A Time Differential Maltechnik mit Full Bilaterale Gill Denervation Gekoppelt an Ionocytes in Fish Studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Proliferation von brachialen Zyten in den Kiemen von Goldfischen zu untersuchen, denen eine extrinsische Innervation fehlt. Dies wird erreicht, indem der Fisch zunächst in ein mitochondrienspezifisches Färbebad gelegt wird, um die bereits vorhandenen Mitochondrien, die reichen brachialen Zyten, zu färben. Der zweite Schritt besteht darin, eine vollständige beidseitige Denervierung der Kiemen durchzuführen.

Als nächstes werden die Fische eingeschläfert. Die Kiemen werden geerntet. A-Zyten werden mit einem Antikörper gegen Natriumkalium an TPAs markiert.

Der letzte Schritt besteht dann darin, bereits vorhandene und neu differenzierte Zyten abzubilden und zu zählen. Letztendlich wird diese zeitdifferentiale Färbetechnik mit bilateraler Gildendenervierung verwendet, um die Proliferation und Verteilung von Kiemenzyten in Goldfischen ohne jeglichen nervösen Input des Zentralnervensystems zu zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht also darin, dass sie verwendet werden kann, um die dynamische Aufnahme von Ionen zu verstehen und die Umverteilung von Zyten in den GI-Epithelien von Fischen zu untersuchen.

Bereiten Sie zunächst eine millimolare Mitraltracker-Stammlösung vor, indem Sie 50 Mikrogramm in 94 Mikrolitern Dimethylsulfoxid auflösen und vor Licht schützen. Bereiten Sie als nächstes drei bis sechs dunkle Boxen mit einem maximalen Volumen von 600 Millilitern vor. Füllen Sie jede Box mit 400 Millilitern Systemwasser und platzieren Sie jeweils einen Ausströmer, um eine Sauerstoffquelle zu schaffen.

Legen Sie Goldfische mit einem Gewicht von 30 bis 40 Gramm in die Boxen. Nach 30 Minuten fügen Sie die Gehrungs-Tracker-Lösung hinzu, um eine volle Konzentration von 0,1 mikromolaren Farbstoff und 0,01 % DMSO zu erhalten. Baden Sie den Fisch vier Stunden lang.

Schalten Sie nach vier Stunden den Wasserfluss zu den Boxen ein und lassen Sie den Farbstoff ausspülen. Wenn es sich um Kontrolltiere handelt, ist der Fisch drei bis fünf Tage lang zu bergen, dann mit der Immunhistochemie fortzufahren, andernfalls mit dem vollständigen bilateralen Denervierungsverfahren fortzufahren. Betäuben Sie zunächst den Fisch, indem Sie ihn in ein belüftetes Benzocain-Wasserbad legen.

Sobald die Atmung aufgehört hat, legen Sie den Fisch auf einen Operationstisch und führen Sie einen Schlauch in die Mundhöhle ein. Um die Kiemen mit belüfteter Anästhesielösung zu spülen, positionieren Sie den Fisch so, dass der Kopf leicht nach unten geneigt ist, um einen besseren Zugang zum Bereich hinter dem vierten Kiemenbogen zu ermöglichen. Heben Sie das Operkulom vorsichtig mit einer geraden Pinzette mit Standardmuster an. und platzieren Sie dann Geweberetraktoren zwischen dem Operkulom und der Innenseite des Kopfes. Öffnen Sie vorsichtig die Geweberetraktoren, um das Operkulom vom Kopf fernzuhalten und die Kiemen freizulegen.

Legen Sie die Retraktorgriffe neben dem Kopf ab, um den Zugang zu allen vier Kiemenbögen zu ermöglichen. Überprüfen Sie, ob die Anästhesielösung die Kiemen spült, und platzieren Sie eine gebogene oder gerade Zange mit Standardmuster zwischen dem vierten Kiemenbogen und dem Hinterkopf. Öffnen Sie vorsichtig die Pinzette, um Spannung im Band zu erzeugen.

Befestigen Sie den vierten Kiemenbogen mit einer Pinzette Nummer fünf am Kopf. Schaffen Sie eine zwei bis drei Millimeter große Öffnung, indem Sie das Epithel durchstechen und das dorsale Ende der Kiemenbögen mit der Ohrhöhle verbinden. Achten Sie darauf, nicht zu tief einzudringen, da die Gefahr besteht, dass ein großes Blutgefäß beschädigt wird.

Halten Sie als Nächstes ein kleines Wattestäbchen mit der Pinzette Nummer fünf und erweitern Sie damit vorsichtig den Schnitt, um den neunten und zehnten Nerv freizulegen. Befreien Sie die Nerven von jeglichem Bindegewebe mit der Pinzette Nummer fünf. Auch hier ist darauf zu achten, dass die Blutgefäße nicht beschädigt werden.

Sobald die Nerven freigelegt und identifiziert wurden, verwenden Sie die gebogene Federschere, um die Nerven vorsichtig zu durchtrennen, während Sie den Schnitt halten. Öffnen Sie mit der geraden Zange in Standardform. Nachdem Sie die Nerven durchtrennt haben, ziehen Sie die gebogene Pinzette vorsichtig zurück und entfernen Sie das Gewebe.

Retraktornähte sind nicht erforderlich, da sich der Schnitt innerhalb von 24 bis 48 Stunden von selbst schließen sollte. Nachdem Sie den Vorgang auf der anderen Seite des Kopfes wiederholt haben, stellen Sie die Spülung der Kiemen von Narkose auf frisches belüftetes Wasser um und lassen Sie den Fisch sich von der Narkose erholen. Sobald die Ohrbewegungen wieder aufgenommen wurden, bringen Sie die Fische in Versuchsbecken, um sich mindestens 24 Stunden lang zu erholen.

Führen Sie schließlich eine Scheinprozedur an einem separaten Satz Fische durch, indem Sie das Epithel hinter dem vierten Kiemenbogen durchstechen, ohne die Nerven zu durchtrennen, bevor Sie den Fisch einschläfern. Geben Sie drei bis vier Milliliter 4%PFA in ein Szintillationsfläschchen. Verwenden Sie ein Fläschchen pro Kiemenbogen.

Nehmen Sie zusätzlich ein kleines Molkeschiffchen und füllen Sie es mit einem XPBS. Dies wird verwendet, um das Taschentuch nach der Exzidierung zu waschen. Halten Sie alle Lösungen auf Eis.

Nachdem du den Fisch mit einer Überdosis Benzocain eingeschläfert hast, hebe die Dauerwelle auf einer Seite des Kopfes mit einer stumpfen Pinzette an und durchtrenne mit einer gebogenen Schere jedes Ende des brachialen Kiemenkorbs. Nehmen Sie dann mit einer stumpfen Pinzette vorsichtig die Kieme an den Rackern auf und heben Sie sie aus der Ohrhöhle. Waschen Sie die Kieme sofort in eiskaltem XPBS, um überschüssiges Benzol und Blut zu entfernen, und legen Sie die herausgeschnittene Kieme in ein mit 4%PFA gefülltes Fläschchen, fixieren Sie alle herausgeschnittenen Kiemen über Nacht bei vier Grad Celsius nach der Fixierung.

Waschen Sie X-S-P-F-A in einem XPBS ab und geben Sie das Tuch in ein zwei Milliliter Bullet Röhrchen, das mit 1,5 Millilitern 1%Tritton x gefüllt ist. Legen Sie die Bullet Tubes für sechs Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius auf einen Shaker. Um das Gewebe zu permatisieren, bereiten Sie eine Verdünnung von 1 bis 250 % jedes Primärantikörpers vor, indem Sie vier Mikroliter der Primärantikörper NKA und ZN 12 in 992 Mikroliter eines XPBS geben.

Stellen Sie sicher, dass beide primären Antikörper im selben Wirt gebildet wurden. Aspirieren Sie die Triton X-Lösung und ohne vorheriges Waschen des Gewebes und die primäre Antikörperlösung und inkubieren Sie auf einem Shaker sechs Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation die Primärantikörperlösung aspirieren und den Primärantikörper dreimal jeweils drei Minuten lang waschen.

Mit einem XPBS. Bereiten Sie den Sekundärantikörper in einer Verdünnung von eins bis 200 vor, indem Sie fünf Mikroliter des Stamm-Sekundärantikörpers in 995 Mikroliter eines XPBS mischen. Nach der Aspiration von PBS aus der letzten Wäsche wird der Sekundärantikörper aufgetragen und sechs Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Shaker inkubiert.

Entfernen Sie schließlich alle überschüssigen Sekundärantikörper, indem Sie das Gewebe wie zuvor dreimal für jeweils fünf Minuten waschen, nachdem Sie das Gewebe gewaschen haben, indem Sie zuerst eine Kieme in einen 200-Mikroliter-Tropfen eines XPBS auf einen flachen Objektträger legen. Um sicherzustellen, dass das Gewebe nicht austrocknet. Die Kiemenhemi-Brinks mit einer gebogenen Mikroschere trennen.

Geben Sie dann einen Tropfen aus einem XPBS und einen Tropfen Eindeckmittel in die Vertiefung eines konkaven Schiebers. Legen Sie die abgetrennten Hemi-Branks mit der Vorderkante des Filaments nach oben in den konkaven Schieber und decken Sie sie mit einem Deckblatt ab. Tupfen Sie die Ränder des Deckblatts mit Nagellack ab. Um zu verhindern, dass sich das Deckglas bewegt und das Gewebe verdrängt, lassen Sie das Gewebe vor der Bildgebung 10 bis 15 Minuten lang am Boden des konkaven Objektträgers absetzen.

Wählen Sie für jeden Kiemenbogen sechs Kiemenfilamente nach dem Zufallsprinzip für die Bildgebung aus, wodurch sechs Bilder pro Kiemenbogen erzeugt werden. Verwenden Sie die konventionelle konfokale Mikroskopie, um das Gewebe abzubilden, indem Sie optische Schnitte von ein bis drei Mikrometern machen. In den folgenden Bildern wurden die durch Pfeilspitzen angezeigten Zyten mit dem Alpha-Fünf-Antikörper und die durch Pfeile angezeigten Nerven mit dem ZN 12-Antikörper gefärbt. Dieses konfokale Bild eines Kiemenfilaments von einem Kontrollfisch zeigt eine extrinsische Innervation mit ausgedehnter Lamellenverzweigung eines zentralen Nervenbündels, das vermutlich vom neunten und 10. Nerv ausgeht, wie auf dem eingefügten Bild zu sehen ist.

Einige der angegebenen Zyten sind auch innerviert. Dieses Bild zeigt ein Kiemenfilament zwei Tage nach vollständiger bilateraler Denervierung. Es kam zu einer Verkleinerung des zentralen Nervenbündels, während die laminare Innervation weitgehend intakt erschien.

Hier zeigt ein Kiemenfilament, das fünf Tage nach vollständiger bilateraler Denervierung gezeigt wurde, dass die extrinsische Innervation nun weitgehend fehlt. Qualitative Analysen deuten darauf hin, dass die vollständige bilaterale Denervierung eine Verschlechterung der extrinsischen Kiemeninnervation verursacht, während die Nerven mit den Zellkörpern innerhalb des Kiemenfilaments erhalten bleiben, wodurch ein Netzwerk von Nerven durch das Filament und in die lahme Kiemenbahn entsteht. Dieses Verfahren kann mit anderen Methoden wie der Messung von Ionenflüssen mit radioaktiven Ionen wie Natrium 22 gekoppelt werden, um zusätzliche Forschungsfragen zu beantworten.