Ein Protokoll für Lentivirale Transduktion und Downstream-Analyse der Darm Organoide

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, stabil transduzierte Organoide aus primärem Darmepithel der Maus für die nachgelagerte Analyse von Darmorganoiden zu generieren. Dies wird erreicht, indem zunächst HEC 2 93 T-Zellen mit lentiviralen Verpackungsvektoren und lentiviralem Plasmid transektiert werden, wobei das interessierende Gen für die Produktion von lentiviralen Partikeln mit hohem Titer kodiert wird. Der zweite Schritt besteht darin, kultivierte Darmorganoide von Mäusen mit einer Reihe von Wachstumsfaktoren vorzubehandeln, um zystische hyperproliferative Krypten zu erhalten.

Als nächstes transduzieren Sie die Organoide mit dem Lentivirus mit hohem Titer und inkubieren die transduzierten Organoide in Matrigel. Der letzte Schritt besteht darin, ausgewachsene transduzierte Organoide in Paraffin für die nachgelagerte immunhistochemische Analyse einzubetten. Letztendlich wird die lentivirale Organoid-Transduktion verwendet, um genetische Veränderungen in einem In-vitro-Modell des Darmepithels zu erzeugen, das zuverlässig, reproduzierbar und schnell ist.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Krebszelllinien besteht darin, dass Organoide eine nicht mutierte verschobene Stammzellhierarchie aufweisen. Im Text kann es sich bei der zellulären Polarisation in alle verschiedenen Zelltypen des Dünndarmepithels differenzieren. Darüber hinaus können transduzierte Organoide zur Untersuchung spezifischer genetischer Elemente verwendet werden, wodurch der Einsatz transgener Mäuse und Facetten von Kosten und Geschwindigkeit aufgewogen werden.

Die Herstellung von lentiviralen Partikeln ist ein fünftägiges Protokoll, das mit der Spaltung von HEC 2 93 T-Zellen auf 60 bis 80 % Co-Flüssigkeit in einem 162 Quadratzentimeter großen Kolben in Zellkulturmedium beginnt. Inkubieren Sie die Zellen am Folgetag über Nacht in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie die DNA-Transfektionslösung und die Polyethylenamin- oder PEI-Transfektionslösung vor, wie im Protokolltext beschrieben.

Geben Sie die DNA-Transfektionslösung in den Wirbel der PEI-Lösung oder invertieren Sie sie mehrmals und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang. Bei Raumtemperatur. Zwei Milliliter der DNA TRANSFECTION plus PEI-Lösung auf die HEC 2 93 T-Zellen träufeln und nach vier Stunden vier Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Aktualisieren Sie das Kulturmedium. Um das PEI zu entfernen, inkubieren Sie die Zellen am vierten Tag zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius, sammeln Sie den Überstand in einem 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie neues Kulturmedium in die Zellen und stellen Sie den Kolben wieder in den Inkubator, zentrifugieren Sie den gesammelten Überstand fünf Minuten lang bei 500 g.

Um abgestorbene Zellen zu entfernen, drücken Sie den SUPERNAT mit einer großen 60-Milliliter-Spritze durch einen 0,45-Mikrometer-Filter. Lagern Sie das gefilterte Supernat am Folgetag über Nacht bei vier Grad Celsius. Die zweite Charge des Überstands wird aufgefangen, zentrifugiert und filtriert, wie für die erste Charge gezeigt.

Die beiden Chargen des Überstands werden in Ultrazentrifugenröhrchen zusammengefasst. Zentrifugieren Sie bei 50.000 GS für 90 Minuten. Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, entfernen Sie sehr vorsichtig die Kapseln mit den Ultra-Zentrifugenröhrchen und setzen Sie sie in eine Laminar-Flow-Haube ein.

Öffnen Sie die Kapsel mit dem Ultra-Zentrifugenröhrchen und dekantieren Sie das Medium vorsichtig mit dem Pellet auf der Oberseite des Röhrchens. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, welche Seite des Röhrchens sich gebildet hätte, da virale Kügelchen schwer zu visualisieren sein können. Verwenden Sie anschließend eine Mikropipette, um das letzte bisschen Medium zu entfernen, und achten Sie darauf, das undurchsichtige braune Kügelchen, das an der Seite des Bodens des Ultrazentrifugenröhrchens sichtbar ist, nicht zu bewegen.

Suspendieren Sie dieses Pellet in 500 Mikrolitern Organoid-Kulturmedium, ergänzt mit Nicotinamidkinase-Inhibitoren und Polyhirn-Reanimation. Die Suspension in diesem Medium ist wichtig, da das Virus mit hohem Titer zwei Tage vor der Transduktion direkt für die Transduktion von Organoiden verwendet wird. Teilen Sie eine volle 0,95 Quadratzentimeter große Vertiefung mit Organoiden in eine neue Vertiefung mit einer 48-Well-Platte auf.

Nach einem zuvor veröffentlichten Protokoll. Ziel ist es, etwa 50 kleine Organoide in Organoidkultur zu erhalten. Medium, ergänzt mit einem Glykogensynthase-Kinase-Hemmer und Nicotinamid.

Zur Gewinnung von zystischen hyperproliferativen Krypten. Inkubieren Sie die Organoide am Tag der Transduktion zwei Tage lang und ernten Sie die Organoide mit einer P 1000 Mikropipette. Pipettieren Sie das Matra-Gel und das Medium auf und ab, wodurch die Mischung gestört wird.

Gib die Mischung in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Unterbrechen Sie die Mischung weiter mit einer PE Ihre Pipette, bei der die distale Öffnung durch Schmelzen verkleinert wurde. Pelletieren Sie die Organoide, indem Sie sie fünf Minuten lang bei 100 G zentrifugieren. Dann den Überstand bei 500 Mikrolitern vorwärmen x Trypsin entfernen und die Organoide resuspendieren, drei Minuten inkubieren.

In einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad inaktivieren Sie das Trypsin, indem Sie fünf Minuten lang 3,5 Milliliter Zelllinien-Kulturmedium zugeben. Bei 500 g entfernen Sie das Super Natan, um das Pellet in etwa 20 Mikrolitern Medium zu belassen. Übertragen Sie die Organoide in dieser letzten kleinen Menge Medium in eine Vertiefung.

Auf einer 48-Well-Platte. Geben Sie das zuvor vorbereitete Lentivirus mit hohem Titer in Transduktionsmedium zu den Organoiden und resuspendieren Sie es. Inkubieren Sie das Organoid-Virusgemisch eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einem Kulturinkubator, um nach einer Stunde eine Transduktion zu ermöglichen, fügen Sie einen Milliliter Organoidkultur und Medium zum Organoid-Virusgemisch hinzu, resuspendieren Sie es und überführen Sie das Gemisch für fünf Minuten in eine Mikrozentrifugenröhrchenzentrifuge bei 850 GS.

Um die Organoide zu pelletieren, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet. Geben Sie das Tröpfchen in 20 Mikroliter eiskaltes Matra-Gel in die Mitte einer Mulde. In eine 48-Well-Platte geben und 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Damit sich das Tröpfchen nach 15 Minuten verfestigt. Fügen Sie vorsichtig 250 Mikroliter Organoidkultur hinzu. Medium, ergänzt mit Nicotinamid- und Kinasehemmern.

Einen Aluminiumblock in einem Inkubator bei 70 Grad Celsius vorwärmen, um das Paraffin flüssig zu halten. Entfernen Sie das Medium aus einer einzelnen Vertiefung mit ausgewachsenen Organoiden, lassen Sie die eingebetteten Organoide intakt und fügen Sie einen Milliliter 4%Paraformaldehyd in PBS direkt in die Vertiefung hinzu. Ersetzen Sie das Paraformaldehyd durch einen Milliliter PBS.

Die fixierten Organoide im PBS resuspendieren und in ein Glasfläschchen überführen. Lassen Sie die Organoide eine Minute lang auf den Boden sinken. Als nächstes pipettieren Sie das PBS ab und ersetzen es durch 70%iges Ethanol, in dem ein paar Tröpfchen Eoin-Lösung gelöst sind.

Um die Visualisierung von Organoiden während des gesamten Einbettungsprozesses zu ermöglichen, lassen Sie die Organoide 30 Minuten lang in 70%igem Ethanol bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das 70%ige Ethanol durch vorsichtiges Pipettieren. Die Organoide können aufgrund der rosafarbenen Farbe mit dem Auge sichtbar gemacht werden.

Ersetzen Sie die Einbettlösung durch 96%iges Ethanol und lassen Sie sie auf diese Weise 30 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend passieren Sie die Organoide durch 70% Ethanol, 90% Ethanol, 96% Ethanol, 100% Ethanol, 100% Ethanol, Xylol und Xylol. Dekantieren Sie die letzte Xylolwäsche und gießen Sie Paraffin in das Glasfläschchen.

Legen Sie das Fläschchen sofort für 30 Minuten bei 70 Grad Celsius in den vorgewärmten Aluminiumblock. Ersetzen Sie das Paraffin nach 30 Minuten durch neues sauberes Paraffin mit einem Vorwärmgerät, PE oder Pipette. Gießen Sie das Paraffin ab und pipettieren Sie die Organoide mit einem vorgewärmten Schädling oder einer Pipette mit einer großen Öffnung in die Paraffinblockform in eine Schicht aus flüssigem Paraffin.

Erwärmen Sie eine Seziernadel mit einem Bunsenbrenner und manipulieren Sie alle Organoide so weit wie möglich in Richtung der Mitte der Paraffinblockform. Wenn die Lokalisation der Organoide in der Form zufriedenstellend ist, kühlen Sie die Form leicht, um die Paraffinschicht zu verfestigen. Beenden Sie den Block, indem Sie mehr Paraffin darüber gießen und eine histologische Standard-Einbettungskassette hinzufügen.

In diesem Protokoll wurden Organoide des Darmepithels mit Lentiviren transduziert. Normale Organoide wachsen als K-Krypten-Zottenstrukturen mit einer Reihe von Krypten, die aus einer gemeinsamen Zottendomäne hervorgehen. Bei Behandlung dieser Organoide mit dem GSK-Drei-B-Inhibitor CHIR 9 9 0 21 nimmt die Proliferation zu und die Krypten werden nach der Organoidtransduktion zystisch.

Unter Verwendung der lentiviralen EGFP-Überexpression exprimieren die Organoide fluoreszierende EGFP-Transduktionsverstärkungsschritte, die durchgeführt werden können, wenn die Transduktionswirksamkeit gering ist, wie z. B. eine Inokulation oder eine verlängerte Virusinkubation, die nicht erforderlich sind, da diese Schritte die bereits hohe Wirksamkeit nicht erhöhen. Anschließend werden diese Organoide für RNA-Techniken und Immunhistochemie aufbereitet. Dieses repräsentative Bild ist ein Schnitt eines Darmorganoids der Maus, das nach einer Stunde langen Inkubation mit BRDU vor der Fixierung auf BRDU gefärbt wurde.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Organoide aus dem primären Darmepithel mit lentiviralen oder retroviralen Partikeln transduziert.