Automatisierte Quantifizierung Hämatopoetische Zell - Stromal Cell Interactions in histologische Bilder unentkalkte Knochen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Assoziationen zwischen spezifischen Zellsubpopulationen im Knochenmark zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst histologische Kryoschnitte von Mausfemurtumoren gewonnen werden. Im zweiten Schritt werden die Schnitte für die immunfluoreszenzanalytische Untersuchung gefärbt und konfokale Bilder aufgenommen.

Die Bilder werden anschließend digital analysiert. Letztendlich können die Positionen der verschiedenen Zelltypen simuliert werden, um die Raten und Häufigkeiten des Kontakts zwischen den spezifischen immunologischen Zellen von Interesse und ihrer Mikroumgebung zu berechnen. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir mikroumgebungsbezogene Nischen für langlebige Plasmazellen im Knochenmark analysierten und ein Bedürfnis nach einer Methode bestand, um die zellulären Assoziationen im Knochenmarksgewebe eindeutig zu quantifizieren.

RA Maya wird Ihnen das Verfahren zur Kryosuktion von Femurknochen aus einer erwachsenen Maus demonstrieren. Stellen Sie zunächst die Probentemperatur und Schneidetemperatur eines Standard-Mikrotoms, das mit einer Hartgewebe-Schneide ausgestattet ist, auf minus 24 Grad Celsius ein. Nach einer 15-minütigen Akklimatisierung.

Befestigen Sie einen Probenblock mit Kryo-Einbettmedium am metallenen Probenhalter und passen Sie die Ausrichtung des Blocks bei Bedarf an. Schneiden Sie die Probe so lange zurecht, bis der Knochen vollständig freigelegt und das Mark sichtbar ist. Stellen Sie anschließend eine Schnittdicke von sieben Mikrometern ein.

Befestigen Sie als Nächstes ein Stück Kawamoto-Klebeband mit der klebenden Seite nach oben auf einem Probenblock unter Verwendung eines mit weichem Leder überzogenen Holzspatels. Schneiden Sie die Probe und heben Sie sie mit einer Pinzette an. Drehen Sie das Band, sodass der Schnitt an der Oberseite liegt. Übertragen Sie dann das Band auf einen Glasobjektträger.

Befestigen Sie das Band mit Tesafilm am Objektträger, sobald der letzte Schnitt gesammelt wurde. Lassen Sie die Proben mindestens 30 Minuten trocknen und lagern Sie die Objektträger bei minus 80 Grad Celsius. Zwei Frauen führen die Bildgebung der Proben durch und färben die aufgetauten Kryoschnitte gemäß gängiger Immunfluoreszenzprotokolle.

Unter Verwendung einer Kernfärbung, um die Gewebeintegrität sichtbar zu machen. Nach der Färbung der Schnitte einen Tropfen Einbettmedium auf jede Probe geben und anschließend einen Deckglas Nr. 1 auf einem Laser-Scanning-Konfokalmikroskop aufbringen. Das 20x-Objektiv auswählen und einen Bildausschnitt von 708,15 mal 708,15 Mikrometern einstellen.

Danach die Proben einzeln mit 2048 mal 2048 Pixel pro Bild aufnehmen, um die Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Die Bilder in einem Kanal zur Visualisierung der stromalen Strukturen, einem Kanal für die Kerne und gegebenenfalls weiteren Kanälen für die interessierenden hämatopoetischen Zellen aufzeichnen. Die Aufnahmen mittels Zeilenmittelung erfassen.

Im Idealfall einzelne benachbarte Bilder erfassen, um den gesamten femoralen Schnittbereich abzudecken. Anschließend die Bilder in einem mikroskopischen Bilddateiformat speichern. Danach pro Kanal und pro abgebildeter Region jeweils eine JPEG-Datei exportieren und ein Bildanalysetool verwenden, um die Bildsegmentierung, Quantifizierung der Kolokalisation sowie die Nachbarschaftsanalyse durchzuführen, bevor die Simulationen der zufälligen Zelle ausgeführt werden.

Positionierung auf den analysierten Knochenmarkbildern für jedes zu simulierende Bild. Legen Sie die folgenden Dateien in einem einzelnen Ordner ab, und zwar die einzelnen CSV-Dateien, die vom Zellkontakt-Tool bereitgestellt werden. Die ursprünglichen DPI-Kanal-JPEG-Dateien und die ursprünglichen Stromakanal-JPEG-Dateien, um Batch-Simulationen an der Bildreihe einer einzelnen femoralen Probe durchzuführen, sowie alle ursprünglichen JPEG-Dateien und die entsprechenden einzelnen CSV-Dateien zu diesem Zeitpunkt ebenfalls in einen anderen Ordner übertragen.

Wenn alle Dateien zusammengestellt sind, starten Sie das Simulationstool. Aktivieren Sie dann das Kontrollkästchen „Automatisches Laden der imagedaten“. Bei aktivierter Option werden die CSV-Dateien, die den analysierten Bildern entsprechen, automatisch geöffnet.

Geben Sie als Nächstes das gemeinsame Tag für die CSV-Dateien und die Anzahl der Bilddateisätze ein, die für die Batch-Modus-Simulation verwendet werden sollen. Laden Sie dann die Jpeg-Datei, die aus dem S-Stroma-Kanal generiert wurde und deren Dateiname auf drei endet, um die Maske für den DPI-Kanal zu erzeugen. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Maske anwenden und stellen Sie den Schwellenwert zur Umwandlung des DPI-Bildes in eine binäre Maske auf 10 ein.

Aktivieren Sie die Kontrollkästchen „Acht Bit“ und „Dilatation“ und stellen Sie den Dilatationsgrad auf fünf Pixel ein. Aktivieren Sie anschließend das Kontrollkästchen „Erosionsbreite“. Geben Sie danach den gewünschten Wert für den Umgebungsradius ein, der für die Analyse der simulierten Bilder verwendet wird, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen „OSU verwenden“, um den OSU-Algorithmus für die automatische Erkennung der stromalen Strukturen hämatopoetischer Zellen zu nutzen.

Simuliert als kreisförmige Strukturen. Messen Sie die Größenverteilung der analysierten Zelltypen mit einer beliebigen Bildanalyse-Software, die über geeignete Objekt-Segmentierungsfunktionen verfügt, und ermitteln Sie anhand dieser Messungen das Sigma für alle hämatopoetischen Typen. Die Größenschwelle der Zelle, also der Durchmesser in Pixeln, der das kleinste Objekt beschreibt, das von der Bildanalyse-Software noch als vollständige Zelle erkannt wird, kann bestimmt werden.

Geben Sie anschließend die Zellgrößen-Schwellenwerte und die Sigma-Werte in Pixeln für die Simulation der Zellgrößenverteilung für rote, grüne und blaue Zellen ein. Wechseln Sie dann zum Reiter Zellen und Maske und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Löschen, damit das Programm eine neue Position für eine Zelle wählen kann, wenn sie sich mit mindestens einem Pixel innerhalb eines Sperrbereichs der Maske überlappt. Unter dem Reiter Zellausschluss aktivieren Sie ebenfalls das Kontrollkästchen Überlappung vermeiden.

Geben Sie anschließend den zulässigen Mindestabstand zwischen den Zentren zweier Zellen in Pixeln ein. Falls die Überlappung durch den Mindestabstand vom Zentrum einer Zelle zum Zentrum einer anderen Zelle definiert ist, legen Sie die maximale Überlappungsfläche auf 100 % fest. Stellen Sie dann das Simulationswerkzeug auf 1000 Wiederholungen ein. Aktivieren Sie anschließend das Kontrollkästchen „Automatisch speichern“, um die Koordinaten der simulierten Objekte für alle Wiederholungen jedes Bildes des Stapels als Textdateien zu speichern.

Geben Sie außerdem ein allgemeines Tag für die gespeicherten Dateien ein. Klicken Sie abschließend auf „Simulation ausführen“ und ermitteln Sie die durchschnittlichen Kontakt- und Nähehäufigkeiten der Mengen von 1000 simulierten Bildern, die jeweils einem aufgezeichneten Bild entsprechen. Hierzu teilen Sie die durchschnittlichen Kontakt- und Näheanzahlen durch die aufgezeichnete Zellanzahl pro Bild und vergleichen die Häufigkeiten mit den Ergebnissen der automatisierten Kollokalisationsanalyse des aufgezeichneten Bildes.

In dieser Abbildung wird eine Lokalisierungsanalyse von Eosinophilen, Plasma- und B-Zellen im stromalen Zellmikromilieu mit fluoreszierendem chimärem Knochenmark präsentiert. Die von den Zellkontakt- und Nachbarschaftswerkzeugen generierten CSV-Dateien enthalten die Zellanzahl und die Gesamtfläche für jede Zellpopulation in Pixeln sowie die Anzahlen von Kontakten oder Nachbarschaften. Bevor eine Simulation der zufälligen Zellpositionierung durchgeführt wird, müssen die Parameter, die die Zellgrößenverteilung als Gauß-Verteilung beschreiben, in dieser Simulation bestimmt werden; dabei wurden die relativen Werte der für die drei Zellpopulationen gemessenen Sigma beibehalten.

Während die in Pixeln definierten Sigma-Werte so eingestellt wurden, dass sie dem visuellen Erscheinungsbild der aufgezeichneten Zellen entsprechen, um die Bereiche festzulegen, in denen sich die Zellen befinden können, wurde eine Maske aus dem DAPI-Kanal generiert. Ein Wert von 10 erwies sich dann als optimaler Dichteschwellenwert zur Erzeugung der Binärbilder. Die Relevanz der Kontakte von Plasmazellen, Eosinophilen oder B-Zellen mit den Stromazellen wurde anschließend wie erwartet überprüft.

Diese Analyse ergab signifikant höhere Kontaktquoten in den aufgezeichneten Bildern im Vergleich zur Simulation für die Plasmazellen und B-Zellen. Im Gegensatz dazu wurde kein klarer Unterschied beim Kontakt zwischen Eosinophilen und stromalen Zellen beobachtet. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen in jedem Bereich zu beantworten, der die Analyse der komplexen Gewebestruktur des Knochenmarks erfordert, wie beispielsweise die Immunologie, Hämatologie, Pathologie oder Stammzellbiologie.