Name: Th17 Entzündung Modell Oropharyngeale Candidiasis in immundefizienten Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Erfahren Sie, wie man ein Th17-Entzündungsmodell der oropharyngealen Candidiasis bei immundefizienten Mäusen etabliert. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung T-Zell-vermittelter Immunpathologie bei Candida-Infektionen.

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Wir danken Dr. Helene Bernstein für den Zugang zu ihrem Durchflusszytometer. Wir danken auch der CFAR-Durchflusszytometrie-Einrichtung für die durchflusszytometrischen Dienstleistungen. Dieses Projekt wurde teilweise durch die CTSC-Kernnutzungsfinanzierung und den Zuschuss der STERIS Corporation/University Hospitals-Division of Infectious diseases an PP unterstützt.

HINWEIS: Die Experimente mit Mäusen wurden in Übereinstimmung mit der institutionellen Tierschutzausschusses (IACUC) Richtlinien durchgeführt. 1. Reconstituting der Rag-1 - / - Mäuse, die mit I n vitro kultiviert Th17-Zellen (drei Tage vor der Infektion) <ol><li> Zum Herstellen Th17 Zellen, der Kultur CD4 + CD25- CD44low CD62Lhigh naiven T-Zellen (3 x 104) in U-Boden-Platten mit 96 Vertiefungen allein oder Cokultur sie zusammen mit 3 x 104 CD4 + CD25 + Foxp3 + Treg in Gegenwart löslicher α-CD3 (1 &amp; mgr; g / ml), α-CD28 (2 ug / ml) Antikörper und Antigen-präsentierenden Zellen unter Bedingungen, Th17 (polarisiert mit IL-6 (25 ng / ml), TGF-β (2 ng / ml) , α-IFN-γ (2 ug / ml) und α-IL-4 (2 &amp; mgr; g / ml)) für drei bis vier Tage. HINWEIS: Naive Zellen und T regs wurden mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung sortiert (FACS) eind magnetische Zellisolierungsverfahren und kultiviert wie zuvor 19 bis 22 beschrieben. </li><li> Am Tag 4 nach Resuspendieren der Th17-Zellen mit der Pipette, sammeln sie aus Kulturen und zentrifugieren unter sterilen Bedingungen. <ol><li> Nehmen Sie eine kleine Teilmenge dieser Zellen, um ihre Lebensfähigkeit und zur Phänotypisierung zu untersuchen. Resuspendieren sie in 500 ul RPMI-Medium, fügen Propidiumiodid (200 ng / ml) und eine Bewertung ihrer Rentabilität sofort mittels Durchflusszytometrie. Führen Phänotypisierung mittels Durchflusszytometrie Beurteilung der IL-17A Produktion nach Restimulation (siehe Abschnitt 6.3). </li></ol></li><li> Zentrifuge und wäscht die Hauptmasse der Zellen in sterilem PBS bei 480 × g für 6 Minuten bei 4 ° C in allen Stufen, wenn nicht anders angegeben. </li><li> Verwenden Sie diese Zellen für die adoptive Transfer in 6-8 Wochen alte CD45.2 Rag1 - / - immundefizienten Mäusen. <ol><li> Resuspendieren der Zellen in 1 x 10 7 Zellen / ml Zelldichte mit kaltem sterilem PBS. </li><li> Injizieren 100 ul der Zellen durch intraperitoneal Injektion, unter Verwendung von 25 G Nadeln auf 1 ml Tuberkulin-Spritze, derart, dass eine Maus erhält 1 x 10 6 Zellen. Einige Mäuse PBS oder Th17 Zellen nur zu empfangen, und andere Mäuse Th17 Zellen, co-kultiviert mit Treg-Zellen wurden erhalten. HINWEIS: Führen Sie alle Schritte unter aseptischen Bedingungen. </li></ol></li></ol> 2. Wachsende C. albicans für eine Infektion (einen Tag vor der Infektion) <ol><li> Vor der Inokulation zerstreuen fünf Kolonien der CAF2-1 C. albicans Laborstamm in 100 ul sterilem PBS-Suspension, und fügen Sie die Suspension auf die sterile Brühe. </li><li> Impfen 5 Kolonien der C albicans in 50 ml des Hefe-Stickstoff-Base (YNB ohne Aminosäuren) / Peptone / Dextrose-Broth-Medium und Inkubation in einem Schüttelinkubator bei 30 ° C für 15-18 h bei 130 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Überwachen Sie die Brühe für Bewölkung, denn das ist ein Indiz für das Wachstum des Pilzes. </li></ol> 3. CandidaErnte und Counting-Verfahren (Am Tag der Infektion) <ol><li> Sammeln Sie 10 ml Candida Brühe in 15 ml Tuben. Für größere Volumina, sammeln Candida in 50 ml Tuben. </li><li> Zentrifugieren Blastosporen bei 1900 × g für 5 min bei RT in allen Stufen, wenn nicht anders angegeben. Pellet die Blastosporen durch Zentrifugation, gefolgt von der Entfernung des Überstandes. </li><li> Wenn es mehr als ein Rohr Vereinige die Candida Blastosporen aus mehreren Rohren, Zugabe von sterilem PBS auf die Pellets und Resuspendieren sie in 10 ml PBS für die Zählung. </li><li> Nehmen Sie 20 ul Blastosporen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie 20 ul der 2X Para und Inkubation bei Raumtemperatur für 15-20 min. Zählen Sie die Fest Blastosporen mit dem Hämozytometer unter dem Mikroskop. HINWEIS: Paraformaldehyd ist krebserregend. Öffnen Sie die unverdünnte Lösung nur im Abzug durchführen. </li><li> In der Zwischenzeit wiederholt wenigstens zweimal Waschen der Blastosporen durch Zentrifugieren them in PBS, und Pelletieren der Blastosporen. Halten Sie die Pellets in 15-ml-Röhrchen bei Raumtemperatur, in der ABSL1 Haube, bereit für die Infektion. </li><li> Lassen Sie etwas sterilem PBS bei RT Resuspendieren der Blastosporen für eine Infektion. </li><li> Nach dem Zählen hinzufügen sterilem PBS in die Blastospore Pellet um die Zellzahlen Hefe Blastospore bis 2 x10 8 von Hefezellen / ml einzustellen. Dies ist der Blastosporen Suspension, verwendet, um die Mäuse zu infizieren wird. HINWEIS: Führen Sie alle Schritte unter aseptischen Bedingungen. </li></ol> 4. Mäuse Infektion (3-5 Tage nach der Zellübertragung) HINWEIS: Die Grund Infektion Verfahren durchgeführt wird, wie oben beschrieben, 19,23-25. <ol><li> Wiegen Sie die Rag-1 - / - Mäuse, die PBS oder die Zellen drei Tage zuvor erhalten. </li><li> Berechnen Sie die Dosis des Narkosemitteln mit ihrem Körpergewicht. Anesthetize der Mäuse durch die Verabreichung von Ketamin / Xylazin-Mischung (16,1 mg / ml und 1,6 mg / ml), unter Verwendung von 25 G Nadeln auf 1 ml Tuberkulin-Spritze durch intraperitoneal Injektion. <ol><li> Gabe von 50 &amp; mgr; l pro 10 g Körpergewicht. (Das heißt, 0,8 mg Ketamin und 0,08 mg Xylazin / 10 g Körpergewicht oder 80 mg Ketamin und 8 mg Xylazin pro kg Körpergewicht beziehungsweise). Beachten Sie für toe Prise Reaktion alle 15 min nach der Narkose. HINWEIS: Diese Dosis wird 60-90 min der Anästhesie, die genug für die Infektion Verfahren einzuleiten. </li><li> Übernehmen Sie die Augen Schmiermittel Salbe in den Augen der Mäuse, die Hornhaut vor dem Austrocknen zu verhindern. Da das Auge Schmiermittel kann austrocknen, wiederholen Augen Schmierung alle 45 min. </li></ol></li><li> Injizieren 1 ml Salzlösung (0,9% NaCl) subkutan am Rücken benachbart dem Vorderbein zu Rehydration der Mäuse während der Anästhesie zu helfen. </li><li> Besorgen Sie sich einen neuen, sauberen Käfig. Folgen Sie der Infektion Verfahren eine Maus zu einem Zeitpunkt, indem jede Maus in den neuen Käfig einmal infiziert. Führen Sie die PBS / Schein-Infektion zuerst, und dann auf die Candida-Infektion gro gehenups. </li><li> Nehmen Sie den narkotisierten Maus und öffnen Sie den Mund weit auf, um die Basis der Zunge zeigen. <ol><li> Legen Sie eine 3 mm Durchmesser Wattebausch mit 50 ul PBS oder Blastospore Aussetzung gesättigten, sublingual in der Mundhöhle für 90 min. Drehen Sie die Mäuse alle 15 min vor und zurück zu Staulunge zu vermeiden, sicherstellen, dass die Watte nicht zu bewegen. </li></ol></li><li> Einrichten eines Zeitgebers für jede Maus 90 Minuten von Sham oder Candida Inokulation in der Mundhöhle zu gewährleisten. </li><li> Halten Sie sie in einem Käfig unter der Wärmelampe (4 Meter), und jede Maus auf Hitze Gel-Pads. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Zunge in und von den Zähnen zurückgezogen, um die Zähne zerreißt die Zunge zu vermeiden. </li><li> Am Ende der 90 Minuten, entfernen Sie den Wattebausch aus dem Mund der Maus. Sehen Sie für jede Maus, die aus der Narkose erholen kann früher als 75 Minuten. In einem solchen Fall zu betäuben sie wieder mit Ketamin (40 mg / kg) allein. </li></ol> 5. Beitrag procedure Monitoring (während der 90 Minuten Anästhesie) <ol><li> Verwenden Sie Hitze Gel-Pads während der 90 Minuten Narkose. <ol><li> Um die Körpertemperatur zu halten und zum Ersticken zu vermeiden, darf nicht zulassen, dass Mäuse, um auf den regulären Maiskolben Maus Betten erholen. </li></ol></li><li> Nach der Erholung von der Anästhesie verabreichen zusätzliche 1 ml steriler 0,9% NaCl subkutan an zwei Stellen auf der Rückseite. </li><li> Bleiben Sie auf dem fünf PBS (Schein) geimpft Mäusen pro Käfig. Haus nur 1-2 infizierten Mäusen pro Käfig. </li><li> Füllen Sie das Verfahren Karte mit Initialen jeden Tag nach dem Eingriff zu notieren, die Veränderungen im Körpergewicht, Körperpflege Gewohnheiten und die allgemeine Gesundheit. </li></ol> 6. Die Beurteilung der Entzündung 6.1) Gewichtsverlust <ol><li> Wiegen Sie die Mäuse jeden Tag während der Infektion, beginnend am Tag vor der Infektion Verfahren. HINWEIS: In der Regel werden die immundefizienten Mäuse mit Th17 Zellen und ohne T regs injiziert erliegen 20-30% Gewichtsverlust aufgrund erhöhter Pilzbelastung 19 und verschlimmert die Entzündung. </li></ol> 6.2) Histologie Scoring der Zunge <ol><li> Opfern die Mäuse durch CO 2 Ersticken durch Genickbruch folgte. </li><li> Die Backen öffnen und sezieren die Zunge mit einer Schere und Pinzette. Verwenden stumpfen Pinzette, um den Mund zu halten und mit der Schere erreichen, um den hinteren Teil des Mundes, um das hintere Ende der Zunge einzuschneiden. </li><li> Für immunzytochemische Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) Färbung der Zunge Gewebe, spülen Sie die Zunge Gewebe mit eiskaltem PBS. 5 ml 10% Formalin für 2-3 Zungen und befestigen Sie O / N in 15 ml Tuben. <ol><li> Am nächsten Tag, entfernen Sie das Formalin und tauchen das Gewebe in 5 ml 70% Ethanol, um hyper-Fixierung zu verhindern. Senden Sie sie aus, um kommerziellen Dienst und Paraffineinbettung weiter, Schneiden und Färben von Paraffinschnitten. HINWEIS: Kommerzielle Histologie Service wird verwendet, um diese Schritte durchführen. </li&gt; </ol></li><li> Sobald die Dias aus dem Handels Histologie Service zurück, Grad der Entzündung durch die Beobachtung der Gewebeschnitte unter einem Lichtmikroskop. <ol><li> Score von 0 bis 5, wobei 0 keine Entzündung und 5 die schwerste Entzündungen. Ergebnis der Entzündung mit Tabelle 1. </li></ol></li></ol> 6.3) Zytokin-Produktion von Th17-Zellen HINWEIS: Übermäßiger TNF-α Produktion ist eine der Ablesungen für eine übermäßige Immunpathologie. Wenn Mäuse adoptiv mit Th17 Zellen nur übertragen, verursacht es Immunpathologie, die mit übermäßiger TNF-α-Produktion in Th17-Zellen assoziiert ist. <ol><li> Sammeln Sie eine Einzelzellsuspension aus Milz, Lymphknoten, axillären Lymphknoten, und der Zunge, mit zuvor beschriebenen Verfahren 19,26. </li><li> Restimulieren der Zellen mit Phorbolmyristatacetat (PMA) (50 ng / ml) und Ionomycin (500 ng / ml) für 4 h mit Brefeldin A (10 ug / ml) in der l hinzugefügtast 2 Std. Waschen Sie die Zellen mit PBS und fixieren Sie diese mit einem handelsüblichen Fixierung / Permeabilisierung Kit gemäß Herstellerangaben. </li><li> Führen intrazelluläre Cytokin Färbung mit dem Fluorochrom konjugierten anti-TNF-α, Anti-IL-17A und ROR &amp; ggr; t-Antikörper wie zuvor beschrieben 19. </li><li> Kurz gesagt, die Zellen werden in dem 1X Permeabilisierung Puffer mit dem Cocktail von Anti-TNF-α, Anti-IL-17A und ROR &amp; ggr; t-Antikörper, jedes Antikörpers mit einem 2 - 3 ug / ml Endkonzentration. </li><li> Inkubieren der Zellen für 1 h bei RT. </li><li> Nach der Inkubation, waschen Sie die Zellen mit 1X Permeabilisierung Puffer. </li><li> Zellpellet in 500 ul PBS mit 0,5% Rinderserumalbumin für die Durchflußzytometrie-Analyse. </li></ol>

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<li>Quintin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+NK+cells+against+Candida+albicans+infection+in+immunocompetent+or+immunocompromised+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential role of NK cells against Candida albicans infection in immunocompetent or immunocompromised mice.</a> Eur J Immunol. 44 (8), 2405-2414 (2014).</li>
<li>Ramirez-Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+and+cancer%3A+Can+this+yeast+induce+cancer+development+or+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+In+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida albicans and cancer: Can this yeast induce cancer development or progression.</a> Critical Reviews In Microbiology. , 1-13 (2014).</li>
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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Dieses Modell basiert auf Induktion von oraler C basiert albicans-Infektion abhängig Th17 Entzündung. Wegen der Abwesenheit von regulatorischen T ist die Th17 Zelle induzierte Entzündung ungebremst und führt zu schlecht aufgelöst Immunpathologie. In vitro abgeleitet naiven CD4-Zellen polarisiert Th17 Zellen wurden für die adoptive Übertragung verwendet. 40 bis 50% des gezüchteten CD4 + Zellen zeigen nachweisbare IL-17A-Expression um Tag 3 (Th17-Zellen), und wurden daher für die Inje...

Orale Infektionen und Entzündungen wurden mit Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen in Verbindung gebracht und haben dramatische Auswirkungen auf die allgemeine menschliche Gesundheit2,3. Opportunistische Infektionen und Entzündungen, die durch C. albicans verursacht werden, sind assoziiert mit primären Immundefekten (PID)4,5, entzündlichen Erkrankungen wie Parodontitis 6,7, Sjögren-Syndrom und Speicheldrüsenerkrankungen8,9 sowie dem oralen Plattenepithelkarzinom 10-12. C. albicans ist ein dimorpher kommensaler Pilz, der den Mund von 60% der gesunden Menschen asymptomatisch besiedelt, aber er ist der häufigste Pilzerreger, der Infektionen verursacht, wenn die Wirtsabwehr geschwächt ist13-15. Es verursacht wiederkehrende und chronische Infektionen und Entzündungen bei Patienten mit AIDS und PID sowie bei anderen immungeschwächten Personen. Als Kommensal ist seine Besiedlungslast mit der Veränderung der Diversität des gesamten oralen Mikrobioms verbunden16. Als Erreger verursacht es verschiedene Formen der oropharyngealen Candidiasis wie akute pseudomembranöse, akute atrophische, chronisch atrophische, chronische hypertrophe/hyperplastische und eckige Cheilitis. 
Der Schutz gegen C. albicans wird nicht nur durch die Immunresistenz des Wirts bestimmt, sondern auch durch die Fähigkeit, die Candida-induzierte Immunpathologie angemessen zu kontrollieren. Obwohl Kommensalen wie C. albicans zur Modulation und Verschlimmerung anderer oraler Entzündungszustände beitragen, sind die Mechanismen, durch die Dysbiosen bei opportunistischen Infektionen auftreten, unklar. Neben der bekannten Rolle adaptiver Th17-Zellen bei der Gedächtnisreaktion auf C. albicans17 bleibt ihre Rolle bei der Initiierung und Aufrechterhaltung der Entzündungspathologie bei chronischen Infektionen unklar. Darüber hinaus sind orale entzündliche Erkrankungen wie das Sjögren-Syndrom und die Parodontitis mit der Th17-vermittelten Pathologie assoziiert. Interessanterweise sind diese Erkrankungen auch stark mit häufigen OPC verbunden. Die Wechselwirkungen zwischen Th17-Zellen, der oralen Immunpathologie von OPC und anderen oralen Entzündungskrankheiten sind jedoch nicht untersucht. 
Obwohl Mausmodelle für die primäre und sekundäre Infektion der oralen Candidiasis verfügbar sind, ist ein Mausmodell zur Untersuchung der Candida-Infektions-assoziierten Th17-Entzündung, insbesondere im Zusammenhang mit Immundefizienz, nicht verfügbar. In dieser Studie wird eine Methode zur Feststellung einer oralen Th17-Entzündung im Zusammenhang mit einer oralen Candida-Infektion bei Mäusen vorgestellt. Eine Candida-Infektion bei Mäusen ist gekennzeichnet durch Pilzläsionen, Entzündungen in der Zunge, verminderte Nahrungsaufnahme, Gewichtsverlust und schließlich einen sterbenden Zustand. Die orale Pathologie ähnelt chronischen Candida-Infektionsläsionen sowie epithelialer Dysplasie bei Maus-Mundkrebsmodellen12,18.

<table><tbody><tr><td>CAF-2</td><td>Universität von Pittsburgh (Sarah Gaffen)</td><td>-</td><td>Candida-Kultur</td></tr><tr><td>U-Boden 96 Well-Platten&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>055588</td><td>Wird für die Zellkultur</td></tr><tr><td>von a-CD3&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-0031-85</td><td>Polarisation von Zellen zu Th17-Bedingungen</td></tr><tr><td>a-CD28&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td>Polarisation von Zellen zu Th17-Bedingungen</td></tr><tr><td>m-IL-6</td><td>Bio Basic</td><td>RC232</td><td>Polarisation von Zellen zu Th17-Bedingungen</td></tr><tr><td>h-TGF-b&nbsp;</td><td>Forschung & Forschung D</td><td>240-B</td><td>Polarisation der Zellen auf Th17-Bedingungen</td></tr><tr><td>a-IFN-g&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-7311-85</td><td>Polarisation von Zellen zu Th17-Bedingungen</td></tr><tr><td>a-IL-4&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-7041-85</td><td>Polarisation von Zellen zu Th17-Bedingungen</td></tr><tr><td>&alpha;-IL17A ef660</td><td>eBiosciences</td><td>50-7177-82</td><td>Für Zellkulturen - 1:50</td></tr><tr><td>&alpha;-TNFa-PE-Cy7</td><td>eBiosciences</td><td>25-7423-41</td><td>Für Zellkulturen - 1:100</td></tr><tr><td>&alpha;-RORgt PE&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>12-6981-82</td><td>Wird für Zellkulturen verwendet - 1:50</td></tr><tr><td>YNB ohne Aminosäuren)/Pepton/Dextrose-Bouillon Medium&nbsp;</td><td>Bio Basic</td><td>S507. GRÖSSE</td><td>Mediium für das Candida-Wachstum</td></tr><tr><td>Shaker-Inkubator&nbsp;</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4300</td><td>Inkubationswachstum für Candida</td></tr><tr><td>15 ml Röhrchen</td><td>Bio Basic</td><td>BT888-SY</td><td>Für Zellkulturen und Candida-Wachstum</td></tr><tr><td>50 ml Röhrchen</td><td>Bio Basic</td><td>CT 788-YS</td><td>Für Zellkulturen und Candida-Wachstum</td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>VWR International LLC</td><td>82017-654</td><td>Für die Pelletierung von Candida -900 g</td></tr><tr><td>Allegra Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>392302</td><td>Zellkultur - 480 g</td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorf-Röhrchen</td><td>Bio Basic</td><td>BT620-NS</td><td>Vorbereitung der Endkonzentration von Candida</td></tr><tr><td>2x Paraformaldehyd</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15710</td><td>Fixierung von Candida für die Zählung</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>VWR International LLC</td><td>15170-172</td><td>Zählzellen</td></tr><tr><td>PBS - Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Bio Basic</td><td>PD8117</td><td>Zubereitung von Puffern</td></tr><tr><td>Ketamin/Xylazin &nbsp;</td><td>Case Western Reserve University - Animal Resource Center</td> <td>-</td> <td>Gewonnen aus dem von ARC genehmigten Protokoll für die Anästhesie</td></tr><tr><td>Ophthalmic Lubricant Salbe&nbsp;</td><td></td><td>Allergan-Augensalbe für Tiere zur Vorbeugung von Trockenheit</td><td></td></tr> <tr><td>Kochsalzlösung (0,9 % NaCl)</td><td>G Biosciences</td><td>786-561</td><td>Verabreichung an Tiere zur Vorbeugung von Austrocknung</td></tr><tr><td>Wattebausch mit 3 mm Durchmesser&nbsp;</td><td>VWR International LLC</td><td>BP7603</td><td>3 mm Kugeln für Candida-Infektionen</td></tr><tr><td>Wärmegel-Pads</td><td>Case Western Reserve University - Animal Resource Center</td> <td>-</td> <td>zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur und schnelle Genesung</td></tr><tr><td>Hämatoxylin- und Eosin-Färbung</td><td>Histoserv -</td><td></td> <td>MD-Gewebehistologie</td></tr><tr><td>10% Formalin&nbsp;</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>Wissenschaften JC1111/MC</td><td>Gewebehistologie</td></tr><tr><td>70% Ethanol&nbsp;</td><td>VWR International LLC</td><td>97064-490</td><td>Sterilisationszweck</td></tr><tr><td>PMA - Phorbol 12-Myristat 13-acetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585-1MG</td><td>Restimulation von Zellen</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Life Technologies</td><td>124222 1mg</td><td>Restimulation von Zellen</td></tr><tr><td>Fixierungspermeabilisierungskit</td><td>eBiosciences</td><td>E16913-106</td><td>Fixierung von Zellen für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Tuberkulinspritzen</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td>Mäuseinjektion</td></tr><tr><td>25 G x 3/8 Nadeln</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>Mäuseinjektion</td></tr><tr><td>Rag1 -/- Mäuse</td><td>Jackson Laboratorien</td><td>Best.-Nr.: 002216</td><td>Empfängermäuse</td></tr><tr><td>CD45.1 kongene Mäuse</td><td>Jackson Laboratorien Best</td><td>.-Nr.: 002014&nbsp;</td><td>Spender von Th17-Zellen</td></tr><tr><td>CB17-SCID-Mäuse</td><td>Jackson Laboratories</td><td>Stock-Nr.: 001303</td><td>Empfängermäuse</td></tr><tr><td>Balb/c Mäuse</td><td>Jackson Laboratories</td><td>Stock-Nr.: 000651</td><td>Spender Th17-Zellen</td></tr></tbody></table>

th17 entzündung modell oropharyngeale candidiasis in immundefizienten mäusen

Th17 Inflammation Model of Oropharyngeal Candidiasis in Immunodeficient Mice

Oropharyngeale Candidiasis (OPC) Krankheit wird nicht nur durch das Fehlen einer Immunresistenz des Wirts verursacht, sondern auch durch das Fehlen einer angemessenen Regulation der infektionsinduzierten Immunpathologie. Obwohl Th17-Zellen an der antimykotischen Abwehr beteiligt sind, ist ihre Rolle in der Immunpathologie unklar. In dieser Studie wird eine Methode zur Etablierung der oralen Th17-Immunpathologie im Zusammenhang mit einer oralen Candida-Infektion bei immundefizienten Mäusen vorgestellt. Die Methode basiert auf der Rekonstitution lymphopenischer Mäuse mit in vitro kultivierten Th17-Zellen, gefolgt von einer oralen Infektion mit Candida albicans (C. albicans). Die Ergebnisse zeigen, dass ungezügelte Th17-Zellen zu Entzündungen und Pathologien führen und mit mehreren messbaren Messwerten verbunden sind, einschließlich Gewichtsverlust, proinflammatorische Zytokinproduktion, Zungenhistopathologie und Mortalität, was zeigt, dass dieses Modell bei der Untersuchung der OPC-Immunpathologie wertvoll sein kann. Der adoptive Transfer regulatorischer Zellen (Tregs) kontrolliert und reduziert die Entzündungsreaktion, was zeigt, dass dieses Modell verwendet werden kann, um neue Strategien zu testen, um oralen Entzündungen entgegenzuwirken. Dieses Modell kann auch bei der Untersuchung der oralen Th17-Immunpathologie im Allgemeinen im Zusammenhang mit anderen oralen Erkrankungen anwendbar sein.

In diesem Modell werden sowohl die Candida infizierten Mäusen und nicht-infizierte Mäuse in Rag-1 - / - immundefizienten Hintergrund wurden adoptiv mit Th17 Zellen 3-5 Tage vor der Infektion übertragen. Insgesamt 10-12 Mäuse wurden für die Experimente verwendet, mit 2 Mäuse in jeder Sham infizierten Gruppen und 4-5 in jedem der Candida infizierten Gruppen. Naive Zellen wurden von kongenen Thy1.1 oder CD45.1 Mäusen stammten, damit injiziert Th17 Zellen wurden in vivo unter Verwendung...

Obwohl Candida-Infektionsmodelle zur Verfügung stehen, um die Immunresistenz des Wirts zu untersuchen, fehlt ein Modell zur Untersuchung der T-Zell-vermittelten Immunpathologie im Zusammenhang mit Candida-Infektionen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Etablierung der Th17-Immunpathologie, die mit einer oralen Candida-Infektion bei immundefizienten Mäusen assoziiert ist.

Th17 Entzündung Modell Oropharyngeale Candidiasis in immundefizienten Mäusen

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein Modell einer infektionsabhängigen oralen Entzündung zu entwickeln, die durch pathologische TH17-Zellen vermittelt wird. Dies wird erreicht, indem zunächst TH17-Zellen in immundefiziente Mäuse injiziert werden. Im nächsten Schritt wird der Candida-albicans-Pilz kultiviert, die Blastosporen werden gewonnen und in PBS vorbereitet.Der letzte Schritt besteht darin, die Mäuse oral mit den Blasto-Sporen zu injizieren, um die Proliferation der injizierten TH17-Zellen voranzutreiben und orale Entzündungen auszulösen. Die Ergebnisse zeigen, dass die mit TH17-Zellen behandelten Mäuse an Gewichtsverlust und Zungenentzündung leiden, wie durch Durchflusszytometrie- und immunhistochemische Analysen der Zunge nachgewiesen wurde. Die Implikationen dieser Technik reichen daher bis hin zur oralen Immuntherapie, da dieses Mausmodell entsprechende Ansatzpunkte bietet.Das TH17-Entzündungsmodell kann auch verwendet werden, um TH17-vermittelte Entzündungen im Kontext anderer oraler Erkrankungen zu untersuchen, was zeigt, dass das Verfahren mir und dem vaskulären Stickstoff sowie einem Postdoktoranden in meinem Labor dienen wird. Für dieses Verfahren werden faktsortierte naive T-Zellen und optional Treg-Zellen benötigt, um eine Kultur von TH17-Zellen aus CD4-positiven, CD44-niedrigen, CD62L-hohen, CD25-negativen, naiven T-Zellen in UBO-96-Well-Platten mit 30.000 Zellen pro Vertiefung unter TH17-Bedingungen über drei bis vier Tage zu etablieren. Als Kontrolle können naive T-Zellen zusammen mit 30.000 CD4-positiven, CD25-positiven, FOXP3-positiven Treg-Zellen unter denselben Kulturbedingungen kultiviert werden, um TH17-Zellen zu erzeugen. Nach vier Tagen Kultivierung werden die TH17-Zellen mittels Pipette gesammelt.Stellen Sie eine kleine Aliquotprobe beiseite, um ihre Lebensfähigkeit zu überprüfen. Suspendieren Sie diese Zellen in einem halben Milliliter RPMI und geben Sie 100 Nanogramm Propidiumjodid hinzu. Für die Fax-Analyse werden der Hauptteil der Zellen geerntet und für die Zellinjektion vorbereitet.Der Hauptteil der Zellen sollte in PBS gewaschen und anschließend zentrifugiert werden, um sie für die Injektion in die Mäuse vorzubereiten. Injizieren Sie die Mäuse mit 100 Mikrolitern der Zellsuspension intraperitoneal mittels einer 25-Gauge-Nadel, wobei die Zellsuspension 10 Millionen Zellen pro Milliliter in kaltem PBS enthalten sollte. Andere Mäuse sollten mit PBS oder mit kontrollierten TH-17-Treg-Kokulturzellen injiziert werden. Die Infektion der Mäuse mit C. albicans ist drei bis fünf Tage später geplant, am Tag davor.Um die Mäuse mit C albicans zu infizieren, dispergieren Sie fünf Kolonien des CAF2-1-Lab-Stamms in 100 Mikroliter steriler PBS und geben die Suspension zu 20 Milliliter steriler Brühe hinzu. Lassen Sie das beimpfte Medium über Nacht bei 30 Grad Celsius mit 130 U/min Schütteln wachsen. Am nächsten Tag entnehmen Sie 10 Milliliter der Kultur in ein 15-Milliliter-Gefäß und zentrifugieren anschließend das Eloqua fünf Minuten bei 1900 ×g.Bei Raumtemperatur enth&auml;lt das Pellet die Blastosporen, und das Sediment sollte verworfen werden. Vereinigen Sie alle gesammelten Blastosporen in 10 Milliliter steriler PBS und &uuml;bertragen Sie 20 Mikroliter Eloqua in ein Mikrozentrifugenr&ouml;hrchen. Geben Sie 20 Mikroliter zwei XPFA zum Eloqua hinzu und z&auml;hlen Sie w&auml;hrend der Fixierungszeit von 15 bis 20 Minuten die Blastosporen mit einem H&auml;mocytometer.Waschen Sie den Großteil der Blastosporen mindestens zwei weitere Male mit PBS. Lagern Sie die Blastosporen-Pellets in einer AB SL One-Werkbank bei Raumtemperatur, bis die Zellzahl bekannt ist. Anschließend resuspendieren Sie die Blastosporen in PBS bei Raumtemperatur auf eine Konzentration von 200 Millionen Zellen pro Milliliter.Halten Sie die Zellen bereit, um die Mäuse zu infizieren. Diese Methode wurde bereits früher überprüft, wird aber in diesem Abschnitt kurz erneut behandelt. Zunächst anästhesieren Sie die Mäuse, bestätigen deren anästhesierten Zustand und tragen Augensalbe auf.Die Anwendung sollte nach 45 Minuten wiederholt werden. Danach subkutan. Injizieren Sie einen Milliliter Kochsalzlösung zur Flüssigkeitszufuhr, wobei Sie jeweils ein Maus individuell behandeln.Infizieren Sie zuerst die Sham-Gruppe und anschließend die Candida-Gruppe. Bereiten Sie einen Baumwollbausch mit drei Millimeter Durchmesser vor, indem Sie ihn mit 50 Mikrolitern PBS oder Blastosporen-Suspension sättigen. Anschließend den Zungenansatz freilegen und den Baumwollbausch dort platzieren.Stellen Sie sicher, dass die Zunge nach innen zurückgezogen und von den Zähnen weg ist, damit sie nicht verletzt wird. Danach überführen Sie die Maus in ihren eigenen Erholungskäfig auf eine Wärmeunterlage. Maisstängel-Einstreu sollte im Käfig nicht verwendet werden, da sonst die Wärmeunterlage nicht ausreichend Wärme abgibt. Vier Fuß über der Position der Erholungskäfige sollte eine Wärmelampe angebracht werden.Der Wattebausch muss 90 Minuten lang an Ort und Stelle bleiben. Jede Maus sollte über einen eigenen 90-Minuten-Countdown-Timer verfügen. Während dieser Zeit sollte jede Maus alle 15 Minuten von einer Seite auf die andere gedreht werden, um Lungenstauung zu verhindern.Der entscheidende Schritt des gesamten Verfahrens besteht also darin, sicherzustellen, dass der Wattebausch während der gesamten Inokulationszeit an seinem Platz bleibt. Falls eine Maus vorzeitig aus der Narkose aufwacht, sollte sie ausschließlich mit Ketamin erneut narkotisiert werden. Nach 90 Minuten entfernen Sie den Wattebausch und beobachten die Erholung des Tieres.Nach der Genesung verabreichen Sie an zwei Stellen des Rückens jeweils ein zusätzliches Milliliter Kochsalzlösung zur besseren Flüssigkeitszufuhr. Nach dem Eingriff können bis zu fünf sham-inokulierte Mäuse einen Käfig teilen, wobei naive T-Zellen aus Schenkel 1.1- oder CD 45.1-Mäusen verwendet werden. Das beschriebene Verfahren wurde befolgt, und die injizierten T-Zellen wurden mittels ihrer jeweiligen Marker verfolgt.Co-Transfer-Tregs wurden aus CD 45,2-Mäusen gewonnen und ebenfalls ausschließlich durch diesen Marker verfolgt. Die mit Candida infizierten Mäuse zeigten eine Rekrutierung und Expansion der injizierten TH-17-Zellen. Nach der Infektion wurde der Gewichtsverlust dokumentiert.Die Mäuse, die nur mit TH17-Zellen injiziert wurden, verloren kontinuierlich an Gewicht, und einige mussten euthanasiert werden. Dagegen stoppte der Gewichtsverlust in den anderen Gruppen letztendlich. Mäuse, die mit der Treg-Kokultur injiziert wurden, wiesen vier Tage nach der Infektion deutlich weniger TNF-alpha-produzierende Zellen auf.Das anhaltende Vorhandensein von TNF-alpha-produzierenden Zellen zeigt, dass die nur mit TH17-Zellen behandelten Mäuse ungelöste Infektionen und Entzündungen aufwiesen. Die Zungen der mit Tregs behandelten Mäuse wiesen zum gleichen Zeitpunkt deutlich weniger entzündliche Infiltrate und geringeres Pilzwachstum auf. Das anhaltende Vorhandensein entzündlicher Infiltrate zeigt, dass die nur mit TH17-Zellen behandelten Mäuse ungelöste Infektionen und Entzündungen hatten. Sobald die Technik beherrscht ist, kann diese Infektionsmethode innerhalb von drei Stunden für vier Mäuse durchgeführt werden, zuzüglich 15 Minuten pro weiterem zu infizierendem Tier.

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