Gold-Nanostäbchenunterstützte optische Stimulation von Nervenzellen

Dieses Protokoll beschreibt, wie die vorübergehende Erwärmung, die mit der optischen Absorption von Goldnanostäbchen verbunden ist, genutzt werden kann, um die Differenzierung und intrazelluläre Kalziumaktivität in neuronalen Zellen zu stimulieren. Diese Ergebnisse eröffnen möglicherweise neue Anwendungen in neuronalen Prothesen und Grundlagenstudien in den Neurowissenschaften.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, neuronale Zellen zu stimulieren, die mit Gold-Nanostäbchen unter Verwendung einer Laserdiode im nahen Infrarot kultiviert wurden. Dies wird erreicht, indem zunächst die Goldnanopartikel mit der richtigen optischen Dichte hergestellt werden. Der zweite Schritt besteht darin, die neuronalen Zellen zu kultivieren und ihnen die Nanopartikel hinzuzufügen.

Der nächste Schritt ist die Laserbestrahlung. Der letzte Schritt besteht darin, die Zelldifferenzierung durch Beta-3-Tubulin-Expression zu verifizieren. Letztendlich wird die konfokale Mikroskopie verwendet, um die intrazelluläre Kalziumtransienz darzustellen.

Die Idee zu dieser Methode hatten wir, als wir nach einer Möglichkeit suchten, das Aktionspotenzial in einzelnen Neuronen in einer Zellpopulation zu stimulieren. Das Verfahren wird von Jamie May und Studenten aus unserem Labor demonstriert. Um diesen Vorgang zu beginnen, geben Sie einen Tierarzt mit Gold-Nano-Stäbchenlösung in das UV-sichtbare Spektralphotometer.

Messen Sie die anfängliche optische Dichte, indem Sie die Absorptionswerte von 300 Nanometern bis 1000 Nanometern mit einer Auflösung zwischen 0,5 und zwei Nanometern aufzeichnen. Bereiten Sie eine Ein-Milliliter-Stammlösung her, indem Sie die anfängliche Gold-Anoro-Probe auf eine optische Dichte von einer Zentrifuge verdünnen. Zweimal einen Milliliter der Gold-Nano-Stäbchenlösung, um jeden chemischen Überschuss zu entfernen.

Entfernen Sie dann die Überstände und resuspendieren Sie die Gold-Nanostäbchen in deionisiertem Wasser. Zur Vorbereitung für die Verwendung in der Zellkultur beschallen Sie die goldene Anoro-Lösung fünf Minuten lang und sterilisieren Sie sie dann 30 Minuten lang mit UV-Licht. Bereiten Sie bei diesem Verfahren 500 Milliliter steriles dmem für das Zellkulturmedium vor.

Anschließend werden die neuronalen Zellen NG 1 0 8 15 in 10 Millilitern Zellkulturmedium in einem T 75-Kolben gezüchtet und anschließend bei 37 Grad Celsius und befeuchteter Atmosphäre inkubiert. Wenn die Zellen zu 70 bis 80 % zusammenfließen, wechseln Sie das Medium durch warmes, frisches Medium. Danach lösen Sie die Zellen mechanisch, indem Sie vorsichtig auf den Boden des Konfluentenkolbens klopfen.

Eine Zellsuspension wird fünf Minuten lang bei 600 g zentrifugiert und die Zellpalette in zwei Millilitern warmem Zelldifferenzierungsmedium resuspendiert. Sehen Sie sich dann die Zellen in einer 96-Well-Platte mit 200 Mikrolitern Zelldifferenzierungsmedium an. Inkubieren Sie die Probe einen Tag lang bei 37 Grad Celsius.

Fügen Sie am nächsten Tag die Gold-Nano-Stäbchenlösung hinzu und inkubieren Sie sie weitere 24 Stunden lang. Koppeln Sie bei diesem Verfahren den Laser mit einer Singlemode-Lichtwellenleiter und schließen Sie ihn mit einem FC-Stecker ab. Messen Sie die Ausgangsleistung des Lasers mit einem Standard-Leistungsmesser am dritten Tag der Nanostab-Inkubation.

Befestigen Sie den FC-Stecker an der Vertiefung, bestrahlen Sie die Probe und die Steuerung am fünften Tag eine Minute lang bei Raumtemperatur in einer kontinuierlichen Welle bei unterschiedlichen Laserleistungen, entfernen Sie das Zelldifferenzierungsmedium aus der Probe und fixieren Sie es 10 Minuten lang mit 3,7 Vol.-% Formaldehydlösung. Dann permeabel die Zellen mit 0,1% Volumen pro Volumen Triton X 100 für 20 Minuten. Geben Sie anschließend 3 % Gewicht pro Volumen BSA für 60 Minuten in die Probe.

Um die nicht reaktiven Proteinbindungsstellen zu blockieren, markieren Sie die Probe über Nacht bei vier Grad Celsius mit Anti-Beta-Drei-Tubulin. Am nächsten Tag inkubieren Sie die Zellen 90 Minuten lang im Dunkeln mit einem geeigneten Sekundärantikörper. Anschließend werden die Zellkerne 10 Minuten lang mit DAP E markiert.

Dann wird die Probe mit Epi-Fluoreszenz- oder konfokaler Mikroskopie mit mindestens einem 20-fach-Objektiv abgebildet. Wählen Sie die Mikroskopfilter entsprechend dem Sekundärantikörper und wählen Sie einen DAPI-Filter, um einen Zellkern sichtbar zu machen. In diesem Schritt wird eine Stammlösung von 20 Gew.-% pro Volumen von onic F1 27 hergestellt, indem zwei Gramm gelöster Stoff in 10 Millilitern DMSO gelöst werden.

Die Lösung von onic F1 27 wird 20 Minuten lang bei 40 Grad Celsius erhitzt, um die Löslichkeit zu erhöhen. Bereiten Sie am dritten Tag der Anaro-Inkubation eine ausgewogene Salzlösung vor. Entfernen Sie anschließend das Zelldifferenzierungsmedium und ersetzen Sie es durch die BSS-Lösung.

Ergänzt mit fünf Mikromolaren Grippe, 4:00 AM in DMSO und 0,1 % Gewicht pro Volumen onic F1 27 Stammlösung. Koppeln Sie anschließend den Laser mit einer Singlemode-Glasfaser und spalten Sie die Spitze. Unter Verwendung der Standardtechnik.

Beobachten Sie die resultierende Spitze unter einem optischen Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Spitze flach und senkrecht zur Faserachse ist. Messen Sie dann die Ausgangsleistung des Lasers mit dem Standard-Leistungsmesser. Führen Sie anschließend die Lichtführungsfaser in einen optischen Faserhalter ein und befestigen Sie sie am Mikropositionierer.

Schließen Sie danach ein Oszilloskop an den Signalgenerator an. Zur Überwachung der optischen Modulation. Verwenden Sie ein binäres Signal mit variablen Frequenzen und Impulslängen.

Schließen Sie dann den Laser an und verwenden Sie das Modulationssignal als TTL-Eingang für das Mikroskop. Verwenden Sie einen Argon-Ionen-Laser, um den internalisierten Grippe-Oh-4:00-AM-Farbstoff und den synchronisierten Laser-Dde anzuregen. Für die Anregung der Endozytose-Nanostäbchen legen Sie die Zellen unter ein inverses konfokales Mikroskop und positionieren Sie die Lichtabgabefaser von der Zielzelle weg im Transmissionsbeleuchtungsmodus.

Berechnen Sie dann den Strahlradius am Ziel. Führen Sie die Bildgebung der Probe und Kontrolle bei Raumtemperatur mit einem 40-fach-Objektiv durch und erfassen Sie die Zeitreihenscan mit einer Auflösung von 256 x 256 Pixeln pro Bild im Roundtrip-Modus. Führen Sie dann eine Aufzeichnung ohne jegliche Laser-DIO-Anregung durch, um eine Argon-Ionen-Laserinterferenz zu identifizieren. Hier ist ein Epi-Fluoreszenzbild der differenzierten NG 1 0 8 15 Roal-Zellen gezeigt, das allein kultiviert und mit einer Laserleistung von 7,5 Watt Quadratzentimeter bestrahlt wurde.

Und das ist ein Bild der Zellen, die mit Gold-Nanostäbchen kultiviert wurden, die mit einer Laserleistung von 1,25 Watt Quadratzentimetern bestrahlt wurden. Hier ist ein Beispiel für die differenzierten NG 1 0 8 15 neuronalen Zellen, die mit dem Grippe oh 4:00 AM Kalziumindikator beladen sind. Das Bild wurde mit einem inversen konfokalen Mikroskop mit einem 40-fachen Ölimmersionsobjektiv aufgenommen.

Diese Abbildung zeigt die repräsentativen Stichproben der laserinduzierten Kalziumvariationen als Funktion der Zeit. In NG 1 0 8 15 wurden neuronale Zellen drei Tage lang unter serumfreien Bedingungen mit Polystyrolsulfonat-Gold-Nanostäbchen, Gold-Nanostäbchen und ohne Nanostäbchen kultiviert. F max über F null zeigt die Zunahme der maximalen Fluoreszenz an, die in NG 1 0 8 15 neuronalen Zellen nach ihrer Entwicklung nachgewiesen wurde.

Diese Technik ebnete den Weg für eine zukünftige Anwendung in der optischen Simulation von neuronalen Zellen.