Name: Loop-vermittelte isothermen Amplifikation (LAMP) Assays für die artspezifischen Nachweis von Eimeria, Die Hühner infizieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Lernen Sie die LAMP-Methode zur Diagnose von Eimeria-Infektionen bei Hühnern. Diese kostengünstige Technik ermöglicht eine schnelle, zuverlässige Artbestimmung ohne aufwendige Laborausstattung.

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Die in dieser Studie durchgeführte Arbeit wurde teilweise vom Royal Veterinary College über den Fonds für studentische Forschungsprojekte sowie vom Biotechnology and Biological Sciences Research Council und dem Department for International Development (Fördernummer BB/H009337/2) unterstützt. Diesem Manuskript wurde von der RVC die Referenz PPB_00795 zugewiesen.

1. Vorlage Vorbereitung Hinweis: alle genomischen DNA-Matrize mit Verdacht auf einen der sieben Eimeria-Spezies, die Hühner infizieren abgeleitete DNA enthalten, können als Matrize für LAMP-basierten Eimeriaspezies Identifizierung verwendet werden. Darmgewebeproben für Feld diagnostische Analyse sollten bei der routinemäßigen post-mortem wie hier beschrieben gesammelt werden. <ol><li> Wählen Sie den Abschnitt (oder Abschnitte) des Darms zu prüfen. Siehe Tabelle 1 für einen Führer zu Probe Standortwahl und die Eimeria-Spezies am wahrscheinlichsten 18 und 1 für die Spezies-spezifische Bereich der Verteilung und Lage der Probenahmestellen zu sein. Hinweis: Dies ist von zentraler Bedeutung, da Eimeria sind insbesondere Host-Site-spezifisch. Jede Art, die Hühner infiziert wird durch die Darmbereich, die es zielt auf 19 festgelegt. Die Entscheidung kann durch die bisherigen Erfahrungen der Farm, Interesse an einem oder mo beeinflusst werdenre spezifische Eimeria-Arten oder andere Diagnose-Anzeigen 6. </li><li> Verbrauch 5 cm oder mehr Längen der Darmabschnitt (en), ausgewählt für Eimeria mit sterilen Schere oder einem Skalpell zu testen. Optional, lagern die Proben für eine anschließende Analyse in einem Fixiermittel, wie beispielsweise in RNAlater 18 oder 95% Ethanol. HINWEIS: Wenn die Speicherung in Ethanol die Probe sollte in sterilem, Tris-Ethylendiamintetraessigsäure gewaschen werden (TE) Puffer vor der Verwendung. </li><li> Schneiden Sie die Probe in Längsrichtung offen, die meisten Darminhalt zu entfernen (falls vorhanden) und kratzen Zellen von der Schleimschicht frei entweder mit dem Rand eines sterilen Glasobjektträger oder eine Ethanol / Flamme sterilisiert Scherenblatt. Wahlweise für eine Sammelprobe sind Zellen, die aus allen vier der artspezifischen Darm-Websites in einer einzigen Röhre. </li><li> Legen Sie die Abstreifgut in ein steriles 1,5 ml Schraubverschluss-Mikroröhrchen mit 100 ul sterilem TE-Puffer mit 1(W / v) Chelex 100-Harz 0%. </li><li> Schütteln Sie jede Probe 1 min kräftig. Stellen Sie sicher, dass der Schraubdeckel sorgfältig verschlossen und dann in einem kochenden Wasserbad inkubiert für 10 min. </li><li> Nach Kochen ermöglichen jede Probe bei Umgebungstemperatur für 1-2 min abkühlen. </li><li> Zentrifuge jede Probe unter Verwendung einer Mikrozentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit (zB ~ 10.000 × g) für 1 min. </li><li> Sammel 2 ul des erhaltenen Überstands werden Vorlage in jeder Lampe Assay durchgeführt werden. Optional bündeln mehrere Darmstelle in einem einzigen Rohr, einen Multi-Site-Assay bereitzustellen. </li></ol> 2. Eimeria LAMP Primer Vorbereitung (Pre-Test) <ol><li> Bereiten Eimeria LAMP Primer Aktien ausreichend für 100 Tests: <ol><li> Den Inhalt jeder lyophilisierten Eimeria LAMP Primer durch Zugabe von Wasser molekularen Grad bis zu einer Konzentration von 100 uM (nach Angaben des Herstellers). Wenn nicht angegeben, berechnet das Volumen der molekularen reines Wasser erforderlich using die physikalischen und Molekulargewichte von jedem Primer. </li><li> Pipette 60 ul molekular reines Wasser in einem separaten 0,5 ml Flip-Top-Mikrozentrifugenröhrchen für jede Eimeria-Arten, die untersucht werden. </li><li> Hinzufügen Primer FIP, BIP, F3, B3, LF und LB für die Ziel Eimeriaspezies zum Wasser unter Verwendung der in Tabelle 2 gezeigten Mengen, wodurch eine Reihe von sieben artspezifischen Primer Mischungen. </li><li> Vortexen mischen die Primerlösung, dann Impulsmikrozentrifuge und einfrieren, bis sie benötigt. </li></ol></li><li> Bereiten Sie eine LAMP Reaktion Mastermix für jeweils Eimeria-Arten, die untersucht werden. Multiplizieren Sie die in Tabelle 3 gezeigten Mengen mit der Anzahl der Proben und fügen Sie drei bis Positivkontrolle Negativkontrolle und Pipettieren Ersatz. Pipette in ein 0,5 oder 1,5 ml Flip-Top-Mikrozentrifugenröhrchen. </li></ol> 3. Eimeria LAMP Assay <ol><li> Pipette 23 ul Eimeria artspezifischen Bst DNA-Polymerase / LAMP Mastermix in einen 0.5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Add 2 ul DNA-Template (in Abschnitt 1 hergestellt), eine endgültige Reaktionsvolumen von 25 ul. </li><li> Add 2 ul Eimeria artspezifischen genomische DNA zu einem Reaktions (positive Kontrolle). Add 2 ul Wasser molekularen Grad an Reaktion (Negativkontrolle). HINWEIS: Wenn artspezifischen genomischer DNA ist nicht verfügbar, eine frühere positive LAMP oder Standard-PCR-Produkt können stattdessen verwendet werden. </li><li> Inkubieren in einem Wasserbad oder Heizblock bei 62 ° C für 30 min. Optional de-aktivieren Bst DNA-Polymerase durch Erhitzen auf 80 ° C für 10 Minuten, wenn die Reaktion nicht sofort gelesen werden. </li></ol> 4. LAMP Assay Auslese <ol><li> Am Ende der Inkubation beurteilen die Farbe jedes Reaktion durch Auge unter Raumbeleuchtung. Negative Ergebnisse erscheinen in der Farbe rosa bis violett erscheinen positive Ergebnisse Himmelblau 20. </li><li> Wahlweise bestätigen die LAMP Untersuchungsergebnis in einer laboratory, indem 5 ul LAMP-Reaktionsprodukt mit 1 ul DNA-Gelbeladungspuffer für Agarose-Gelelektrophorese unter Verwendung eines 2% igen Agarosegel in 1 x Tris / Borat / EDTA (TBE) -Puffer: vorgefärbter Verwendung eines Nukleinsäurefarbstoff (5 ul pro 50 ml Agarose). In 5 ul einer 1 Kb Molekülgröße DNA-Leiter in Spur 1 des Gels auf Fragmentgröße Berechnung ermöglichen. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die in dieser Arbeit beschriebenen Eimeria-speziesspezifischen LAMP-Assays bieten ein neues diagnostisches Toolkit zur Unterstützung einer effektiven Kontrolle von Kokzidien und der Krankheit Kokzidiose. Zu den Folgen einer Eimer-Infektion können schwere wirtschaftliche Verluste sowie eine ernsthafte Beeinträchtigung des Tierwohls der Tiere und eine erhöhte Anfälligkeit für die Besiedlung durch zoonotische Krankheitserreger gehören21. Die Möglichkeit, Herden auf das Auftreten einiger oder aller Eimeria-Arten zu überwachen, kann eine frühzeitige Warnung vor einem Zusammenbruch der Wirksamkeit der Antikokzidienbekämpfung sein. Zu den wichtigsten Vorteilen von LAMP gehören eine robuste Zielspezifität, die sich aus der Anforderung von sechs verschiedenen DNA-Sequenzzielen ergibt, sowie eine hohe Sensitivität, die durch die Einbeziehung von Schleifenprimern13 gesteigert wird, obwohl der qualitative, nicht quantitative Charakter von LAMP als Einschränkung angesehen werden kann. Es ist derzeit nicht möglich, die Flucht von Parasiten in geringer Höhe aus der routinemäßigen Chemoprophylaxe oder die Replikation von Lebendimpfstoffen von der unkontrollierten Eimer-Replikation zu unterscheiden. Nichtsdestotrotz bietet die technische Leichtigkeit des Protokolls und der endgültigen Auslesung eine erhebliche Verbesserung gegenüber den bestehenden spezialisierten und häufig subjektiven pathologischen und morphologischen Ansätzen6,7. Jeder Assay kann zu einem Preis von ~0,75 £ pro Probe durchgeführt werden, unabhängig von den Arbeits- und Ausrüstungskosten. Daher sind LAMP-Assays auch kostengünstiger als andere molekulare Diagnostika wie PCR, da sie eine isotherme Inkubation erfordern, ohne dass spezielle Geräte erforderlich sind.
Viele Jahre lang hat der Zugang zu genomischer DNA von Eimeria als Vorlage die Entwicklung und Anwendung der molekularen Felddiagnostik eingeschränkt. Die Oozyste ist die am leichtesten zugängliche Phase des Lebenszyklus des Eimeriums, aber für die routinemäßige DNA-Extraktion sind Laboreinrichtungen erforderlich22. Andere, labilere Stadien des intestinalen Lebenszyklus erfordern eine Reinigung vor der DNA-Präparation, um eine PCR-Hemmung und einen daraus resultierenden Verlust der Sensitivität zu verhindern23,24. Die Möglichkeit, Eimer-DNA in einer für LAMP geeigneten Qualität mit nur einer Mikrozentrifuge und einem Wasserbad zu extrahieren, ergänzt durch Inhibitoradsorption mit chelex-Harz, fördert nun die breitere Anwendung der Molekularbiologie in der Eimer-Diagnostik. Interessanterweise legt der berichtete Nachweis von quantitativer PCR-messbarer Eimeria-DNA im Darmgewebe 20 Tage nach Beginn der Parasiteninfektion, 11 Tage nach dem letzten nachweisbaren Oozystenausstoß, den Verdacht auf, dass LAMP zum Nachweis einer aufgelösten Parasitenexposition sowie einer laufenden Infektion verwendet werden kann, selbst nachdem sichtbare Läsionen abgeklungen sind25. 
Die relativ niedrigen Kosten und geringen technischen Anforderungen der LAMP Eimeria-Diagnostik können ihre Anwendung in Entwicklungsländern fördern, in denen andere, etabliertere Ansätze möglicherweise nicht verfügbar oder angemessen sind. Damit dies anwendbar ist, muss jeder Assay in der Lage sein, alle Stämme zu erkennen, die in jeder Region zirkulieren können. Während das Verständnis der genetischen Vielfalt, die bei Eimeria-Arten vorherrscht, begrenzt ist26, liefert die Verwendung von Zielsequenzen, die zuvor für die Verwendung in der quantitativen PCR mit Stämmen aus Afrika, Asien, Europa und Südamerika validiert wurden, einen gewissen Beweis für die Konservierung, was den Nutzen dieser LAMP-Assays auf der ganzen Welt unterstützt10.

Globale Hühnerproduktion Zehnfache über den letzten 50 Jahren mit den Entwicklungsländern Hosting fast viermal die Expansion in den Industrieländern erlebt erhöht <a href="http://www.faostat.org">(www.faostat.org)</a> . Da die Bedeutung der Hühnerproduktion zur Welternährungssicherheit hat sich so hat auch das Profil von Erregern, die schwere Krankheit bei Hühnern verursachen können. Ein gutes Beispiel sind die Eimeria-Arten, allgegenwärtigen einzellige Parasiten, die die Darmerkrankung Kokzidiose 1 führen können. Wo immer Hühnern gezüchtet werden ein oder mehrere Eimeria-Spezies wahrscheinlich gemeinsame 2-4 sein. In der entwickelten Welt Eimeria werden vor allem von Chemoprophylaxe kontrolliert und beschäftigt Shuttle oder Rotationsprogramme, die Auswirkungen der Widerstand 5 zu minimieren. Lebendimpfstoffe sind auch in Systemen, in denen Vogel Wert ist ausreichend, um die Kosten zu rechtfertigen (zB, Zuchttiere, Schichten und einige Broilern 5). Als result dieser Maßnahmen klinischen Kokzidiose wird oft gut kontrolliert, auch wenn subklinische Infektion ist häufig 5. In den Entwicklungsländern die Impfung ist selten und Drug Application häufig weniger gut informiert. Als Folge subklinischen und klinischen Kokzidiose ist häufiger und übt eine erhebliche wirtschaftliche Auswirkungen 3. Diagnose von Eimeria-Infektion traditionell auf Läsion Scoring post-mortem, obwohl auch die Autoren der am häufigsten verwendeten Bewertungssystem kommentierte, dass für einige Arten &quot;es erscheint zweifelhaft, ob eine solche Regelung sollte in jedem, aber mittelschweren Infektionen versucht werden&quot; 6. Ergänzende Hinweise können durch mikroskopische Nachweis des umweltbeständig Oozyste Lebenszyklusphase in Fäkalien oder Wurf Proben gesammelt werden, auch wenn sich überlappenden Morphologie können alle, aber die Experten 6,7 verwechseln. Molekulare Alternativen mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Zufalls amplification polymorpher DNA PCR (RAPD-PCR) und die quantitative PCR-Technologien wurden für bis zu 20 Jahre 8-10 zur Verfügung, aber sie bislang gescheitert populär geworden. Relative Kosten und der Bedarf an Fachlaborgeräte oder Verarbeitung ihre Aufnahme beschränkt, trotz der oft subjektiv und technisch anspruchsvolle Art des älteren pathology- und Mikroskopie-basierte Ansätze 10,11. Eine solche Beschränkung kann in vielen der ärmeren Regionen der Welt, wie Südostasien, wo die Auswirkungen der Kokzidiose auf die Armut kann proportional größer 12 sein übertrieben werden. Als Antwort gibt es einen klaren Bedarf an neuen unkompliziert und empfindlich, aber kostengünstiger, Eimeria-Spezies-spezifische diagnostische Tests. Loop-vermittelte isothermische Amplifikation (LAMP) ist ein leicht zu DNA-Polymerase-angetriebene Technik, die zur Amplifikation großer Mengen an DNA herzustellen. Am wichtigsten ist, verwendet LAMP eine Bst DNA polymerase anstelle der Taq-DNA-Polymerase die üblicherweise in PCR verwendet werden, die DNA-Amplifizierung bei einer einzigen konstanten Temperatur ermöglicht, ohne das Erfordernis der thermischen Zyklen 13,14. Leuchte kann selbst in den rudimentären Labor oder im Feld zugänglich Anwendung sein. Durch eine relative Beständigkeit gegenüber vielen PCR-Inhibitoren, hohe Empfindlichkeit und Spezifität Charakterisiert wurden LAMP-Assays für ein breites Spektrum von Krankheitserregern einschließlich Virus der infektiösen Bursitis, Clostridium perfringens und Cryptosporidium 15-17 entwickelt. In Reaktion auf neue kosteneffektive Eimeriaspezies spezifische Diagnose ein Panel von spezifisch jede der sieben Eimeria-Spezies, die Hühner infizieren LAMP-Assays entwickelt worden, 18 verlangen. Anwendungen für die neuen Tests umfassen die Überwachung Parasiten Auftreten, von besonderem Wert, da die Zuordnung der Arten wie Eimeria maxima oder Eimeria necatrix mit schlechten wirtschaftlichen performance 3,4. Weitere Anwendungen sind die Beurteilung der Wirksamkeit von Antikokzidium Strategie eines Bauernhof, Diagnose subklinische Infektion oder klinischen Erkrankung und Bewertung von Risiken durch Eimeria zu einem Bauernhof gestellt.

<table><tbody><tr><td>RNAlater</td><td>Ambion</td><td>AM7024</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.321</td><td>Achtung, leicht entzündlich</td></tr><tr><td>100 x Tris-EDTA (TE) Pufferkonzentrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>Chelex 100 Harz</td><td>Bio-Rad</td><td>142-1253</td><td></td></tr><tr><td>Wasser in molekularer Qualität</td><td>Invitrogen</td><td>10977035</td><td></td></tr><tr><td>E. acervulina F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CCTAACATTTCGCTTCACGGAC</td></tr><tr><td>E. acervulina B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*ATGAGCAAGTGGAACACCTTG</td></tr><tr><td>E. acervulina FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*AGAGCACAGTGGCAGTGC-AGCAGACAGCATGGCTTACCT</td></tr><tr><td>E. acervulina BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GAAGACCCTGAACGGA-CCTTCTCACCGCTTACCGG</td></tr><tr><td>E. acervulina LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TAAGGTTACACCCGTGGAGG</td></tr><tr><td>E. acervulina LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCCATGCACAAAGCGACTT</td></tr><tr><td>E. brunetti F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GGCCATCAAGTTCCATGAGC</td></tr><tr><td>E. brunetti B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TCAACCTCCTGAGTGTGTGTT</td></tr><tr><td>E. brunetti FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>* GAAAATGCCTTCGTAGCTGCT-GCTGGGGAGAGCGTCTT</td></tr><tr><td>E. brunetti BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TACTTCCTAGGATCCATCCTCGC-AGTTTCTCGCTGCCGCCTC</td></tr><tr><td>E. brunetti LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GAAACGCTCGAACATGGC</td></tr><tr><td>E. brunetti LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CTTCTCCACAGACCCAGAGGT</td></tr><tr><td>E. maxima F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>* ACTACGGAAAAGTGCGTAGCT</td></tr><tr><td>E. maxima B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CCTTCCTCCCTTCTGAAAACTG</td></tr><tr><td>E. maxima FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GAGTCACTGCTGATGTACCAAA AG-GAACTATGCCGCTTTCCCCTG</td></tr><tr><td>E. maxima BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*AGAATGCCGGATTTGTTAGCAGC-AGCAAGTCCAAGGTGTGTGTA</td></tr><tr><td>E. maxima LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>* CAAGCCTACGCGGACATC</td></tr><tr><td>E. maxima LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TTATGCAGCTGGGTCAACG</td></tr><tr><td>E. mitis F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*ACGATAGCCAAGACACGTAAGG</td></tr><tr><td>E. mitis B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CCCCGTGATAAGAGTAGGAACA</td></tr><tr><td>E. mitis FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGCGGGTCGTGAGATTTAAATT AT-GGAAGATCAGGACGGGCACT</td></tr><tr><td>E. mitis BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GTTTCAGTTGATGAACAAGCGA GA-TGCGCCTCTAGAATCAAGACG</td></tr><tr><td>E. mitis LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TCCATGCATCCCCTTGTT</td></tr><tr><td>E. mitis LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGTGGGCACAGATTGATTC</td></tr><tr><td>E. necatrix F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TGGCTTTCCCGCGTACC</td></tr><tr><td>E. necatrix B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGGCCCAACACAAAGACTG</td></tr><tr><td>E. necatrix FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGCTTGAGTTTTAAGCTATGCA CA-GACCCAAGCAGCTCACCAA</td></tr><tr><td>E. necatrix BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGCCATGCCATTCAATGAACG-*GAGGCATACCGGCGTTGTC</td></tr><tr><td>E. necatrix LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GTCTGTAACTTGGGACGTTGT</td></tr><tr><td>E. necatrix LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GAACAGCCGGAGCCTCTC</td></tr><tr><td>E. praecox F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCCCTTGTATGTTGCTGTTTCT</td></tr><tr><td>E. praecox B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCGCACGAATCTGAATCACAC</td></tr><tr><td>E. praecox FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*ATCTCCTCAAAGACTTTCGCGT A-GCGCTTGGCTATATCCATAGG</td></tr><tr><td>E. praecox BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCTCTCGTGGCATACTTGC-GCCAGGAGCCACTGATTGT</td></tr><tr><td>E. praecox LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GAATAGCATTGCCAGGTGG</td></tr><tr><td>E. praecox LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GTCCACTGTCATTAATATTGC TGC</td></tr><tr><td>E. tenella F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCTTGTGAAGGTCAGCGTG</td></tr><tr><td>E. tenella B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>* GCTGAGTCCATACGTACTTCCT</td></tr><tr><td>E. tenella FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCCACTGCTATGGAAAGTCAC AC-CATAACTGGCATGCAGGGGT</td></tr><tr><td>E. tenella BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GTTTGGCCCGAAAGTTGTGAA GA-CGTCAGAAATTGCTGCCCAAT</td></tr><tr><td>E. tenella LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGCATGTGCAGTTGAAGACA</td></tr><tr><td>E. tenella LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CCAAATGTATCTGCTAGTTATA TTAACAAG</td></tr><tr><td>10 x ThermoPol Reaktionspuffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B9004S</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1330</td><td></td></tr><tr><td>Betainlösung (5 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300</td><td></td></tr><tr><td>Bst Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0275S</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxynaphtholblau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33936</td><td>Gelöst in Wasser in molekularer Qualität.</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>10 x Tris/Borat/EDTA (TBE) Puffer</td><td>Invitrogen</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>Blau/Orange DNA-Ladefarbstoff (x6)</td><td>Promega</td><td>G1881</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1Kb DNA-Leiter</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0313</td><td></td></tr><tr><td>SafeView Nukleinsäure-Färbung</td><td>NBS Biologicals</td><td>NBS-SV</td><td></td></tr></tbody></table>

loop-vermittelte isothermen amplifikation (lamp) assays für die artspezifischen nachweis von<em&gt; eimeria</em&gt;, die hühner infizieren

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria-Spezies Parasiten, Protozoen, die die Darmkrankheit Kokzidiose verursachen, stellen eine ernsthafte Bedrohung für die Produktion und das Wohlergehen von Hühnern dar. In Ermangelung einer wirksamen Kontrolle kann klinische Kokzidiose verheerend sein. Resistenzen gegen Chemoprophylaxika, die häufig zur Bekämpfung von Eimeria eingesetzt werden, sind häufig und subklinische Infektionen sind weit verbreitet, was die Futterverwertungsverhältnisse und die Anfälligkeit für andere Krankheitserreger wie Clostridium perfringens beeinflusst. Trotz der Verfügbarkeit von Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierten Instrumenten stützt sich die Diagnose einer Eimeria-Infektion immer noch fast ausschließlich auf traditionelle Ansätze wie Läsionsbewertung und Oozystenmorphologie, aber keiner von beiden ist einfach. Zu den Einschränkungen der bestehenden molekularen Werkzeuge gehören der Bedarf an Spezialgeräten und Schwierigkeiten beim Zugang zu DNA als Template. Als Reaktion darauf wurden ein einfaches Feld-DNA-Präparationsprotokoll und eine Reihe von speziesspezifischen schleifenvermittelten isothermen Amplifikationsassays (LAMP) für die sieben Eimeria entwickelt, von denen erkannt wurde, dass sie das Huhn infizieren. Wir stellen nun ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, das die Präparation genomischer DNA aus postmortalem entnommenem Darmgewebe beschreibt, gefolgt von der Einrichtung und dem Auslesen der LAMP-Assays. Das speziesspezifische LAMP von Eimeria kann zur Überwachung des Auftretens von Parasiten, zur Bewertung der Wirksamkeit der Antikokzidienstrategie eines Betriebs und zur Diagnose subklinischer Infektionen oder klinischer Erkrankungen mit besonderem Wert verwendet werden, wenn keine fachkundige Überwachung verfügbar ist.

Assay-Validierung Während der Überprüfung wurde jede Eimeria artspezifischen LAMP-Test unter Verwendung einer Reihe von reinen DNA-Proben, die alle sieben Eimeria-Arten, die den Hühner sowie Huhn genomischer DNA als Hoststeuer infizieren getestet. Agarose-Gelelektrophorese wurde verwendet, um jeden Test zu lösen und zeigte absolute Artspezifität ohne Host Kreuzreaktivität 18. Als nächstes erstellt eine zehnfache Verdünnungsreihe mit gereinigtem Eimeria tenella genomischen DNA ergab ein Assay Empfindlichkeitsgrenze zwischen einem und zehn Genomkopien 18. Keine Obergrenze wurde mit bis zu positive Ergebnisse erzielt und mit der höchsten Konzentration (100.000 Genomkopien) 18 bestimmt. Anwendung mit Feldproben Die Proben für die Untersuchung gewonnen Eimeria dürften von Hühner tot abgeleitet werden, als Folge der p gekeultoor Gesundheit oder für Sentinel Gesundheitsüberwachung gekeult, was auf eine eher Probengröße von zwischen einem und drei als Teil einer Routine. Testen drei Vögel von einem US-Hähnchenmastanlage im Rahmen eines Überwachungsprogramms gesammelt ergab drei Sätze von Darmproben. Gezielte Anwendung der artspezifischen LAMP Assays Priorisieren der bevorzugten Darmstellen für jede Eimeria-Spezies (Tabelle 1), erlaubt eine visuelle Identifizierung von Eimeria-Infektion bei allen Tieren getestet, indem hydroxynaphthol Blau als Indikator (Figur 2A). Die mit einem negativen LAMP Reaktion bei Verwendung hydroxynaphthol blau erzielt Farbe von Violett bis hin zu rosa, aber ist immer verschieden von der durch ein positives Ergebnis erzielt blau. Bestätigung durch Agarosegelelektrophorese liefert vergleichbare Ergebnisse (2B). Während der Feldanwendung kann der Benutzer wählen, um den Vollbildmodus gegen alle sieben Arten gelten, oder das Ziel nur die Spezies als priorisiertwichtig oder bekannt ist, dass auf dem Hof ​​zirkulierenden oder die Umgebung. Das Versagen des PCR-basierte Ansätze als Diagnostika etablieren für das Auftreten von Eimeria unterstreicht das Erfordernis der Einfachheit in jedem neuen Test. Während LAMP bietet einfachere Zubereitung und Verarbeitung als PCR, bleibt die Forderung, mehrere Darmstellen pro Vogel testen entmutigend. Herstellung einer einzigen gepoolten DNA-Probe pro Vogel, die dann mit einem oder mehreren LAMP Assays getestet werden können, ist wahrscheinlich attraktiver. Das gleiche Ergebnis wie bei jeder Darm Website wurde getrennt verarbeitet werden (Abbildung 2 Verarbeitung einer Sammelprobe pro Tier, was von jedem der spezifischen Darm Standorten in Tabelle 1 mit allen sieben LAMP-Assays beschrieben und gebündelt vor DNA-Präparation, für die Prüfung gesammelten Materials vorausgesetzt verglichen mit Figur 3). <img alt="Figur 1" src=&quot;/files/ftp_upload/52552/52552fig1.jpg&quot; /&gt; Abbildung 1. Darmprobenahmestellen für LAMP Erfassung von Eimeria Parasiten, die Hühner infizieren. Wird die Darmabschnitten von je Eimeria-Arten gezielt durch die farbigen Linien markiert ist, mit den bevorzugten Standorten der Probenahme durch die Anzahl zwischen den gestrichelten schwarzen Linien angezeigt (E. acervulina: gelb / 1, E. Brunetti: pink / 2, E. maxima: blau / 3, E. mitis: orange / 4, E. necatrix: rot / 5, E. praecox: grün / 6 und E. tenella: grau / 7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52552/52552fig2.jpg" /> Abbildung 2. LAMP Diagnose von Eimeria-Infektion herm drei kommerziellen Masthähnchen. LAMP Reaktionen gelöst mit (A) hydroxynaphthol blau, wo ein himmelblau-Reaktion war positiv und eine violette bis rosa Reaktion war negativ, und (B) Agarose-Gelelektrophorese. Die Darm Sites abgetastet wurden, wie in Tabelle 1 für jede Parasitenarten dargestellt. A = E. acervulina, B = E. brunetti, Ma = E. Maxima, Mi = E. mitis, N = E. necatrix, P = E. praecox und T = E. tenella. Spur 1 enthielt die GeneRuler 1 Kb DNA-Leiter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52552/52552fig3.jpg" /> Abbildung 3. LAMP Diagnose einer Eimeria-Infektion unter Verwendung von drei verschiedenen kommerziellen Masthähnchen Sammelproben. LAMP reacgen gelöst mit hydroxynaphthol blau, wo ein himmelblau-Reaktion war positiv und violett bis rosa Reaktion war negativ. A = E. acervulina, B = E. brunetti, Ma = E. Maxima, Mi = E. mitis, N = E. necatrix, P = E. praecox und T = E. tenella. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Beispielseite </td><td> Eimeriaspezies Assay (wahrscheinlich) </td></tr><tr><td> Duodenum (D) </td><td> E. acervulina, E. praecox </td></tr><tr><td> Jejunum / Ileum * (J / I) </td><td> E. maxima, E. necatrix </td></tr><tr><td> Caeca (C) </td><td> E. necatrix, E. tenella </td></tr><tr><td> Terminalen Ileum (TI) </td><td> E. Brunetti, E. mitis </td></tr&gt; <tr><td> Sammelprobe (P) </td><td> E. acervulina, E. Brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E. praecox E. tenella </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Intestinal regionsspezifische Auswahl von Kandidaten Eimeriaspezies Assays. Die Wahl der Region abgetastet variiert für jede Eimeria-Spezies, wie in Abbildung 1 veranschaulicht. Gepoolten Proben beinhalten aus allen vier spezifischen Stellen, die dann für die DNA-Präparat kombiniert wurden gesammelt Materials. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Primer * </td><td> Lizenz Konzentration (uM) </td><td> Volumen (ul) </td></tr><tr><td> Wasser </td><td> - </td><td> 60 </td></tr><tr><td> Vorwärtsprimer (FIP) </td><td> 100 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Rückwärts Inner Primer (BIP) </td><td> 100 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Zukunfts Outer Primer (F3) </td><td> 100 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Rückwärts Outer Primer (B3) </td><td> 100 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Loop-Forward (LF) </td><td> 100 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Loop Backward (LB) </td><td> 100 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td></td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Herstellung eines LAMP Primer Vormischung. Die Komponenten und Proportionen erforderlich, um eine Primer-Vormischung zur LAMP vorzubereiten. Volumes gezeigt werden, sind 100 LAMP Reaktionen. * Primer Identitäten wie in den Materialien und gezeigt Barkway et al (2011) 18. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Auf konz n </td><td> Schlussreaktion konz n </td><td> Volumen pro Reaktion (ul) </td></tr><tr><td> DDW </td><td> - </td><td> - </td><td> 10.1 </td></tr><tr><td> THERMOPOL Puffer </td><td> 10 x </td><td> 1 x </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 100 mM </td><td> 2 mM </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> Primer Mix * </td><td colspan="2"> Tabelle 2 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> 25 mM </td><td> 400 uM </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> Betain </td><td> 5 M </td><td> 1 M </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Hydroxynaphthol blau </td><td> 3 mM </td><td> 120 &amp; mgr; M </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Bst DNA-Polymerase </td><td> 8.000 U / ml </td><td> 8 U </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td></td><td></td><td> 23 </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Herstellung einer LAMP Reaktion Mastermix. * Eimeria artspezifisch.

Die Diagnose einer Eimeria-Infektion bei Hühnern ist nach wie vor anspruchsvoll. Parasitenmorphologie- und wirtspathologische Ansätze sind in der Regel nicht schlüssig, während molekulare Ansätze, die auf PCR basieren, sich in Bezug auf Kosten und Fachwissen als anspruchsvoll erwiesen haben. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) als einfache molekulare Diagnostik für Eimer-Infektionen zu etablieren.

Loop-vermittelte isothermen Amplifikation (LAMP) Assays für die artspezifischen Nachweis von<em&gt; Eimeria</em&gt;, Die Hühner infizieren

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das Vorkommen von Parasiten der I myea-Spezies in einem Huhn oder einer Hühnerherde zu diagnostizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Reagenzien für die schleifenvermittelte isotherme Amplifikation oder Lampenreaktion vorbereitet werden. Als nächstes wird die gesamte genomische DNA von einer oder mehreren Darmstellen post mortem hergestellt.Dann wird die genomische DNA zum Lampen-Mastermix hinzugefügt und inkubiert. Abschließend wird das Ergebnis des Lampentests bewertet. Letztendlich wird LAMP zur Bestimmung des Vorkommens bestimmter Imiria-Arten verwendet, um das Bestandsmanagement zu verbessern und als Instrument zur Diagnose von Krankheiten.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber herkömmlichen Methoden wie morphologischer Mikroskopie oder PCR besteht darin, dass sie weniger subjektiv ist und keine teuren Laboreinrichtungen erfordert. Mit diesem Ansatz können die Gesundheit und das Wohlergehen der Hühner verbessert werden, indem die Diagnose einer arianischen Infektion verbessert wird. Um die Schablone für die Erea-Lampenase vorzubereiten, wählen Sie den Darmabschnitt aus, der getestet werden soll.Verwenden Sie diese Tabelle als Leitfaden für die Auswahl der Stichprobenstandorte und der am wahrscheinlichsten vorkommenden Arten. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da jede Spezies, die Hühner infiziert, durch die Darmregion definiert wird, auf die sie mit einer sterilen Schere oder einem Skalpell abzielt. Exzidieren Sie fünf Zentimeter oder länger der Darmabschnitte, die für den Test auf Eria ausgewählt wurden.Schneiden Sie die Probe in Längsrichtung auf. Entfernen Sie den größten Teil des Darminhalts und verwenden Sie den Rand eines sterilen Glasmikroskops. Schieben oder sterilisieren Sie die Schere, um die Zellen von der Schleimhautschicht zu befreien.Geben Sie das geschabte Material in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss, das 100 Mikroliter steriles TE mit 10 % Gewicht, aber Volumenzelle X 100 Harz enthält, und schrauben Sie den Deckel fest auf. Schütteln Sie die Proben eine Minute lang kräftig und inkubieren Sie sie dann 10 Minuten lang in einem kochenden Wasserbad. Lassen Sie jede Probe nach dem Kochen ein bis zwei Minuten lang bei Umgebungstemperatur abkühlen.Die Proben werden eine Minute lang bei 10.000 mal G zentrifugiert, bevor zwei Mikroliter des Überstands pro Lampe entnommen werden, die als Vorlage zur Herstellung von I Miria Lampen-Primer-Stoffen verwendet werden, die für 100 Assays geeignet sind. Rekonstituieren Sie jede lyophilisierte I-Miria-Lampen-Grundierung durch Zugabe von Wasser in molekularer Qualität in einer Konzentration von 100 Mikromolpipetten und 60 Mikrolitern Wasser in molekularer Qualität in ein separates 0,5-Milliliter-Flip-Top-Mikrozentrifugenröhrchen für jede zu untersuchende Iria-Spezies. Unter Verwendung des in dieser Tabelle gezeigten Volumes.Geben Sie dem Wasser Grundierungen, F-I-P-B-I-P-F, drei B, drei LF und LB, die für die Zieleria-Art spezifisch sind. Erstellen einer Reihe von sieben speziesspezifischen Grundierungsmischungen. Die Primerlösungen kurz invertieren, um sie zu mischen, sie pulsieren mit Mikrofuge und frieren sie bis zur Verwendung ein.Unter Verwendung der in dieser Tabelle aufgeführten Volumina und der Richtlinien im Textprotokoll ist für jede zu untersuchende Iria-Spezies ein Lampenreaktions-Mastermix herzustellen, um den Lampenassay durchzuführen: Pipette von 23 Mikrolitern IEA-Spezies-spezifischem B-S-G-D-N-A-Polymerase-Lampen-Mastermix in ein 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Als Positivkontrolle werden zwei Mikroliter eines zuvor vorbereiteten DNA-Templates mit einem endgültigen Reaktionsvolumen von 25 Mikrolitern zugegeben. Fügen Sie einer Reaktion zwei Mikroliter eria-speziesspezifischer genomischer DNA hinzu.Fügen Sie einer Reaktion als Negativkontrolle zwei Mikroliter Wasser in molekularer Qualität hinzu und inkubieren Sie ein Wasserbad oder einen Wärmeblock bei 62 Grad Celsius für 30 Minuten. Deaktivieren Sie optional die B-S-T-D-N-A-Polymerase durch Erhitzen auf 80 Grad Celsius für 10 Minuten. Wenn die Reaktion am Ende der Inkubation unter Innenlicht nicht sofort abgelesen wird, beurteilen Sie die Farbe jeder Reaktion mit dem Auge.Negative Ergebnisse werden rosa bis violett gefärbt und positive Ergebnisse werden angezeigt. Optional Himmelblau. Um das Ergebnis des Lampenassays zu bestätigen, mischen Sie fünf Mikroliter des Lampenreaktionsprodukts mit einem Mikroliter DNA-Gel-Ladepuffer und lassen Sie es auf einem 2%igen ARO-Gel vor der Färbung laufen.Verwenden Sie eine DNA-Leiter mit einer Killerbase in molekularer Größe, um die Fragmentgröße zu bestimmen, und testen Sie drei. Vögel, die im Rahmen eines Überwachungsprogramms in einem US-amerikanischen Masthähnchenmastbetrieb entnommen wurden, ergaben drei Sätze von Darmproben, wie hier gezeigt. Gezielte Anwendung der speziesspezifischen Lampenassays und Priorisierung der bevorzugten Darmstellen für jede Imiria.Die Spezies ermöglichten die visuelle Identifizierung einer Irian-Infektion bei allen Vögeln, die mit Hydroxynatalblau als Indikator getestet wurden. Die Farbe, die mit einer negativen Lampenreaktion bei der Verwendung von Hydroxy erreicht wird, kann von violett bis rosa reichen, unterscheidet sich aber immer von dem Blau, das durch ein positives Ergebnis erzielt wird. Die Bestätigung durch die AOSE-Gelelektrophorese lieferte vergleichbare Ergebnisse wie hier gezeigt.Die Präparation der DNA aus einer gezogenen Probe pro Vogel, die Material darstellt, das von jeder der spezifischen Darmstellen entnommen und mit allen sieben Lampen-Assays getestet wurde, lieferte das gleiche Ergebnis wie bei der separaten Verarbeitung jeder Darmstelle. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 45 Minuten durchgeführt werden, wenn sie nach diesem Verfahren richtig durchgeführt wird. Andere Techniken wie die Bewertung von Läsionen können ebenfalls durchgeführt werden, um die allgemeine Darmgesundheit zu beurteilen.

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