Automatisierte Quantifizierung Hämatopoetische Zell - Stromal Cell Interactions in histologische Bilder unentkalkte Knochen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Assoziationen zwischen bestimmten Zelluntergruppen im Knochenmark zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst histologische Kryoschnitte von Femurtumoren der Maus entnommen werden. Im zweiten Schritt werden die Schnitte für die Immunfluoreszenzanalyse gefärbt und konfokale Bilder aufgenommen.

Anschließend werden die Bilder digital analysiert. Letztendlich können die Positionen der verschiedenen Zelltypen simuliert werden, um die Raten und die Häufigkeit des Kontakts zwischen den spezifischen immunologischen Zellen von Interesse und ihrer Mikroumgebung zu berechnen. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir Mikroumgebungsnischen für langlebige Plasmazellen im Knochenmark analysierten, und wir brauchten eine Methode, um die zellulären Assoziationen im Knochenmarkgewebe eindeutig zu quantifizieren.

RA Maya demonstriert Ihnen das Verfahren zur Kryo-Absaugung von Oberschenkelknochen von einer erwachsenen Maus. Stellen Sie zunächst die Proben- und Klingentemperatur eines Standardmikrotoms, das mit einer Hartgewebeklinge ausgestattet ist, auf minus 24 Grad Celsius ein. Nach einer 15-minütigen Eingewöhnung.

Befestigen Sie einen Probenblock mit Kryo-Einbettmedium am metallischen Probenhalter und passen Sie die Ausrichtung des Blocks nach Bedarf an. Trimmen Sie die Probe, bis der Knochen vollständig geöffnet ist und das Knochenmark sichtbar ist. Stellen Sie dann die Dicke eines Abschnitts auf sieben Mikrometer ein.

Befestigen Sie als Nächstes ein Stück Kawamoto-Klebeband mit der klebrigen Seite auf der Oberseite eines Probenblocks, indem Sie die Probe mit einem lieben lederbezogenen Holzspatel durchschneiden und mit einer Pinzette verwenden. Drehen Sie das Klebeband so, dass der Abschnitt auf der Oberseite positioniert ist. Übertragen Sie dann das Klebeband auf einen Objektträger aus Glasmikroskop.

Befestigen Sie das Klebeband mit Klebeband an der Glasschiene, wenn der letzte Abschnitt eingesammelt wurde. Lassen Sie die Proben mindestens 30 Minuten fahren und lagern Sie die Objektträger bei minus 80 Grad Celsius. Zwei Frauen bilden die Proben ab, färben die aufgetauten Kryoschnitte nach gängigen Immunfluoreszenzprotokollen.

Stellen Sie sicher, dass Sie einen Kernfleck enthalten, um die Integrität des Gewebes sichtbar zu machen. Nachdem die Schnitte gefärbt wurden, fügen Sie jeder Probe einen Tropfen Bodenhalterung hinzu, gefolgt von einem Glasabdeckglas Nummer eins auf einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop. Wählen Sie das 20-fach-Objektiv und stellen Sie eine Feldansicht von 708 Punkt 15 x 708 Punkt 15 Mikrometer ein.

Stellen Sie dann die Proben nacheinander mit 2048 x 2048 Pixeln pro Bild dar, um die Ergebnisse vergleichbar zu halten. Aufzeichnung der Bilder in einem Kanal zur Visualisierung der Stromastrukturen, einem Kanal für die Zellkerne und zusätzlichen Kanälen für die interessierenden hämatopoetischen Zellen nach Bedarf. Nehmen Sie die Bilder mit Hilfe der Mittelwertbildung auf.

Idealerweise werden einzelne benachbarte Bilder aufgenommen, um den gesamten Oberschenkelbereich abzudecken. Speichern Sie dann die Bilder in einem Mikroskopie-Bilddateiformat. Exportieren Sie dann eine JPEG-Datei pro Kanal für jeden abgebildeten Bereich und verwenden Sie ein Bildanalysewerkzeug, um die Quantifizierung der Bildsegmentierung der Kolokalisierung und der Nachbarschaftsanalyse durchzuführen, bevor Sie die Simulationen der Zufallszelle ausführen.

Positionierung auf den analysierten Knochenmarkbildern für jedes zu simulierende Bild. Platzieren Sie die folgenden Dateien in einem einzigen Ordner, wobei die einzelnen CSV-Dateien, die vom Zellkontakt-Tool bereitgestellt werden. Die ursprünglichen DPI-Kanal-JPEG-Dateien und die ursprünglichen Stromalkanal-JPEG-Dateien, um Stapelsimulationen für die Bildserie aus einer einzelnen Femurprobe durchzuführen und zu diesem Zeitpunkt auch alle ursprünglichen JPEG-Dateien und die entsprechenden einzelnen CSV-Dateien in einen anderen Ordner zu übertragen.

Wenn alle Dateien zusammengebaut sind, starten Sie das Simulationstool. Aktivieren Sie dann das Kontrollkästchen Bilddaten automatisch laden. Wenn diese Option aktiviert ist, werden die CSV-Dateien, die den analysierten Bildern entsprechen, automatisch geöffnet.

Geben Sie als Nächstes das gemeinsame Tag für die CSV-Dateien und die Anzahl der Bildsätze ein, die für die Simulation im Batch-Modus verwendet werden sollen. Laden Sie dann die aus dem S-Stromakanal generierte J-Peg-Datei mit einem Dateinamen, der auf drei endet, um die Maske für den DPI-Kanal zu generieren. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Maske anwenden und setzen Sie den Schwellenwert für die Umwandlung des DPI-Bildes in eine Binärmaske auf 10.

Aktivieren Sie die Kontrollkästchen "Acht Bit" und "Dilatieren" und stellen Sie den Dilatationsgrad auf fünf Pixel ein. Aktivieren Sie dann das Kontrollkästchen für die Breitenerosion. Geben Sie dann den gewünschten Wert für den Umgebungsradius ein, der für die Analyse der simulierten Bilder verwendet wird, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen OSU verwenden, um den OSU-Algorithmus für die automatische Erkennung der Stromastrukturen für die hämatopoetischen Zellen zu verwenden.

Simuliert als kreisförmige Formen. Messen Sie die Zellgrößenverteilung der analysierten Zelltypen mit einer Bildanalysesoftware, die die entsprechenden Objektsegmentierungsfunktionen enthält, und bestimmen Sie das Sigma für alle hämatopoetischen Typen aus diesen Messungen. Der Grenzwert für die Zellengröße, d. h. der Durchmesser in Pixeln, der das kleinste Objekt beschreibt, das vom Bildanalysewerkzeug noch als vollständige Zelle erkannt wird, kann bestimmt werden.

Geben Sie dann den Grenzwert für die Zellengröße und das Sigma in Pixel ein, um die Zellengrößenverteilung für die roten, grünen und blauen Zellen zu simulieren. Aktivieren Sie anschließend auf der Registerkarte Zellen und Masken das Kontrollkästchen Löschen, damit das Programm eine neue Position für eine Zelle auswählen kann, wenn sie sich mit mindestens einem Pixel innerhalb eines No-Go-Bereichs der Maske überlappt. Aktivieren Sie auf der Registerkarte Zellenausschluss auch das Kontrollkästchen Zellenüberlappung vermeiden.

Geben Sie dann den zulässigen Mindestabstand zwischen den Mittelpunkten zweier Zellen in Pixel ein. Wenn die Überlappung durch den Mindestabstand zwischen der Mitte einer Zelle und der Mitte einer anderen Zelle definiert wird, legen Sie die maximale Überlappungsfläche auf 100 % fest. Stellen Sie dann das Simulationswerkzeug auf 1000 Wiederholungen ein. Aktivieren Sie dann das Kontrollkästchen Verkäufe automatisch speichern, um die Koordinaten der simulierten Objekte für alle Wiederholungen jedes Bildes des Stapels als zerstörte Dateien im Textformat zu speichern.

Geben Sie auch ein allgemeines Tag für die gespeicherten Dateien ein. Klicken Sie abschließend auf Simulation ausführen und ermitteln Sie die durchschnittlichen Kontakt- und Umgebungsfrequenzen der Sätze von 1000 simulierten Bildern, die jedem aufgenommenen Bild entsprechen. Für diese Division wird die durchschnittliche Anzahl von Kontakten und Umkreisen anhand der aufgezeichneten Zellzahl pro Bild berechnet und die Häufigkeiten mit den Ergebnissen der automatisierten Kolokalisierungsanalyse des aufgenommenen Bildes verglichen.

In dieser Abbildung ist eine Lokalisationsanalyse von Eosinophilen, Plasmazellen und B-Zellen mit der Mikroumgebung der Stromazellen mit fluoreszierendem chimärem Knochenmark dargestellt. Die CSV-Dateien, die von den Werkzeugen "Zellkontakt" und "Umkreisung" generiert werden, enthalten die Zellzahl und die Gesamtfläche für jede Zellpopulation in Pixel sowie die Anzahl der Kontakte oder der Umgebung. Bevor eine Simulation der zufälligen Zellpositionierung durchgeführt wird, müssen die Parameter, die die Zellgrößenverteilung als Gaußsche Verteilung beschreiben, bestimmt werden. In dieser Simulation wurden die relativen Werte des gemessenen Sigmas für die drei Zellpopulationen beibehalten.

Während die in Pixeln definierten Sigma-Werte so eingestellt wurden, dass sie dem visuellen Erscheinungsbild der aufgezeichneten Zellen entsprechen, um die Bereiche zu definieren, in denen die Zellen platziert werden können, wurde eine Maske aus dem DAPI-Kanal generiert. Anschließend wurde ein Wert von 10 als optimaler Dichteschwellenwert für die Erzeugung der Binärbilder bestimmt. Die Relevanz der Kontakte der Plasmazellen, Eosinophilen oder B-Zellen mit den Stromazellen wurde dann erwartungsgemäß getestet.

Diese Analyse ergab signifikant höhere Kontaktraten in den aufgenommenen Bildern im Vergleich zur Simulation für die Plasmazellen und B-Zellen. Im Gegensatz dazu wurde kein klarer Unterschied für den Kontakt zwischen eosinophilen Stromazellen beobachtet. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in allen Bereichen zu beantworten, die die Analyse der komplexen Gewebestruktur des Knochenmarks erfordern, wie z. B. Immunologie, Hämatologie, Pathologie oder Stammzellbiologie.