Loop-vermittelte isothermen Amplifikation (LAMP) Assays für die artspezifischen Nachweis von

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das Vorkommen von Parasiten der I myea-Spezies in einem Huhn oder einer Hühnerherde zu diagnostizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Reagenzien für die schleifenvermittelte isotherme Amplifikation oder Lampenreaktion vorbereitet werden. Als nächstes wird die gesamte genomische DNA von einer oder mehreren Darmstellen post mortem hergestellt.

Dann wird die genomische DNA zum Lampen-Mastermix hinzugefügt und inkubiert. Abschließend wird das Ergebnis des Lampentests bewertet. Letztendlich wird LAMP zur Bestimmung des Vorkommens bestimmter Imiria-Arten verwendet, um das Bestandsmanagement zu verbessern und als Instrument zur Diagnose von Krankheiten.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber herkömmlichen Methoden wie morphologischer Mikroskopie oder PCR besteht darin, dass sie weniger subjektiv ist und keine teuren Laboreinrichtungen erfordert. Mit diesem Ansatz können die Gesundheit und das Wohlergehen der Hühner verbessert werden, indem die Diagnose einer arianischen Infektion verbessert wird. Um die Schablone für die Erea-Lampenase vorzubereiten, wählen Sie den Darmabschnitt aus, der getestet werden soll.

Verwenden Sie diese Tabelle als Leitfaden für die Auswahl der Stichprobenstandorte und der am wahrscheinlichsten vorkommenden Arten. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da jede Spezies, die Hühner infiziert, durch die Darmregion definiert wird, auf die sie mit einer sterilen Schere oder einem Skalpell abzielt. Exzidieren Sie fünf Zentimeter oder länger der Darmabschnitte, die für den Test auf Eria ausgewählt wurden.

Schneiden Sie die Probe in Längsrichtung auf. Entfernen Sie den größten Teil des Darminhalts und verwenden Sie den Rand eines sterilen Glasmikroskops. Schieben oder sterilisieren Sie die Schere, um die Zellen von der Schleimhautschicht zu befreien.

Geben Sie das geschabte Material in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss, das 100 Mikroliter steriles TE mit 10 % Gewicht, aber Volumenzelle X 100 Harz enthält, und schrauben Sie den Deckel fest auf. Schütteln Sie die Proben eine Minute lang kräftig und inkubieren Sie sie dann 10 Minuten lang in einem kochenden Wasserbad. Lassen Sie jede Probe nach dem Kochen ein bis zwei Minuten lang bei Umgebungstemperatur abkühlen.

Die Proben werden eine Minute lang bei 10.000 mal G zentrifugiert, bevor zwei Mikroliter des Überstands pro Lampe entnommen werden, die als Vorlage zur Herstellung von I Miria Lampen-Primer-Stoffen verwendet werden, die für 100 Assays geeignet sind. Rekonstituieren Sie jede lyophilisierte I-Miria-Lampen-Grundierung durch Zugabe von Wasser in molekularer Qualität in einer Konzentration von 100 Mikromolpipetten und 60 Mikrolitern Wasser in molekularer Qualität in ein separates 0,5-Milliliter-Flip-Top-Mikrozentrifugenröhrchen für jede zu untersuchende Iria-Spezies. Unter Verwendung des in dieser Tabelle gezeigten Volumes.

Geben Sie dem Wasser Grundierungen, F-I-P-B-I-P-F, drei B, drei LF und LB, die für die Zieleria-Art spezifisch sind. Erstellen einer Reihe von sieben speziesspezifischen Grundierungsmischungen. Die Primerlösungen kurz invertieren, um sie zu mischen, sie pulsieren mit Mikrofuge und frieren sie bis zur Verwendung ein.

Unter Verwendung der in dieser Tabelle aufgeführten Volumina und der Richtlinien im Textprotokoll ist für jede zu untersuchende Iria-Spezies ein Lampenreaktions-Mastermix herzustellen, um den Lampenassay durchzuführen: Pipette von 23 Mikrolitern IEA-Spezies-spezifischem B-S-G-D-N-A-Polymerase-Lampen-Mastermix in ein 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Als Positivkontrolle werden zwei Mikroliter eines zuvor vorbereiteten DNA-Templates mit einem endgültigen Reaktionsvolumen von 25 Mikrolitern zugegeben. Fügen Sie einer Reaktion zwei Mikroliter eria-speziesspezifischer genomischer DNA hinzu.

Fügen Sie einer Reaktion als Negativkontrolle zwei Mikroliter Wasser in molekularer Qualität hinzu und inkubieren Sie ein Wasserbad oder einen Wärmeblock bei 62 Grad Celsius für 30 Minuten. Deaktivieren Sie optional die B-S-T-D-N-A-Polymerase durch Erhitzen auf 80 Grad Celsius für 10 Minuten. Wenn die Reaktion am Ende der Inkubation unter Innenlicht nicht sofort abgelesen wird, beurteilen Sie die Farbe jeder Reaktion mit dem Auge.

Negative Ergebnisse werden rosa bis violett gefärbt und positive Ergebnisse werden angezeigt. Optional Himmelblau. Um das Ergebnis des Lampenassays zu bestätigen, mischen Sie fünf Mikroliter des Lampenreaktionsprodukts mit einem Mikroliter DNA-Gel-Ladepuffer und lassen Sie es auf einem 2%igen ARO-Gel vor der Färbung laufen.

Verwenden Sie eine DNA-Leiter mit einer Killerbase in molekularer Größe, um die Fragmentgröße zu bestimmen, und testen Sie drei. Vögel, die im Rahmen eines Überwachungsprogramms in einem US-amerikanischen Masthähnchenmastbetrieb entnommen wurden, ergaben drei Sätze von Darmproben, wie hier gezeigt. Gezielte Anwendung der speziesspezifischen Lampenassays und Priorisierung der bevorzugten Darmstellen für jede Imiria.

Die Spezies ermöglichten die visuelle Identifizierung einer Irian-Infektion bei allen Vögeln, die mit Hydroxynatalblau als Indikator getestet wurden. Die Farbe, die mit einer negativen Lampenreaktion bei der Verwendung von Hydroxy erreicht wird, kann von violett bis rosa reichen, unterscheidet sich aber immer von dem Blau, das durch ein positives Ergebnis erzielt wird. Die Bestätigung durch die AOSE-Gelelektrophorese lieferte vergleichbare Ergebnisse wie hier gezeigt.

Die Präparation der DNA aus einer gezogenen Probe pro Vogel, die Material darstellt, das von jeder der spezifischen Darmstellen entnommen und mit allen sieben Lampen-Assays getestet wurde, lieferte das gleiche Ergebnis wie bei der separaten Verarbeitung jeder Darmstelle. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 45 Minuten durchgeführt werden, wenn sie nach diesem Verfahren richtig durchgeführt wird. Andere Techniken wie die Bewertung von Läsionen können ebenfalls durchgeführt werden, um die allgemeine Darmgesundheit zu beurteilen.