Name: Genomweite Snapshot von Chromatin Regulierungsbehörden und Staaten in Xenopus Embryonen von ChIP-Seq (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Erfahren Sie, wie ChIP-Seq zur Kartierung chromatinassoziierter Proteine in Xenopus-Embryonen eingesetzt wird. Diese Methode ermöglicht genomweite Einblicke in frühe Entwicklungsprozesse und Genregulation.

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Wir danken Chris Benner für die Implementierung des X. tropicalis-Genoms (xenTro2, xenTro2r) in HOMER und dem Gilchrist-Labor für Diskussionen über die Post-Sequencing-Analyse. I.P. hat die GO-Term-Analyse unterstützt. G.E.G und J.C.S. wurden vom Wellcome Trust unterstützt und werden nun vom Medical Research Council (Programmnummer U117597140) unterstützt.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Unser Protokoll beschreibt, wie zu machen und zu analysieren, genomweite Chromatin Profile Xenopus-Embryonen. Es umfasst alle Schritte von vernetzenden Proteinen an endogenen Loci in vivo auf die Verarbeitung Millionen liest, die angereicherten genomische Websites in silico. Da immer mehr Genom Entwürfe zur Verfügung stehen, sollte dieses Protokoll auf andere Modell und nicht-Modellorganismen sein. Die wichtigsten experimentellen Teil, der dieses Protokoll von bisherigen Arbeit 8,31,33,34 stellt, ist die nach der Fixierung vor, um vernetzte Kerne zu extrahieren. Es ermöglicht die effiziente Chromatin Solubilisierung und Scher und einfach Upscaling. Zusammen mit verbesserten Wirkungsgraden von Bibliothek Vorbereitung dieses Protokoll erlaubt den Aufbau hochkomplexe ChIP-Seq-Bibliotheken von eineinhalb bis zwei Millionen Zellen der Chromatin-assoziierte Epitop von Interesse exprimieren. Für ChIP-qPCR-Experimente, einige zehntausend dieser Zellen sind in der Regel genug,für DNA Bereicherung auf vielleicht sechs verschiedenen genomischen Loci zu überprüfen. Diese Zahlen sind vorsichtige Schätzungen, kann aber je nach Expressionsniveau Protein, Antikörper Qualität abhängig, Vernetzungseffizienz und Epitop Zugänglichkeit. Als Richtwert ca. 4000 Zellen in der Mitte Blastulastadium (8,5 nach Nieuwkoop und Faber 29) enthält eine einzige Xenopus Embryo, 40.000 Zellen in der späten Gastrula-Stadium (12) und 100.000 Zellen in einem frühen Schwanzknospe Bühne (20). Die exakte Fixierung Zeit für eine effiziente Immunfällung muss empirisch durch ChIP-qPCR (§ 10) ermittelt werden. Im allgemeinen werden mehr Fixierungszeiten benötigt, wenn das Experiment beinhaltet X. laevis Embryonen frühen Entwicklungsstadien, und schwach (oder indirekte) DNA-Bindungseigenschaften. Es wird jedoch nicht empfohlen Befestigungs Xenopus Embryonen länger als 40 Minuten, oder Verarbeitung mehr Embryonen als angegeben (Abschnitt 3), Chromatin Scher wird weniger effizient. Es ist wichtig,jede Glycin nach der Fixierung als dieser gemeinsamen Schritt zum Abschrecken Formaldehyd Kernentnahme aus dotterreichen Embryonen sehr schwierig machen zu verwenden. Derzeit ist der Grund hierfür nicht bekannt. Es ist denkbar, dass die Formaldehyd-Glycin-Addukt ferner mit N-terminalen Amino-Gruppen oder Argininresten 35 reagiert. Der Antikörper ist der Schlüssel für ein Chip-Experiment und ausreichende Kontrollen müssen durchgeführt, um ihre Spezifität für das Epitop von Interesse zeigen werden (siehe Richtlinien Landt et al. 36). Wenn kein ChIP Grade Antikörper verfügbar ist, kann die Einführung von entsprechenden Epitop markierte Fusionsproteine ​​eine legitime Alternative sein, da diese Proteine ​​Bindungsstellen besetzen 37 endogen. In diesem Fall sind nicht injizierten Embryonen am besten, als negative Kontrolle eher als ein Chip mit unspezifischen Serum zu verwenden. Diese Strategie kann auch angewendet werden, wenn das Protein von Interesse auf einem niedrigen Niveau, was zu der schlechten Rückgewinnung des enri ausdrückenched DNA. Als zur Herstellung ChIP-Seq Bibliotheken, wegen der geringen Menge an DNA, im Gebrauch, ist es empfehlenswert, für Verfahren, die die Anzahl der Reinigungsschritte zu verringern und um eine Reaktion zu kombinieren, um den Verlust von DNA auf ein Minimum zu entscheiden. Die Adapter und Grundierungen müssen mit Multiplex-Sequenzierung und der NGS-Plattform kompatibel sind (siehe Tabelle der spezifischen Materialien / Geräte). Bei der Verwendung von Y-Adaptern (mit langen Einzelstrang-Arme), ist es wichtig vor, verstärken die Bibliothek drei bis fünf PCR-Runden vor size-Auswahl DNA-Insertionen (z. B. 100 bis 300 bp) durch Gelelektrophorese. Einzelsträngigen Enden verursachen DNA Fragmente heterogen migrieren. Testläufe mit verschiedenen Mengen an Ausgangs-DNA (zB 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10 und 20 ng) werden empfohlen, um die Gesamtzahl der PCR-Zyklen zu bestimmen (weniger als oder gleich 18 Zyklen) erforderlich, um eine Größe zu machen -Ausgewählte Bibliothek von 100 bis 200 ng. Verringerung der Anzahl der PCR-Zyklen macht die Sequenzierung redundant liest weniger wahrscheinlich. Die Festphasen-reversible Immobilisierung Perlen sind gute Reinigung Reagenzien zur effizienten Wiederherstellung der DNA von Interesse und zuverlässig entfernen Sie alle freien Adaptern und Dimere von Ligation und PCR-Reaktionen. In Bezug auf die Anzahl, Art und Länge der liest, um 20 bis 30 Millionen Single-End liest von 36 bp ist genug für die meisten ChIP-Seq-Experimente, die ganze Xenopus Genom mit ausreichender Tiefe zu decken. Die häufigsten NGS Maschinen sind routinemäßig in der Lage, die diese Kriterien erfüllen. Es kann jedoch von Vorteil sein, um die Anzahl zu erhöhen der liest, wenn eine breite Verteilung der liest wird erwartet, da mit Histon-Modifikationen zu beobachten, anstatt scharfe Spitzen. Für viele ChIP-Seq Experimenten 4 bis 5 unterschiedlich indizierten Bibliotheken gepoolt und in einer Durchflusszelle Fahrspur unter Verwendung einer Hochleistungsmaschine NGS sequenziert werden. Manchmal ist auch ratsam, die Lese Länge und Sequenz an beiden Enden der DNA-Vorlage (Paired-End), um Abbildbarkeit w erhöhen verlängernHenne Analyse Chromatin innerhalb repetitiven genomischen Regionen. Dieses Protokoll wurde erfolgreich in einer Vielzahl von Chromatin Funktionen wie Transkriptionsfaktoren, Signalmediatoren und posttranslationale Histonmodifizierungen aufgebracht. Allerdings Embryonen gewinnen einen zunehmenden Grad an zellulärer Heterogenität, wie sie sich entwickeln und Chromatin-Profile schwerer zu interpretieren. Erste Schritte auf in Arabidopsis und Drosophila gewebsspezifisch Profil Chromatin Landschaften durch Extrahieren zelltypspezifische Kerne 38,39 erzielt. Unser Protokoll umfasst eine Kernextraktionsschritt, der den Weg für die gewebespezifische ChIP-Seq anderer Embryonen bahnen könnte.

Die ersten Versuche, Protein-DNA-Wechselwirkungen in vivo zu charakterisieren, wurden vor etwa 30 Jahren berichtet, um die RNA-Polymerase-vermittelte Gentranskription in Bakterien und in der Fruchtfliege zu verstehen1,2. Seitdem hat sich die Verwendung von Immunpräzipitation zur Anreicherung unterschiedlicher Chromatinmerkmale (ChIP) weit verbreitet, um Bindungsereignisse und Chromatinzustände mit hoher Effizienz zu erfassen3. Mit dem Aufkommen leistungsfähiger Microarray-Technologien führte diese Methode zur Charakterisierung genomweiter Chromatinlandschaften4. In jüngster Zeit ist das Chromatin-Profiling noch umfassender und hochauflösender geworden, da nun Millionen von co-immunpräzipitierten DNA-Templates parallel sequenziert und auf das Genom abgebildet werden können (ChIP-Seq)5. Da immer mehr Genomassemblierungen zur Verfügung stehen, ist ChIP-Seq ein attraktiver Ansatz, um mehr über die Genomregulation zu erfahren, die biologischen Prozessen zugrunde liegt. 
Hier stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, um ChIP-Seq an dotterreichen Embryonen wie denen des Frosches Xenopus durchzuführen. Entwürfe der Genome der beiden weit verbreiteten Xenopus-Arten – X. tropicalis und X. laevis – wurden jetzt vom International Xenopus Genome Consortiumveröffentlicht 6. Die Embryonen von Xenopus-Spezies weisen viele wünschenswerte Merkmale auf, die die Interpretation genomweiter Chromatinstudien erleichtern und ermöglichen, einschließlich der Produktion einer großen Anzahl hochwertiger Embryonen, der Größe der Embryonen selbst und ihrer äußeren Entwicklung. Darüber hinaus sind die Embryonen für klassische und neuartige Manipulationen wie die Rückverfolgung der Zelllinie, die In-situ-Hybridisierung des gesamten Mounts, die RNA-Überexpression und die TALEN/CRISPR-vermittelte Knockout-Technologie zugänglich.
Das folgende Protokoll baut auf der Arbeit von Lee et al., Blythe et al. und Gentsch et al. auf. 7-9. Kurz gesagt, Xenopus-Embryonen werden in der interessierenden Entwicklungsphase formaldehydfixiert, um Proteine kovalent an ihre assoziierte genomische DNA zu binden (zu vernetzen). Nach der Kernextraktion wird das vernetzte Chromatin fragmentiert, um die nachfolgende Sequenzierung auf spezifische genomische Bindungs- oder Modifikationsstellen zu konzentrieren und die Beiträge flankierender DNA-Sequenzen zu minimieren. Anschließend werden die Chromatinfragmente mit einem Antikörper in ChIP-Qualität immunpräzipitiert, um diejenigen anzureichern, die das interessierende Protein enthalten. Die co-immunpräzipitierte DNA wird vom Protein abgestreift und gereinigt, bevor eine indizierte (gepaarte) Bibliothek für das Next-Generation-Sequencing (NGS) erstellt wird. Am Ende werden einfache Kommandozeilen für die Post-Sequencing-Analyse von ChIP-Seq-Daten angeboten.

<table><tbody><tr><td>1/16 Zoll konisches Microtip</td><td>Qsonica</td><td>4417</td><td>Dieses Microtip ist kompatibel mit dem Sonicator 3000 von Misonix und Q500/700 von Qsonica.</td></tr><tr><td>8 ml Probenfläschchen aus Glas mit Kappe</td><td>Wheaton</td><td>224884</td><td>8 ml Probenfläschchen aus Klarglas für wässrige Proben mit Schraubkappen der Größe 15-425, die mit Phenolkautschuk ausgekleidet sind.</td></tr><tr><td>Adapter</td><td>z.B. IDT oder Sigma</td><td>NA</td><td>TruSeq Universaladapter, 
AATGATACGGCGACCGAG 
ATCTACACTCTTTCCCTACAC 
GACGCTCTTCCGATC*T. TruSeq-indizierter Adapter, 
P-GATCGGAAGAGCACACGTC 
TGAACTCCAGTCAC &#8208; NNNNNN&#8208; 
ATCTCGTATGCCGTCT TCTGCTT*G. *, Phosphorthioat-Bondphosphatgruppe bei 5' Ende. NNNNNNN, Index (siehe TruSeq ChIP Sample Preparation Guide für die DNA-Sequenz). Adapter HPLC gereinigt bestellen. Adapter können durch Kombination von äquimolaren Mengen (je 100 &#181; M) des Universaladapters und des indexierten Adapters und kühlt sie langsam von 95 &#176 ab; C auf Raumtemperatur. Verwenden Sie 1,5 pmol pro ng Eingangs-DNA. Bei -20 &#176;C lagern.</td></tr><tr><td>b2g4pipe (Software)</td><td>Blast2GO</td><td>nicht-kommerziell</td><td>http://www.blast2go.com/data/blast2go/b2g4pipe_v2.5.zip</td></tr><tr><td>BLAST+ (Software)</td><td>Camacho et al.</td><td>nicht-kommerzielle</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastDocs&amp; DOC_TYPE=Download</td></tr><tr><td>Bowtie (Software)</td><td>Langmead et al.</td><td>nicht-kommerzielle</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml</td></tr><tr><td>cisFinder (Software)</td><td>Sharov et al.</td><td>nicht-kommerzieller</td><td>http://lgsun.grc.nia.nih.gov/CisFinder/</td></tr> <tr><td>Chip für Kapillarelektrophorese</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1504</td><td>Laden Sie diesen Chip mit 1 &micro; l DNA für die Qualitätskontrolle von Bibliotheken. Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Chipbasiertes Kapillarelektrophorese-System</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td>Der Agilent 2100 BioAnalyzer wird zur Überprüfung der Qualität von ChIP-Seq-Bibliotheken eingesetzt. Halten Sie die Reagenzien bei 4 °C.</td></tr><tr><td>ChIP-Seq-Bibliotheksvorbereitungskit (KAPA Hyper Prep Kit)</td><td>Das Kapa Biosystems</td><td>KK8504</td><td>Kit enthält KAPA End Repair und A-Tailing Enzyme Mix, End Repair und A-Tailing Puffer, DNA-Ligase, Ligationspuffer, KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) und KAPA Library Amplification Primer Mix (10X) (siehe auch PCR-Primer). Adapter sind nicht im Lieferumfang enthalten. Bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>ChIP-Seq-Bibliotheksvorbereitungskit (Alternative, ThruPLEX-FD Prep Kit)</td><td>Das Rubicon Genomics</td><td>R40048</td><td>Kit verwendet eigene Stem-Loop-Adapter und Primer. Dieses Kit eliminiert Zwischenreinigungsschritte und ist genauso empfindlich wie das KAPA Hyper Prep Kit. Bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>Cluster3 (software)</td><td>de Hoon et al.</td><td>nicht-kommerzielles</td><td>http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster</td></tr><tr><td>FastQC (Software)</td><td>Simon Andrews</td><td>nicht-kommerzielles</td><td>http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc</td></tr><tr><td>Fluorometer</td><td>life technologies</td><td>Q32866</td><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td></tr><tr><td>Fluorometer</td><td>Reagenzien life</td><td>technologies Q32851</td><td>Das Kit enthält ein konzentriertes Assay-Reagenz, einen Verdünnungspuffer und vorverdünnte DNA-Standards für das Qubit Fluorometer. Lagern Sie DNA-Standards bei 4 Grad; C, puffern und bei Raumtemperatur färben.</td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma</td><td>F8775-4X25ML</td><td>Formaldehydlösung, für die Molekularbiologie, 36,5-38% in H2O, stabilisiert mit 10-15% Methanol. Bei Raumtemperatur lagern. ACHTUNG: Formaldehyd ist ätzend und hochgiftig.</td></tr><tr><td>Gel (E-Gel EX Agarose, 2%)</td><td>life technologies</td><td>G4010</td><td>Vorgegossenes Gel mit 11 Vertiefungen, aufklappbares Format. Lassen Sie eine Spur zwischen Leiter und Bibliothek leer, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Lagern Sie Gele bei Raumtemperatur.</td></tr><tr>Technologien <td>für die Lebensdauer</td> <td>des Gelelektrophoresesystems</td><td>G6465</td><td>E-Gel iBase und E-Gel Safe Imager Kombi-Kit zur Größenauswahl von ChIP-Seq-Bibliotheken.</td></tr><tr><td>Gel-Extraktionskit</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>Lagern Sie alle Reagenzien bei Raumtemperatur. Verwenden Sie 500 & micro; l QG-Puffer pro 100 mg 2% Agarose-Gelscheibe zur Extraktion von DNA. Verwenden Sie MinElute-Säulen (aus dem MinElute PCR-Aufreinigungskit), um DNA zweimal zu eluieren.</td></tr><tr><td>HOMER (Software)</td><td>Chris Benner</td><td>nicht-kommerzieller</td><td>http://homer.salk.edu/homer/index.html</td></tr><tr><td>Hybridisierungsofen</td><td>Techne</td><td>FHB1D</td><td>Hybridizer HB-1D</td></tr><tr><td>IGV (Software)</td><td>Robinson et al.</td><td>nicht-kommerzieller</td><td>http://www.broadinstitute.org/igv/home</td></tr><tr><td>Illumina CASAVA-1.8 Qualitätsfilter (Software)</td><td>Assaf Gordon</td><td>nicht-kommerzieller</td><td>http://cancan.cshl.edu/labmembers/gordon/fastq_illumina_filter</td></tr><tr><td>Java TreeView (Software)</td><td>Alok Saldanha</td><td>nicht-kommerzieller</td><td>http://jtreeview.sourceforge.net</td></tr><tr><td>Laborbuchse</td><td>Edu-Lab</td><td>CH0642</td><td>Diese Buchse wird verwendet, um die Probe im Schallgehäuse für die Beschallung anzuheben.</td></tr><tr><td>Leiter, 100 bp</td><td>New England BioLabs</td><td>N3231</td><td>1x Lösung bei Raumtemperatur aufbewahren. Lagerbestand bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>Leiter, 1 kb</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232</td><td>1x Lösung bei Raumtemperatur aufbewahren. Lagerbestand bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Retention</td><td>life technologies</td><td>AM12450</td><td>antihaftbeschichtete, RNase-freie Mikrofuge-Röhrchen, 1,5 ml</td></tr><tr><td>MACS2 (Software)</td><td>Tao Liu</td><td>nicht-kommerzielles</td><td>https://github.com/taoliu/MACS</td></tr><tr><td>Magnetische Beads</td><td>life technologies</td><td>11201D</td><td>Diese Dynabeads sind superparamagnetische Kügelchen mit affinitätsgereinigtem, polyklonalem Schaf-Anti-Maus-IgG, das kovalent an die Bead-Oberfläche gebunden ist. Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Magnetische Kügelchen</td><td>life technologies</td><td>11203D</td><td>Diese Dynabeads sind superparamagnetische Kügelchen mit affinitätsgereinigtem, polyklonalem Schaf-Anti-Kaninchen-IgG, das kovalent an die Perlenoberfläche gebunden ist. Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Magnetic Beads</td><td>life</td><td>technologies 10001D</td><td>Diese Dynabeads sind superparamagnetische Kügelchen mit rekombinantem Protein A, das kovalent an die Bead-Oberfläche gebunden ist. Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Magnetic Beads</td><td>life</td><td>technologies 10003D</td><td>Diese Dynabeads sind superparamagnetische Kügelchen mit rekombinantem Protein G, das kovalent an die Bead-Oberfläche gebunden ist. Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Magnetische</td><td>Rack-Lebensdauer-Technologien</td><td>12321D</td><td>DynaMag-2-Magnet</td></tr><tr><td>MEME</td><td>Bailey et al.</td><td>nicht-kommerzielles</td><td>http://meme.nbcr.net/meme/</td></tr> <tr><td>Na3VO4</td><td>New England BioLabs</td><td>P0758</td><td>Natriumorthovanadat (100 mM) ist ein häufig verwendeter allgemeiner Inhibitor für Proteinphosphotyrosylphosphatasen. Bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>NaF</td><td>New England BioLabs</td><td>P0759</td><td>Natriumfluorid (500 mM) wird häufig als allgemeiner Inhibitor von Phosphoseryl- und Phosphothreonylphosphatasen verwendet. Bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>NGS-Gerät</td><td>Illumina</td><td>SY-301-1301</td><td>Genome Analyzer IIx</td></tr><tr><td>NGS-Gerät (hohe Leistung)</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td>HiSeq</td></tr><tr><td>Normales Serum (Antikörperkontrolle)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2028</td><td>Verwendung als Kontrolle für polyklonale IgG-Antikörper von Ziegen in ChIP-qPCR-Experimenten. Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Normales Serum (Antikörperkontrolle)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2025</td><td>Verwendung als Kontrolle für polyklonale IgG-Antikörper der Maus in ChIP-qPCR-Experimenten. Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Normales Serum (Antikörperkontrolle)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2027</td><td>Verwendung als Kontrolle für polyklonale IgG-Antikörper in Kaninchen in ChIP-qPCR-Experimenten. Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Nukleinsäure-Färbelösung</td><td>iNtRON</td><td>21141</td><td>Verwenden Sie die Nukleinsäure-Färbelösung RedSafe im Verhältnis 1:50.000. Bei Raumtemperatur lagern.</td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma</td><td>O3756-25G</td><td>1-Phenylazo-2-naphthol-6,8-disulfonsäure Dinatriumsalz. Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>PCR-Primer,</td><td>z. B. IDT- oder Sigma-Primer</td><td></td><td>zur Anreicherung von Adapter-ligierten DNA-Fragmenten durch PCR: AATGATACGGCGACCGA*G und CAAGCAGAAGACGGCATACGA*G, Phosphorthioat-Bindung. Grundierungen entworfen von Ethan Ford. Kombinieren Sie Grundierungen bei 5 & Mikro; M jeweils. Verwenden Sie 5 & Mikro; L in einem 50 &Micro; l PCR-Reaktion. Bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>MinElute PCR-Aufreinigungskit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td>für die Aufreinigung von ChIP-qPCR- und Schertestproben. Lagern Sie MinElute-Spin-Säulen bei 4 & Grad; C, alle anderen Puffer und Sammelröhrchen bei Raumtemperatur.</td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1, pH 7,9)</td><td>life technologies</td><td>AM9730</td><td>Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) ist vorgemischt und wird bei einem pH-Wert von 6,6 geliefert. Verwenden Sie den mitgelieferten alkalischen Tris-Puffer, um den pH-Wert auf 7,9 zu erhöhen. Bei 4 °C lagern. ACHTUNG: Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol ist ätzend, hochgiftig und brennbar.</td></tr><tr><td>Primer3 (Software)</td><td>Steve Rozen & Helen Skaletsky</td><td>nicht-kommerzielle</td><td>http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi</td></tr><tr><td>Proteasehemmer Tabletten</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>cOmplete, Mini, EDTA-frei. Verwenden Sie 1 Tablette pro 10 ml. Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Proteasehemmer Tabletten</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>cOmplete, EDTA-frei. Verwenden Sie 1 Tablette pro 50 ml. Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>life technologies</td><td>AM2548</td><td>Proteinase K Lösung (20 & Mikro; g/&micro; l). Bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>life technologies</td><td>12091-039</td><td>RNase A (20 & Mikro; g/&micro; l). Bei Raumtemperatur lagern.</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Stuart</td><td>SB3</td><td>Rotator SB3</td></tr><tr><td>SAMtools (Software)</td><td>Li et al.</td><td>nicht-kommerzielles</td><td>http://samtools.sourceforge.neta</td></tr><tr><td>Reversible Festphasen-Immobilisierungsperlen</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>Die Agencourt AMPure XP-Kügelchen werden verwendet, um die Kontamination von Adapter-Dimeren in ChIP-Seq-Bibliotheken zu minimieren. Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Sonicator 3000</td><td>Misonix/Qsonica</td><td></td><td>Neuere Modelle sind jetzt erhältlich. Q125, Q500 oder Q700 eignen sich alle zum Scheren von vernetztem Chromatin.</td></tr><tr><td>Schallschutzhaube</td><td>Misonix/Qsonica</td><td></td><td>optional: Befolgen Sie die Empfehlung des Herstellers, um die richtige Schallschutzhaube zu erhalten.</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>eppendorf</td><td>22670000</td><td>Thermomixer für 24 x 1,5 mL Röhrchen. Präzise Temperaturregelung von 4 & Grad; C über Raumtemperatur auf 99 °C.</td></tr></tbody></table>

genomweite snapshot von chromatin regulierungsbehörden und staaten in<em&gt; xenopus</em&gt; embryonen von chip-seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Die Rekrutierung von Chromatinregulatoren und die Zuordnung von Chromatinzuständen zu spezifischen genomischen Loci sind entscheidend für Entscheidungen über das Zellschicksal und die Gewebe- und Organbildung während der Entwicklung. Die Bestimmung der Positionen und Konzentrationen solcher Chromatinmerkmale in vivo wird wertvolle Informationen über die räumlich-zeitliche Regulation genomischer Elemente liefern und die Bestrebungen unterstützen, die Entwicklung des embryonalen Gewebes in vitro nachzuahmen. Die am häufigsten verwendete Methode für genomweite und hochauflösende Profilerstellung ist die Chromatin-Immunpräzipitation, gefolgt von der Next-Generation-Sequenzierung (ChIP-Seq). Dieses Protokoll beschreibt, wie dotterreiche Embryonen wie die des Frosches Xenopus für ChIP-Seq-Experimente verarbeitet werden können, und bietet einfache Befehlszeilen für die Analyse nach der Sequenzierung. Aufgrund der hohen Effizienz, mit der das Protokoll Zellkerne aus formaldehydfixiertem Gewebe extrahiert, ermöglicht die Methode ein einfaches Upscaling, um genügend ChIP-Material für ein genomweites Profiling zu erhalten. Unser Protokoll wurde erfolgreich eingesetzt, um verschiedene DNA-bindende Proteine wie Transkriptionsfaktoren, Signalmediatoren, Komponenten der Transkriptionsmaschinerie, Chromatinmodifikatoren und posttranslationale Histonmodifikationen zu kartieren, und zwar in verschiedenen Stadien der Embryogenese. Schließlich sollte dieses Protokoll auf breite Anwendung auf andere Modell- und Nicht-Modellorganismen anwendbar sein, da immer mehr Genomassemblierungen verfügbar werden.

Gleichwertige Ergebnisse liefern wie die hier vorgestellt werden erwartet, wenn das Protokoll wird gut ausgeführt und der Antikörper verwendet wird von ChIP-Grade-Qualität (siehe Diskussion). Dieses Protokoll ermöglicht die Gewinnung von Zellkernen aus Formaldehyd fixierten Xenopus-Embryonen und die effiziente Scher Chromatin durch Beschallung (1A-C). Geschert Chromatin zeigt eine asymmetrische Verteilung von DNA-Fragmenten vor allem im Bereich von 100 bis 1.000 bp und Peaking zwischen 300 und 500 bp (Abbildung 1C). Eine minimale 50 pg von immunpräzipitierten DNA wird benötigt, um erfolgreich zu machen eine indizierte Paired-End ChIP-Seq-Bibliothek mit ähnlich großen DNA-Inserts (Abbildung 2A). Die Bibliothek sollte weitgehend frei von Dimeren Adapter, die auf dem Elektropherogramm bei etwa 120 bp gesehen werden kann. Nach Sequenzierung-durch-Synthese, vorverarbeitet Lesewerte werden in das Genom (Abbildung 2B, C) ​​abgebildet. In einem erfolgreichen Versuch mit <em&gt; X. tropicalis Embryonen liest von 40 bp in der Regel 50 bis 70% der Einendmaschine eindeutig zum Genom Zusammenbau v7.1 mit maximal zwei Fehlpaarungen zugeordnet werden. Während einliest auszurichten ziemlich gleichmßig über das Genom, die Ausrichtung des Chips liest ergibt strangspezifische Anreicherung, die die Chromatinstruktur Merkmal von Interesse flankieren. Dies ist, da alle Fragmente werden von dem 5&#39;-Ende (2C) 25 sequenziert. Die Ausweitung der Ausrichtung in Leserichtung zu einer durchschnittlichen Fragmentgröße ermöglicht exakte Profile für einzelne Chromatin Funktionen wie Transkriptionsfaktor-Bindungsereignisse. Diese DNA-Belegungen erscheinen als Peaks, wenn in IGV oder einem anderen kompatiblen Genom-Browser visualisiert. Peak Anrufern wie MACs verwendet, um den Ort dieser Peaks (3A) zu bestimmen. Auf diese Weise Zehntausende von Bindungsstellen wurden in der X. bestimmt tropicalis-Genoms für die T-Box-Transkriptionsfaktoren wie VEGT 26. ChIP-qPCR Erfahgen sollte die lokale Anreicherung von ChIP-Seq (3B) gefunden zu bestätigen. ChIP-Seq-Experimente erlauben die Erkundung genomweiten Eigenschaften von Chromatin-Funktionen. Beispielsweise kann die Berechnung der Lese- Verteilung über genomischen Elemente wie Transkriptionsstart und Terminationsstellen keine räumliche Bindungspräferenzen rund Gene (3C) zu markieren. Ebenso ist eine Heatmap der Lese Distributionen zu Stoßstellen wird verwendet, um verschiedene Chromatin Features auf einen genomweiten Skala (3D) zu vergleichen. Bestimmte Transkriptionsfaktoren binden DNA sequenzspezifisch. De novo-Motiv-Analyse der genomischen DNA zugrunde liegenden Peaks können diese Art von Informationen, einschließlich Co-angereicherten Motive potentieller Kofaktoren (3E) abzurufen. Die große Mehrheit der Zielgene zeigen DNA-Belegung zu einem niedrigeren und nicht höhere Ebene (3F). Diese Skala freie Funktion scheint recht häufig bei transcription Faktoren und schlägt vor, daß nur ein kleiner Bruchteil der Zielgene sind direkt mit biologischer Relevanz 27,28 geregelt. Die Analyse der angereicherten GO Begriffe oder andere Eigenschaften wie beispielsweise die differentielle Expression von Zielgenen können ferner offenbaren Einblicke in die biologische Funktion des Chromatins Funktion im Xenopus Embryo (Figur 3G). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52535/52535fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Chromatin Immunopräzipitation Verfahren für Xenopus-Embryonen. (A) Die Embryonen sind Formaldehyd fixierten in der Entwicklungsphase von Interesse kovalent binden (vernetzen) alle Proteine ​​mit genomischer DNA assoziiert. Bei der Kerngewinnung (B), wird vernetzt Chromatin fragmentiert, um gezieltere genomischen DNA-Bindung oder Chromatinmodifizierung Websites durch Minimierung der flankierenden DNEine Sequenz (C). Anschließend werden die Chromatin-Fragmente mit einem Chip-Grade-Antikörper immunpräzipitiert zu denen, die das Epitop von Interesse (D) anzureichern. Die co-immunpräzipitiert DNA wird das Protein ausgezogen und vor dem Erstellen der ChIP Fragmentbibliothek für NGS (Abbildung 2) gereinigt (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52535/52535fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. ChIP-Seq Bibliothek Vorbereitung, Sequenzierung-durch-Synthese, die Kartierung und Spitzen Berufung. (A) Das Elektropherogramm zeigt eine gute ChIP-Seq-Bibliothek mit DNA-Matrizen von 250 bis 450 bp. Diese Vorlagen beinhalten die DNA-Insert von Interesse durch die universelle (58 bp) flankiert und die indexierte (63 bp) Adapter. (B) </strong&gt; Millionen von Clustern, wobei jeder Cluster mit identischen Vorlagen sind sequenziert Base für Base in Gegenwart von allen vier Nukleotiden besitzen, reversible, deutliche Fluorophor und identische Kündigungs Eigenschaften. Fluoreszenzbilder werden in Echtzeit verarbeitet werden, um entsprechenden Basen, die letztlich zusammengebaut in liest nennen. (C) nur liest, dass Karte eindeutig dem Xenopus Genom aufbewahrt. Da alle Fragmente werden von dem 5&#39;-Ende sequenziert, zur Kartierung der ChIP liest ergibt strangspezifischen Peaks, die die Chromatinstruktur Merkmal von Interesse flankieren. Dabei Spitzen Anrufer erkennen die Bereicherung durch die Immunpräzipitation stammt und erweitern das heißt zu einer durchschnittlichen Fragmentlänge genau zu lokalisieren Chromatin Funktionen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt = &quot;3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52.535 / 52535fig3highres.jpg&quot; /&gt; Figur 3 Ein Beispiel einer Post Sequenzierung Analyse und Visualisierung von Daten mittels des zygotischen T-Box-Transkriptionsfaktor VEGT (zVegT). Alle Lesezählungen hier dargestellt sind normalisiert auf 10 Millionen eindeutig abgebildet und nichtredundanten liest. (A) Auszug der genomweiten Profil zVegT verbindlich in X. tropicalis Gastrula Embryos (Stadium 11 bis 12,5 nach Nieuwkoop und Faber 29). Jeder Peak, eine Anhäufung von erweiterten liest, stellt eine Bindungsstelle. Diese Spitzen sind durch MACS2 mit einem falschen Discovery Rate (FDR) von weniger als 1% genannt. Jeder MESP-Gens zeigt sehr proximalen und stromauf zVegT Bindung, sondern nur mespa und mespb durch diese Stufe (RNA-Seq-Daten 30) ausgedrückt. (B) DNA Belegungsniveaus zVegT durch ChIP-qPCR an verschiedenen Loci bestimmt (einschließlich eines nicht -gebundenen Region 0,5 kb stromaufwärts von β-Aktin) Konfirm die spezifische Anreicherung von ChIP-Seq gefunden. Ergebnisse für mespa mit Peak genannt (roter Balken) in (A) vergleichen. Die DNA Belegungspegel als Prozentsatz der Eingang für beide, den Chip mit der VEGT Antikörper (polyklonaler Kaninchen-IgG-Isotyp) und dem Chip mit dem Antikörper-Kontrolle (normales Kaninchen IgG) visualisiert. Fehlerbalken geben die Standardabweichung von zwei biologischen Replikaten. (C) METAGENE Analyse zeigt Präferenz zVegT Bindung (Tags über 25 bp klassierten) mit dem Promotor in Bezug auf jede andere Genombereich um und in Gen Körpern. (D) Bewegungsradius zeigt k-Mittelwert Cluster (k = 5) DNA Auslastung der zVegT und Smad2 / Smad3 (ChIP-Seq Daten 31) bezogen auf alle zVegT gebundenen Regionen Gastrulastadium (Tags über 25 bp klassierte). Die Heatmap ist log 2 basiert und bei 5 Tags pro bp zentriert. (E) De-novo-Motiv-Analyse entdeckt die kanonische T-Box-Transkriptionsfaktor-Bindungsmotiv in 38% der zVegT-Regionen gebunden, wenn die zugrunde liegende Motiv Wertung ist auf einer Entdeckungsrate von 5% im Hintergrund Sequenzen. Die Dichte Karte zeigt höchsten Anreicherung für den T-Box-Motiv in der Mitte zVegT Bindungsstellen, wobei die kanonische Smad2 / Smad3 Bindungsmotiv kaum angereichert. (F) Histogramm zeigt DNA Belegungsniveaus zVegT, die für jedes Ziel-Gen berechnet werden von allen Gipfeln (+/- 200 bp) zwischen 5 kb stromaufwärts [-]. und 1 kb stromabwärts [+] der entsprechenden Transkriptionsstartstellen (G) Top 300 Gene, die mit höchsten DNA-Auslastung innerhalb -5 kb und 1 kb sind für biologische Prozesse der frühen Embryonalentwicklung bereichert. Diese GO Begriffe sind im Einklang mit der vermeintlichen Funktion zVegT. Der FDR auf einem zweiseitigen Fisher-Test basiert und für multiples Testen korrigiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a>

Die Frage, wie Chromatin Regulierungsbehörden und Chromatin-Staaten betreffen das Genom in vivo ist der Schlüssel zum Verständnis, wie frühe Zellschicksal Entscheidungen werden in den sich entwickelnden Embryo gemacht. ChIP-Seq-die beliebteste Ansatz zur Chromatin Funktionen auf globaler Ebene, wird hier für Xenopus Embryonen beschrieben untersuchen.

Genomweite Snapshot von Chromatin Regulierungsbehörden und Staaten in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonen von ChIP-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Ziel dieses Verfahrens, allgemein bekannt als ChIP-seq, kurz für Chromatin-Immunpräzipitation, gefolgt von Next Generation Sequencing, ist es, die genomweite Position von Chromatinregulatoren und Chromatinzuständen im Opus-Embryo zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst Zap-Embryonen fixiert und dadurch die DNA-assoziierten Proteine kovalent mit dem Genom verknüpft werden. Als nächstes werden die Zellkerne extrahiert und ihr Chromatin wird durch Beschallung gelöst und geteilt.Zu diesem Zeitpunkt wird das DNA-verknüpfte Protein von Interesse durch Immunpräzipitation und umfangreiches Waschen gereinigt. Der letzte Schritt besteht darin, eine indizierte ChIP-seq-Bibliothek aus den aufgereinigten DNA-Fragmenten zu erstellen. Letztlich werden Millionen von fünf Primzahlen dieser DNA-Fragmente, sogenannte Res, parallel sequenziert, auf das Genom ausgerichtet und auf eine durchschnittliche Fragmentlänge verlängert.Die lokale Anreicherung von res, sogenannten Peaks, wird bestimmt, um alle ortsspezifischen DNA-Belegungen des interessierenden Proteins zu identifizieren und dadurch die Untersuchung seiner genomweiten Eigenschaften zu erweitern. Dieses Protokoll kann also detaillierte Einblicke in die genomweite Chromatinarchitektur von Emus-Embryonen liefern. Es kann möglicherweise auch auf andere Organismen mit sequenzierten Genomen angewendet werden.Beginnen Sie mit den Embryonen der Tat. Details bis zu diesem Punkt sind im Textprotokoll enthalten. Übertragen Sie sie in ein Acht-Milliliter-Glasfläschchen und waschen Sie sie mit 0,01 XMMR.Fixieren Sie die Embryonen nach dem Waschen mit 1%para Formaldehyd und 0,01 XMMR. Lassen Sie den Fix mindestens 15 bis nicht länger als 40 Minuten bei Raumtemperatur einwirken. Beenden Sie die Fixierung, indem Sie die Embryonen dreimal mit kaltem 0,01 XMMR waschen.Verhindern Sie, dass die Embryonen die Oberfläche der Lösung berühren, da die Oberflächenspannung zum Bruch führt. Sobald das Fixiermittel weggespült ist, machen Sie Aliquots von 250 Embryonen in Mikroabfallröhrchen. Hypogewichten Sie dann so viel wie möglich von 0,01 XMMR und fahren Sie mit der Chromatinextraktion fort, um eine Pause einzulegen.Hier setzen die Embryonen 250 Mikroliter kalten HEG-Puffer ein. Sobald sich die Embryonen im Puffer abgesetzt haben, können sie in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Beginnen Sie mit der Homogenisierung der fixierten Embryonen in E one Puffer.Details zum Upscaling und zur Puffervorbereitung finden Sie im Textprotokoll. Nächste Zentrifuge. Die Homogenate bei vier Grad Celsius aspirieren und verwerfen das Sat und suspendieren die Pellets wieder in E eins.Bewahren Sie die Probe erneut 10 Minuten auf Eis auf. Wiederholen Sie die Zentrifugation und diesmal Reese, hängen Sie die Palette in E zwei. Warten Sie 10 Minuten, während das Homogenat auf Eis abkühlt.Wiederholen Sie dann die Zentrifugation erneut, und Reese suspendiert das Pellet in E drei. Dieses Mal, nach dem Abkühlen für weitere 10 Minuten, sollte die Suspension ziemlich transparent erscheinen, da das onische Detergens zu diesem Zeitpunkt den größten Teil der verbleibenden Dotterplättchen löslich macht. Wiederholen Sie nun die Zentrifugation. Andre.Suspendieren Sie die Pellets in ein bis drei Millilitern E three. Falls erforderlich, ziehen Sie mit dem letzten Zentrifugationsschritt alle Pellets von den gewünschten vernetzten Kernen auseinander. Diese Suspension enthält auch Pigmentgranulat und einige verbleibende Dotterplättchen.Diese Granulate und Dotterplättchen werden nach der Beschallung durch Zentrifugation vom Chromatin getrennt. Halten Sie nun die Probe auf Eis und fahren Sie mit der Chromatinfragmentierung fort. Alternativ einrasten und frieren Sie die Probe zur vorübergehenden Lagerung ein.Beginnen Sie damit, die Probe in E drei in ein speziell angefertigtes Styroporröhrchen zu übertragen. Für die Beschallung befestigen Sie das Röhrchen mit einer kurzen Thermometerklemme an einem 800-Milliliter-Becherglas mit Eiswasser, damit es während der Beschallung aufgerufen bleibt. Setzen Sie das Becherglas auf eine Buchse und stellen Sie die Buchse so ein, dass die Spitze des Schalls etwa zwei Drittel des Weges in das Sample eintaucht.Die Beschallungsspitze sollte die Rohrwand nicht berühren. Optimieren Sie die Beschallung, beginnend mit den vom Hersteller empfohlenen Parametern meines Sonic Sonicate 3000, das mit einer 16 Zoll konischen Mikrospitze ausgestattet ist, die insgesamt sieben Minuten beschallt wird. 30 Sekunden am Stück zwischen der Beschallung.Lassen Sie die Probe eine Minute ruhen. Beginnen Sie jede Beschallung mit einer Leistung von eins und steigern Sie sie allmählich auf zwei bis vier. Wenn die Probe zu schäumen beginnt, positionieren Sie das Röhrchen neu und lassen Sie den Schaum abfließen, bevor Sie fortfahren. Nach der Beschallung wird das Chromatin solubilisiert und geschert.Füllen Sie es in die Vorkühlung von 1,5 Millilitern in Mikromüllröhrchen um und zentrifugieren Sie es bei voller Geschwindigkeit. Sammeln Sie das SNA fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius und füllen Sie es in Vorkühlröhren. Entsorgen Sie das Pellet.Verwenden Sie 50 Mikroliter SUP-Natant, um die Fragmentierung visuell zu beurteilen und den Rest für die Immunpräzipitation aufzubewahren. Beginnen Sie damit, 10 bis 30 Mikroliter des Chromatin-SUP in ein neues Röhrchen zu übertragen, das als Eingangsprobe dient. Fügen Sie dann dem verbleibenden Chromatin einen Antikörper in Chipqualität mit einer Geschwindigkeit von etwa einem Mikrogramm pro Million Zellen hinzu.Inkubieren Sie die Chromatin-Antikörperprobe über Nacht, ebenfalls bei vier Grad Celsius, aber mit 10 U/min Rotation. Am nächsten Tag waschen Sie die antikörperkompatiblen Magnetkügelchen in E drei für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Unter Verwendung der vom Hersteller empfohlenen Bead-Konzentration an den gewaschenen Beads zu Antikörper-vorinkubiertem Chromatin Inkubieren bei vier Grad Celsius mit Rotation für weitere vier Stunden.Waschen Sie die Perlen dann mit gekühltem Ripper-Puffer 10 Mal. Verwenden Sie den Magneten 20 bis 30 Sekunden lang, um die Kügelchen zwischen den Wäschen zu trennen. Die Lösung sollte klar sein.Nach den Waschgängen des Ripper-Puffers folgt eine Wäsche mit gekühltem 10-Puffer. Übertragen Sie dann die Kügelchen in einem kleinen Volumen von 10 Puffer in ein neues Röhrchen. Trennen Sie die Kügelchen und entsorgen Sie den restlichen Puffer.Zur Ablösung des immunpräzipitierten Chromatins. Reese hat die Kügelchen in 50 bis 100 Mikroliter SDS-Lösungspuffer gebogen und das Rohr mit einem Thermomischer vortexed. Zentrifugieren Sie dann das Röhrchen 30 Sekunden lang bei voller Geschwindigkeit und sammeln Sie die Snat, die das immunpräzipitierte Chromatineluat enthält.Wiederholen Sie die SDS-Lösung, gehen Sie einmal voran und kombinieren Sie das gesamte Eluat. Fahren Sie dann mit der DNA-Extraktion, dem ChIP-seq, der Bibliotheksvorbereitung und der Sequenzierung der nächsten Generation fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Nach diesem Protokoll zeigt das gemeinsame Chromatin eine asymmetrische Verteilung von DNA-Fragmenten, die hauptsächlich von 100 bis 1000 Basenpaaren reicht und einen Spitzenwert zwischen 300 und 500 Basenpaaren erreicht. Mindestens 50 Pikogramm immunpräzipitierter DNA sind erforderlich, um erfolgreich eine indexgepaarte N ChIP-seq-Bibliothek mit ähnlich großen DNA-Insertionen herzustellen.Die Bibliothek sollte weitgehend frei von Adapterdimeren sein, die auf dem Elektropherogramm bei etwa 120 Basenpaaren zu sehen sind. Durch die Sequenzierung der ChIP-seq-Bibliothek werden Millionen von kurzen DNA-Sequenzen, sogenannte Reads, reduziert. Diese werden dem Genom zugeordnet, während die Eingabelesevorgänge gleichmäßig entlang des Genoms ausgerichtet sind.Die Chip-Reads zeigen strangspezifische Anreicherungen, die das interessierende Chromatinmerkmal flankieren. Die Erweiterung der Ausrichtung in Leserichtung auf eine durchschnittliche Fragmentgröße reduziert die Genauigkeit von Profilen für einzelne Chromatinmerkmale, wie z. B. Bindungsereignisse von Transkriptionsfaktoren. Diese erscheinen als Peaks in einem Genombrowser, wie hier für pflanzlichen Tee im Gastro-Listenstadium von Zenons Tropenembryonen gezeigt.ChIP-seq-Experimente ermöglichen die Erforschung genomweiter Eigenschaften von Chromatinmerkmalen, wie z. B. angereicherte DNA-Sequenzmotive, die den Peaks zugrunde liegen, oder die genontologische Analyse von Genzielen, wie hier gezeigt, die kartierten TDNA-Wechselwirkungen nach ihrer Entwicklung. Diese Methode ebnet den Forschern den Weg, die embryonale Chromatinlandschaft zu erforschen, und zwar sowohl auf einer genomweiten Skala als auch mit einer sehr hohen Auflösung.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Die Differenzierung der ESC deckt sich mit Zelltyp-spezifische Veränderungen in der Struktur und Zusammensetzung des Chromatins. Der Nachweis dieser Veränderungen bietet wertvolle Einblicke in die Mechanismen, die stemcellness und der Zelldifferenzierung zu definieren. Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) stellt eine wertvolle Methode, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen Stammzell-Differenzierung zu sezieren.

Chromatin Immunopräzipitation von humanen embryonalen Stammzellen

Wir zeigen eine Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)-Methode, um Wechselwirkungen zwischen Faktoren bei Gewebe-spezifische Gene während oder nach dem Einsetzen der Gewebe-spezifische Gen-Expression in embryonalen Maus-Gewebe zu identifizieren. Dieses Protokoll sollte allgemein anwendbar für die Untersuchung von Gewebe-spezifische Genaktivierung, wie es während der normalen Embryonalentwicklung auftritt.

Chromatin Immunopräzipitation-Assay für Tissue-spezifische Gene mit Frühzeitige muriner Embryonen

Eine Feinabstimmung Regulation der Gen-Transkription zugrunde liegt, embryonale Zellschicksal Entscheidung. Hier beschreiben wir Immunpräzipitationstests Chromatin verwendet epigenetischen Regulation sowohl der Herz Differenzierung von Stammzellen und kardialen Entwicklung von Mäuseembryos untersuchen.

Epigenetische Regulation der Herz Differenzierung von embryonalen Stammzellen und Gewebe

Hier beschreiben wir eine Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) und ChIP-Seq Bibliothek Vorbereitung Protokoll zum globalen epigenomischen Profile aus Low-Fülle Huhn embryonalen Proben zu generieren.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Protokoll für Low-Fülle embryonalen Proben

Hier beschreiben wir eine optimierte Hochdurchsatz-ChIP-Sequenzierung Protokoll und rechnerische Analysen Pipeline für die Bestimmung der genomweiten Chromatin Zustand Muster von gefrorenen Tumorgewebe und Zell-Linien.

Eine integrierte Plattform für genomweite Kartierung von Chromatin Staaten mit hohem Durchsatz ChIP-Sequenzierung im Tumorgewebe

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für die Erzeugung von hoher Auflösung in Situ Hi-C-Bibliotheken von dicht vor Gastrulation Drosophila Melanogaster inszeniert Embryonen.

Generation der genomweiten Chromatin Konformation Capture Bibliotheken aus dicht inszenierten Anfang Drosophila Embryos

Hier beschreiben wir Methoden zum Ausführen von ChIP-Seq und CARIP-FF, einschließlich der Bibliothek Vorbereitung auf Next Generation Sequencing, global epigenomischen und Chromatin-assoziierter RNA zu generieren-Karten von ES-Zellen.

CARIP-Seq und ChIP-Seq: Methoden zur Ermittlung von Chromatin-assoziierter RNA und Protein-DNA-Wechselwirkungen in embryonale Stammzellen

Diese Methode wurde entwickelt, um der Bildung von PRC2-vermittelten Chromatindomänen in Zelllinien zu folgen, und die Methode kann an viele andere Systeme angepasst werden.

Eine Methode zur Untersuchung der de novo Bildung von Chromatin-Domänen

Eine präzise Bestimmung von Proteinbindungsstellen im genomischen Ist wichtig für das Verständnis der Genregulation. Hier beschreiben wir eine genomische Kartierungsmethode, die chromatinimmunpräzipierte DNA mit Exonukleaseverdauung (ChIP-exo) behandelt, gefolgt von hochdurchsatzhoher Sequenzierung. Diese Methode erkennt Protein-DNA-Wechselwirkungen mit nahezu Base-Pair-Mapping-Auflösung und einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis in Säugetierneuronen.

Hochauflösende Kartierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in Mausstammzell-abgeleiteten Neuronen mit Chromatin-Immunpräzipitation-Exonuklease (ChIP-Exo)

Dieses Protokoll bietet eine optimierte rechnerische Pipeline zur Quantifizierung von naszierenden Enhancer-Transkripten. Durch die Integration von Chromatinzugänglichkeit, Chromatinmerkmal und Transkriptionsdaten ermöglicht es einen genauen Nachweis und eine strangspezifische Analyse der Enhanceraktivität in komplexen intragenen Regionen, während es für Forscher ohne umfangreiche bioinformatische Ausbildung zugänglich bleibt.

Eine computergestützte Pipeline für die Quantifizierung intergener/intragener Enhancer-RNA in embryonalen Stammzellen der Maus

Hier stellen wir ein schnelles und einfaches ATAC-seq-Protokoll vor, das im L4-Stufen-Caenorhabditis elegans-Ganzwurm mit nur 30 μL Wurmpellet implementiert werden kann.

Chromatin-Barriereprofilierung bei ganzen L4-Larven von Caenorhabditis elegans

Erfahren Sie, wie ChIP-Seq zur Kartierung chromatinassoziierter Proteine in Xenopus-Embryonen eingesetzt wird. Diese Methode ermöglicht genomweite Einblicke in frühe Entwicklungsprozesse und Genregulation.

Genomweite Snapshot von Chromatin Regulierungsbehörden und Staaten in

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