td>Eosin gelblich</td><td>VWR</td><td>1,159,350,025</td><td></td></tr></tbody></table>

ein protokoll für lentivirale transduktion und downstream-analyse der darm organoide

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinale Krypten-Zotten-Strukturen, die als Organoide bezeichnet werden, können in nachhaltiger Kultur dreidimensional gehalten werden, wenn sie mit den entsprechenden Wachstumsfaktoren ergänzt werden. Da Organoide dem ursprünglichen Gewebe in Bezug auf die homöostatische Stammzelldifferenzierung, die Zellpolarität und das Vorhandensein aller dem adulten Darmepithel bekannten terminalen differenzierten Zelltypen sehr ähnlich sind, dienen sie als wesentliche Ressource bei der experimentellen Erforschung des Epithels. Die Möglichkeit, Transgene oder interferierende RNA unter Verwendung lentiviraler oder retroviraler Vektoren in Organoiden zu exprimieren, hat die Möglichkeiten für die funktionelle Analyse des Darmepithels und der Darmstammzellen erweitert und die traditionelle Maus-Transgene in Bezug auf Geschwindigkeit und Kosten übertroffen. Im aktuellen Videoprotokoll zeigen wir, wie die Transduktion von Dünndarmorganoiden mit lentiviralen Vektoren genutzt werden kann, veranschaulicht durch die Verwendung von Doxycylin-induzierbaren Transgenen oder IPTG-induzierbarer Kurzhaarnadel-RNA für die Überexpression oder den Gen-Knockdown. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die Organoidkultur winzige Zellzahlen liefert, die durch experimentelle Behandlung sogar reduziert werden können, erklären wir, wie Organoide für die nachgelagerte Analyse mit quantitativer RT-PCR, RNA-Microarray und Immunhistochemie verarbeitet werden können. Techniken, die die Transgenexpression und den Gen-Knock-down in Darmorganoiden ermöglichen, tragen zum Forschungspotenzial dieser Darmepithelstrukturen bei und etablieren die Organoidkultur als neuen Standard in der Zellkultur.

Organoide lentivirale Transduktion Die Technik der organoiden Transduktion unter Verwendung lentivirale Partikel hängt von richtigen Umgang mit Organoide vor und während der Weiterleitung. Organoide (3A) wurden kultiviert und sie in einzelne Krypten (3B) gestört wurden. Wie bereits berichtet, diese einzelnen Krypten, wenn sie in Gegenwart der GSK3-Inhibitor Chir99021 kultiviert wurde zystische Krypten 9 (3C). Anschließend...

In diesem Videoprotokoll erklären wir Schritt für Schritt die lentivirale Transduktion in Organoiden des primären Darmepithels und die Verarbeitung und nachgelagerte Analyse dieser Kulturen mittels quantitativer RT-PCR, RNA-Microarray und Immunhistochemie.

Ein Protokoll für Lentivirale Transduktion und Downstream-Analyse der Darm Organoide

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, stabil transduzierte Organoiden aus primärem murinem Darmepithel für nachfolgende Analysen von Darmorganoiden zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst HEC 2 93 T-Zellen mit lentiviralen Verpackungsvektoren und einem lentiviralen Plasmid, das das Gen der Interesse kodiert, transfiziert werden, um lentivirale Partikel mit hoher Titerkonzentration herzustellen. Der zweite Schritt besteht darin, kultivierte murine Darmorganoiden mit einer Reihe von Wachstumsfaktoren vorzubehandeln, um zystische, hyperproliferative Krypten zu erhalten. Anschließend transduzieren Sie die Organoiden mit Lentivirus hoher Titerkonzentration und inkubieren die transduzierten Organoiden in Matrigel. Der letzte Schritt besteht darin, vollständig entwickelte, transduzierte Organoiden in Paraffin einzubetten, um nachfolgende immunhistochemische Analysen durchzuführen. Letztendlich wird die lentivirale Transduktion von Organoiden eingesetzt, um genetische Veränderungen in einem in-vitro-Modell des intestinalen Epithels zu erzeugen, das zuverlässig, reproduzierbar und schnell ist.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Krebszelllinien besteht darin, dass Organoiden eine nicht mutierte, versetzte Stammzellhierarchie darstellen. In Bezug auf die zelluläre Polarisation können sie sich in alle verschiedenen Zelltypen des Dünndarmepithels differenzieren. Außerdem können transduzierte Organoiden verwendet werden, um spezifische genetische Elemente zu untersuchen, wodurch sie im Vergleich zu transgenen Mäusen in Bezug auf Kosten und Geschwindigkeit überlegen sind.Die Herstellung von Lentiviren ist ein fünftägiges Protokoll, das mit dem Aufteilen von HEC 293T-Zellen in eine 162 cm² große Zellkulturflasche bei 60 bis 80 % Konfluenz in Zellkulturmedium beginnt. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem befeuchteten Zellkulturinkubator bei 37 Grad Celsius am folgenden Tag. Bereiten Sie die DNA-Transfektionslösung und die Polyethylenamin- oder PEI-Transfektionslösung gemäß der Beschreibung im Protokolltext vor.Geben Sie die DNA-Transfektionslösung zur PEI-Lösung hinzu, wirbeln oder invertieren Sie mehrmals und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie zwei Milliliter der DNA-Transfektionslösung plus PEI-Lösung tropfenweise auf die HEC 293T-Zellen und inkubieren Sie vier Stunden bei 37 Grad Celsius.Erneuern Sie das Kulturmedium. Um das PEI zu entfernen, inkubieren Sie die Zellen am vierten Tag zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius, sammeln Sie das Überstandmedium in einem 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie frisches Kulturmedium zu den Zellen und stellen Sie die Kulturschale zurück in den Inkubator. Zentrifugieren Sie den gesammelten Überstand fünf Minuten bei 500 ×g.Um tote Zellen zu entfernen, verwenden Sie dann eine große 60-Milliliter-Spritze, um den ÜBERSTAND durch einen 0,45-Mikrometer-Filter zu pressen. Lagern Sie den filtrierten Überstand über Nacht bei vier Grad Celsius am folgenden Tag. Sammeln, zentrifugieren und filtrieren Sie die zweite Charge des Überstandes wie für die erste Charge gezeigt.Vereinigen Sie die beiden Fraktionen des Überstandes in Ultrazentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie 90 Minuten bei 50.000 ×g. Entfernen Sie nach Beendigung der Zentrifugation sehr vorsichtig die Kapseln mit den Ultrazentrifugenröhrchen und stellen Sie sie in eine laminare Luftströmungskabine.Öffnen Sie die Kapsel, die das Ultrazentrifugenröhrchen enthält, und gießen Sie das Medium vorsichtig ab, wobei das Pellet an der oberen Seite des Röhrchens verbleibt. Es ist wichtig, sich zu merken, an welcher Seite des Röhrchens sich das Pellet gebildet hat, da virale Pellets schwer sichtbar sein können. Entfernen Sie anschließend mit einer Mikropipette den letzten Rest des Mediums, wobei darauf geachtet werden muss, das trübe braune Pellet, das an der Seitenwand des Bodens des Ultrazentrifugenröhrchens sichtbar ist, nicht aufzuwirbeln.Suspendieren Sie dieses Pellet in 500 Mikrolitern Organoid-Kulturmedium, das mit Nicotinamid-Kinaseinhibitoren und Poly Brain Resus ergänzt wurde. Die Suspension in diesem Medium ist wichtig, da zwei Tage vor der Transduktion ein Virus mit hoher Titer direkt zur Transduktion der Organoiden verwendet wird. Teilen Sie eine volle Organoidenkolonne aus einem 0,95 Quadratzentimeter großen Wells auf ein neues Wells einer 48-Well-Platte auf.Gemäß einem zuvor veröffentlichten Protokoll. Ziel ist es, etwa 50 kleine Organoiden in der Organoidenkultur zu erhalten. Medium ergänzt mit einem Glykogensynthase-Kinase-Inhibitor und Nicotinamid.Um zystische hyperproliferative Krypten zu erhalten. Inkubieren Sie die Organoiden zwei Tage lang und ernten Sie die Organoiden am Tag der Transduktion mit einer P-1000-Mikropipette. Pipettieren Sie das Matrigel und Medium mehrmals auf und ab, wodurch die Mischung aufgelöst wird.Geben Sie die Mischung in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Stören Sie die Mischung weiter mit einer Pipette, deren distale Öffnung durch Schmelzen verkleinert wurde. Pelletieren Sie die Organoiden durch Zentrifugation bei 100 × g für fünf Minuten. Entfernen Sie dann den Überstand und fügen Sie 500 Mikroliter vorgewärmtes 1×-Trypsin hinzu, resuspendieren Sie die Organoiden und inkubieren Sie für drei Minuten.In einem Wasserbad mit 37 Grad Celsius die Trypsin-Aktivität durch Zugabe von 3,5 Milliliter Zellkulturmedium stoppen, fünf Minuten lang zentrifugieren. Bei 500 ×g. Den Überstand entfernen, sodass das Pellet in etwa 20 Mikrolitern Medium verbleibt. Die Organoiden in dieser letzten kleinen Menge Medium in eine Vertiefung überführen.Auf einer 48-Well-Platte. Geben Sie das zuvor hergestellte Lentivirus mit hoher Titerkonzentration in Transduktionsmedium zu den Organoiden und resuspendieren Sie diese. Inkubieren Sie die Organoid-Virus-Mischung eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einem Zellkulturinkubator, um die Transduktion zu ermöglichen. Nach einer Stunde geben Sie ein Milliliter Organoidkulturmedium zur Organoid-Virus-Mischung hinzu, resuspendieren erneut und überführen die Mischung in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 850 ×g.Um die Organoiden zu pelletieren, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet. Geben Sie den Tropfen in der Mitte einer Vertiefung in 20 Mikroliter eiskaltem Matrigel. Verwenden Sie eine 48-Well-Platte und inkubieren Sie 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Damit sich der Tropfen nach 15 Minuten verfestigt. Vorsichtig 250 Mikroliter Organoidkultur hinzufügen. Medium ergänzt mit Nicotinamid und Kinaseninhibitoren.Erwärmen Sie einen Aluminiumblock in einem Inkubator auf 70 Grad Celsius, um das Paraffin flüssig zu halten. Entfernen Sie das Medium aus einem einzelnen Wells mit vollständig entwickelten Organoiden, wobei die eingebetteten Organoiden intakt bleiben, und geben Sie ein Milliliter 4 % Paraformaldehyd in PBS direkt in den Well. Ersetzen Sie das Paraformaldehyd durch ein Milliliter PBS.Suspendieren Sie die fixierten Organoiden in PBS und überführen Sie sie in ein Glasfläschchen. Lassen Sie die Organoiden eine Minute lang auf den Boden absinken. Danach pipettieren Sie das PBS ab und ersetzen es durch 70 % Ethanol, in dem einige Tropfen Eosin-Lösung gelöst wurden.Um die Visualisierung der Organoiden während des Einbettungsprozesses zu ermöglichen, lassen Sie die Organoiden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in 70 % Ethanol. Entfernen Sie das 70 % Ethanol vorsichtig mittels Pipettierung. Die Organoiden können aufgrund der rosafarbenen Eosinfärbung mit bloßem Auge sichtbar gemacht werden.Ersetzen Sie die Einbettungslösung durch 96 % Ethanol und lassen Sie sie auf diese Weise 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Anschließend führen Sie die Organoiden nacheinander durch 70 % Ethanol, 90 % Ethanol, 96 % Ethanol, 100 % Ethanol, 100 % Ethanol, Xylol und Xylol. Dekantieren Sie die letzte Xylol-Waschung und geben Sie Paraffin in das Glasfläschchen.Stellen Sie das Gefäß sofort für 30 Minuten in den vorgewärmten Aluminiumblock bei 70 Grad Celsius. Nach 30 Minuten ersetzen Sie das Paraffin durch neues, sauberes Paraffin mit einem vorgewärmten PE-Röhrchen oder Pipettenspitze. Gießen Sie das Paraffin ab und verwenden Sie eine vorgewärmte Pipette oder ein Pipettiergerät mit großer Öffnung, um die Organoiden in die Paraffinblockform in eine Schicht flüssigen Paraffins umzupipettieren.Erwärmen Sie eine Dissektionsnadel mit einem Bunsenbrenner und bringen Sie alle Organoiden so weit wie möglich in die Mitte der Paraffinblockform. Sobald die Positionierung der Organoiden in der Form zufriedenstellend ist, kühlen Sie die Form leicht ab, um die Paraffinschicht zu verfestigen. Vervollständigen Sie den Block, indem Sie weiteres Paraffin darauf gießen, und fügen Sie ein standardmäßiges histologisches Einbettkassette hinzu.In diesem Protokoll wurden Organoiden des Darmepithels mit Lentiviren transduziert. Normale Organoiden wachsen als Krypta-Villus-Strukturen mit einer Anzahl von Krypten, die aus einer gemeinsamen Villus-Domäne hervorgehen. Nach Behandlung dieser Organoiden mit dem GSK-Drei-B-Inhibitor CHIR 9 9 0 21 steigt die Proliferation an und die Krypten werden nach der Transduktion zystisch.Mithilfe einer lentiviralen EGFP-Überexpression exprimieren die Organoiden fluoreszierendes EGFP; Transduktionsverstärkungsmaßnahmen, die bei geringer Transduktionseffizienz durchgeführt werden könnten, wie eine Inokulation oder eine verlängerte Virusinkubation, sind nicht erforderlich, da diese Schritte die ohnehin hohe Effizienz nicht weiter steigern. Anschließend werden diese Organoiden für RNA-Methoden und immunhistochemische Analysen aufgearbeitet. Diese repräsentative Aufnahme zeigt einen Schnitt durch ein murines intestinales Organoid, das nach einer einstündigen Inkubation mit BRDU vor der Fixierung gegen BRDU gefärbt wurde.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Organoiden aus primärem Darmepithel mithilfe von Lentiviren- oder Retrovirusteilchen transduziert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Processing of Lentivirus-Transduced Mouse Intestinal Organoids for Immunohistochemical Analysis

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Ein Video-Protokoll von retrovirale Infektion in der Grunddarm Organoide Kultur

Intestinale organoide Kulturen werden aus ganzen Krypten und erlauben nicht die Analyse der Selbsterneuerung und Differenzierung in eine Zelle-spezifische Art und Weise. Dieses Protokoll beschreibt Rekonstitution der sortierten Stamm (Lgr5+) und Nische (Paneth) Zellen, die Organellen hervorrufen und ermöglicht ihre vorherige biochemische und genetische Modifikation und Funktionsanalyse.

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Generierung und Manipulation von Ratten-Darm-Organoiden

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Dieser Artikel beschreibt ein neuartiges Protokoll und Reagenz-Set für empfindliche Messung der neurotoxischen Wirkungen von Verbindungen und Behandlungen auf Co-Kulturen von Neuronen und Astrozyten mit High Content Analyse entwickelt. Die Ergebnisse zeigen, dass High Content Analyse eine spannende neue Technologie für die Neurotoxizität Beurteilung darstellt.

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