Name: Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Lernen Sie ein zellbasiertes Reportergen-Assay zur Identifizierung chemischer Modulatoren der post-transkriptionellen Genregulation über die 3'-UTR. Diese Methode nutzt Luciferase-Reporterplasmide in krankheitsrelevanten Zelllinien.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken der Italienischen Neuroblastom-Stiftung für die volle finanzielle Unterstützung dieses Projekts.

HINWEIS: Der Durchsatz solcher Testsysteme hängt von der verfügbaren HTS Laborausrüstung. Dieses Protokoll wird von einem Tecan Freedom EVO 200 Roboter, der Liquid-Handling in 96-Well-Format führt erleichtert. Miniaturisierung zu 384-Well-Format ist ebenfalls möglich. Die Roboter-Liquid-Handling-System wird unter einer Steril um aseptischen Bedingungen in allen experimentellen Schritte halten positioniert. Wenn kein Liquid-Handling-Automatisierung zur Verfügung steht, kann das Protokoll leicht in Niedrigdurchsatzformat angepasst werden. Primär Screening 1. Tag 1: Bereiten Sie und Samenzellen HINWEIS: Saatgutzellen zu 80% Zusammenfluss zum Zeitpunkt des Luciferase-Aktivität, dh 48 Stunden nach der Aussaat zu ergeben. <ol><li> Resuspendieren trypsiniert CHP134-mycn3UTR Neuroblastomzellen zu einer Konzentration von 2 × 10 5 Zellen / ml in RPMI, enthaltend 10% FBS und 1% L-Glutamin. Für 27-Platten werden mindestens 250 ml<html> Zellsuspension unter Berücksichtigung Liquid Handling, Mulden Totvolumen und wiederholte Pipettierschritte. Gießen Sie die Zellsuspension in sterile Behälter und legen Sie es auf den Roboter Schreibtisch. </li><li> Zeigen 9 Barcode-weiß mit flachem Boden 96-well Platten und eine Schachtel mit 200 ul steriler Pipettenspitzen am Roboter Schreibtisch. Mischen Sie die Zellsuspension durch Pipettieren vor jeder Dispensation Schritt, um Zellen zu vermeiden Absetzen unter Schwerkraft. Verzichtet werden 75 ul der Zellen in jede Vertiefung der Platten 9, um eine endgültige Dichte von 1,5 × 10 4 Zellen pro Vertiefung erhalten. </li><li> Umfassen die Platten mit den Deckel und sie außerhalb des Inkubators für 30 min, damit sich die Zellen an den Boden der Vertiefung zu sedimentieren. Dies wird Randeffekte zu minimieren. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.2 und 1.3 zweimal wiederholt, um eine Gesamtzahl von 27 Platten herzustellen. </li><li> Legen Sie die Platten bei 37 ° C und 5% CO 2 und Inkubation für 24 Stunden. </li></ol> 2. Tag 2: Behandeln Sie die Zellen mit Bibliothek Verbindungen ntent &quot;&gt; HINWEIS: Der Spectrum Sammlung kleinen Molekülbibliothek besteht aus 2000 Verbindungen in 8 Reihen und 10 Spalten in 25 Platten mit 96 Vertiefungen bei einer Konzentration von 10 mM in DMSO angeordnet Die Vertiefungen auf der ersten und letzten Spalten sind steuerungs leer. . Compound Screening-Tests werden typischerweise bei 1-10 uM Konzentration der Verbindung 8 durchgeführt. Die hier beschriebene Screening-Protokoll behebt 2 uM als Arbeitskonzentration und 24 Stunden nach dem Test Endpunkt. <ol><li> Auftauen 9 Substanzbibliothek Platten bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten Sie zwei Tröge mit sterilem PBS und PBS-0,5% DMSO-Lösungen und legen Sie sie auf dem Roboter Schreibtisch. Für jeden Bibliotheksplatte, vorbereitet und kennzeichnen ein Verdünnungsplatte - eine Polypropylen-U-Boden-Platte mit 96 Vertiefungen mit einem Arbeitsvolumen von mindestens 400 ul. Füllen Sie jede auch der Spalten 2-11 des Verdünnungsplatten mit 398 ul sterilem PBS mit festen Spitzen der Flüssigkeit absetzen. Füllen Spalten 1 und 12 mit 50 &amp; mgr; l steriler PBSmit 0,5% DMSO, um die Fahrzeugkonzentration in den Kontrollvertiefungen (0,02%) zu reproduzieren. </li><li> Legen Sie zwei Bibliotheksplatten, die entsprechend gekennzeichnet Verdünnungsplatten, zwei Kisten von 50 ul sterile Pipettenspitzen und sechs Zellen Platten auf dem Roboter Schreibtisch. Entdecken Zellen Platten. </li><li> Pipette 2 ul der 10 mM Stammlösung aus einer von zwei Bibliotheksplatten in der entsprechenden Verdünnungsplatte und gut mischen. Dies wird in einem Zwischenverbindungen Konzentration von 50 uM führen. Mit dem gleichen Satz Spitzen, verzichten 3 ul der 50 uM Verdünnung in 3 Barcode-weiß 96-well Platten mit Zellen. Diese Verdünnungsschema führt zu 2 uM Arbeits Konzentration jeder getesteten Verbindung. HINWEIS: Um unnötige Manipulationen mit den Spitzen zu vermeiden, einen vollständigen Satz von 96 Spitzen von Anfang an, auch wenn die Bibliotheksplatten enthalten nur 80 Verbindungen. Dies ist möglich, da die erste und die letzte Spalte der Bibliotheksplatten leer sind. </li><li> Setzen Sie die Pipettenspitzen und wiederholen Step 2.4 für die zweite Bibliothek Platte. </li><li> Decken Sie die Zellen Platten und bringt sie in den Inkubator für 24 Stunden. </li><li> Die Schritte 2,3-2,6 zwei weitere Male für die verbleibenden Bibliotheksplatten. </li></ol> 3. Tag 3: Führen Luciferase Assay Hinweis: Vor der Durchführung des Luciferase Assay ist es möglich, es mit einer Lebensfähigkeit der Zellen-Assay auf Basis von Reduktion von Resazurin, um eine Zelllebensfähigkeit-Index von jeder Vertiefung 9 erhalten zu multiplexen. Multiplexing Luciferase und Lebensfähigkeitstest Assays führt zu einer Verringerung der Luciferase-Signal, kann jedoch vernachlässigt werden, wenn die Zellen eine hohe genug Niveau der Luciferase-Aktivität. Luciferase-Aktivität kann durch eine Vielzahl von kommerziellen und selbst 10,11 Luciferase Assay-Reagenzien mit stabilen Lumineszenzsignals nachgewiesen werden. <ol><li> Äquilibrieren Sie die wiederhergestellten Luciferase-Reagens der Wahl auf Raumtemperatur. Achten Sie darauf, das Volumen ist ausreichend für alle getesteten Platten. Für 27 Tellers 170 ml Luciferase-Reagens erforderlich unter Berücksichtigung von Liquid Handling werden, Mulden Totvolumen und wiederholte Pipettierschritte. Gießen Sie die Luciferase-Reagens in einen Vorratsbehälter und legen Sie es auf den Roboter Schreibtisch. </li><li> Entfernen Sie 9 Platten mit Zellen aus dem Inkubator, legen Sie sie auf dem Roboter Schreibtisch, aufzudecken und zu warten, bis auf Raumtemperatur ins Gleichgewicht gebracht. Dann werden 50 ul des Luciferase-Reagens pro Well-Platte durch die Platte. Zwischen den Platten, eine Verzögerung gleich der Lumineszenz Lesezeit von einer Platte. Dies stellt sicher, dass alle Platten innerhalb gleicher Zeitintervall von der Zugabe von Reagenzien gemessen. </li><li> Nach einer 30-minütigen Inkubation, legen Sie die erste Platte in dem Luminometer und messen Lumineszenz nach einem kurzen Schütteln Schritt. Wiederholen Sie dies für alle Platten. Notieren Sie sich den Barcode jeder Platte und ordnen Sie auf die entsprechende Datendatei, um Fehler, die sich aus einer großen Zahl von Platten behandelt zu vermeiden. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,3 zweimal für die restlichen 18 Platten mit Zellen. </li&gt; <li> Sammeln Sie die übrigen Luciferase-Reagens und bewahren Sie sie bei -20 ° C. </li></ol> 4. Tag 4: Datenanalyse <ol><li> Prozess experimentellen Daten nach Normierung aller Proben zu dem Mittelwert der auf-Platte mit Träger behandelten Kontrollen. Für jede Bibliothek Verbindung, berechnen Sie den Mittelwert x und SD über dreifach. </li><li> Wähle bis regulierend und Herunterregulierung Treffern, wenn ein Schwellenwert von x ± k × SD, wo der Mittelwert X und SD werden über alle Test verarbeiteten Werte berechnet, und k ist eine definierte Konstante ist. </li><li> Wählen Sie eine beliebige Schwelle Abschaltung &lt;20% der mit Träger behandelten Kontrollen, wenn eine Reduktion der Luciferase-Signal wird wahrscheinlich mit der Verbindung Toxizität verbunden. Verwerfen der Zugriffe unterhalb dieser Schwelle wird deutlich verringern eine Reihe von falsch-positive Treffer in der Gegenüberprüfungen. HINWEIS: Anstelle von Steuerbasis Normalisierung, können experimentelle Daten Anwendung Z-Score oder die robuste analoge B s verarbeitet werdenKern 12. Darüber hinaus müssen alternative statistische Ansätze zur Treffer Auswahl stehen 12. </li></ol> 5. Counter-Screening HINWEIS: Verbindungen im primären Screen identifiziert (mit der Bezeichnung &quot;Hits&quot;) bestätigt und für die Spezifität durch eine Gegenüberprüfungen bewertet. <ol><li> Kirsche holen die ausgewählten Hits aus den in einzelnen 2D-Röhrchen mit Barcode gespeicherten Teilmengen und neue &quot;Hit-Platten&quot;, spart das entsprechende Layout. Vergessen Sie nicht, freie Stellen für die Kontrollen zu verlassen. HINWEIS: In Ermangelung eines effizienten Rosinenpickerei System, könnte man sowohl die Steuerung und 3&#39;-UTR-tragende Zellen parallel im Primärscreening zu testen. In diesem Fall spezifische Auswahl von Verbindungen mit Wirkungen hängt nur von der eingebrachten 3&#39;UTR nach dem primären Screening wodurch die Notwendigkeit von Gegenscreening möglich wird. Jedoch wird die Screening parallel in zwei Zelllinien, die den Assay verdoppelnKosten. </li><li> Nach dem Protokoll für das Primärscreening (Abschnitt &quot;Tag 1: Bereiten Sie und Samenzellen&quot;), für jeden &quot;Treffer Platte&quot; vorzubereiten drei 96-Well-Platten mit je CHP134-mycn3UTR und CHP134-CTRL stabile Zellen. </li><li> Nach dem Protokoll für das Primärscreening (Abschnitt &quot;Tag 2: Behandeln Sie die Zellen mit Bibliothek Compounds&quot;) Setzen Sie jede Hit Platte zu drei CHP134-mycn3UTR und drei CHP134-CTRL-Platten mit 2 &amp; mgr; Arbeitskonzentration zu behandeln. Anmerkung: Während der Gegenanzeige, die hier beschrieben wird, in dreifacher Ausführung im einzelnen Dosis von 2 &amp; mgr; M durchgeführt wird, kann es vorteilhaft sein, die Standard-Replikaten ersetzen und Testen der Treffer in 3 Konzentrationen von 10-fachen Verdünnungen im Bereich von 2 &amp; mgr; M bis 20 nM betragen. Die Anwendung dieses Ansatzes würde nicht nur die Daten von dem primären Screen zu bestätigen, sondern auch um vorläufige Dosis-Antwort-Daten auf den primären Zugriffe zu erhalten, minimiert Fehlalarmquote. In diesem Fall sollte eine andere Analyse Pipeline Anwen seined, um die experimentellen Daten bearbeiten und bestätigen die Hits. </li><li> Nach dem Protokoll für das Primärscreening (Abschnitt &quot;Tag 3: Führen Luciferase Assay&quot;), messen die Luciferase-Aktivität in allen CHP134-mycn3UTR und CHP134-CTRL-Platten. </li><li> Nach dem Protokoll für die Primärscreening (Abschnitt &quot;Tag 4: Data Analysis&quot;), Normalisieren experimentellen Daten von behandelten Vertiefungen zum Durchschnitt auf-Platte mit Träger behandelten Kontrollen und berechnet den Mittelwert und SD über Replikaten. Für jede getestete Verbindung, berechnen Sie die fache Änderung der Luciferase-Aktivität in CHP134-mycn3UTR vs. CHP134-CTRL-Zellen. Wählen Sie beliebige fache Veränderung Abschaltungen von&gt; 1,5 und Bedeutung p-Werte von &lt;0,01. HINWEIS: Bei den beschriebenen Testeinstellungen der bestimmende Parameter zur Treffer Spezifität ist ein bedeutender fache Änderung der Luciferase-Aktivität in CHP134-mycn3UTR vs. CHP134-CTRL-Zellen. Bei Bedarf könnte man auch prüfen, Verbindung Toxizität, indem gleichzeitig eine Zelllebensfähigkeitstest auf dem SEwählten Verbindungen. Dies kann besonders vorteilhaft sein, wenn die primäre Treffer werden in einer Dosis-Wirkungs-Analyse Gegen abgeschirmt. Für eine Einzeldosis, unsere Erfahrung zeigt eine starke Korrelation reduziert Luciferaseaktivität mit verringerter Lebensfähigkeit der Zellen 6. Daher verringerte die Luciferase-Aktivität in den Zielzellen als auch die Kontrollzellen als Indikator der Toxizität der Verbindung bei der getesteten Konzentration zu berücksichtigen. </li></ol>

<ol><li>Schwanhäusser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Tebaldi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+uncoupling+between+transcriptome+and+translatome+variations+after+a+stimulus+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells.</a> BMC Genomics. 13 (1), 220(2012).</li>
<li>Mitchell, S. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+properties+of+eukaryotic+mRNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Principles and properties of eukaryotic mRNPs.</a> Mol. Cell. 54 (4), 547-558 (2014).</li>
<li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m6A+RNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation.</a> Nat. Rev. Genet. 15 (5), 293-306 (2014).</li>
<li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+3%E2%80%99+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of the 3’ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA Biol. 9 (5), 563-576 (2012).</li>
<li>Sidarovich, V., Adami, V., Quattrone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cell-Based+High-Throughput+Screen+Addressing+3%E2%80%99+UTR-Dependent+Regulation+of+the+MYCN+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A Cell-Based High-Throughput Screen Addressing 3’ UTR-Dependent Regulation of the MYCN Gene.</a> Mol. Biotechnol. 56 (7), 631-643 (2014).</li>
<li>Cheung, N. -K. V., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblastoma%3A+developmental+biology%2C+cancer+genomics+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 13 (6), 397-411 (2013).</li>
<li>Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+early+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Principles of early drug discovery.</a> Br. J. Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li>
<li>Herbst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexing+a+high-throughput+liability+assay+to+leverage+efficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Techn%22%5BJournal%5D)">Multiplexing a high-throughput liability assay to leverage efficiencies.</a> Assay Drug Dev. Techn. 7 (3), 294-303 (2009).</li>
<li>van Olst, E. S. iebring-, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affordable+luciferase+reporter+assay+for+cell-based+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Affordable luciferase reporter assay for cell-based high-throughput screening.</a> J. Biomol. Screen. 18 (4), 453-461 (2013).</li>
<li>Baker, J. M., Boyce, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+functional+screening+using+a+homemade+dual-glow+luciferase+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay.</a> J. Vis. Exp. (88), (2014).</li>
<li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat. Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).</li>
<li>Hitti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+ribosomal+protein+promoter-based+reporter+system+for+selective+assessment+of+RNA+stability+and+post-transcriptional+control%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A versatile ribosomal protein promoter-based reporter system for selective assessment of RNA stability and post-transcriptional control.</a> RNA. 16 (6), 1245-1255 (2010).</li>
<li>Oikonomou, P., Goodarzi, H., Tavazoie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+regulatory+elements+in+conserved+3%E2%80%99+UTRs+of+human+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of regulatory elements in conserved 3’ UTRs of human transcripts.</a> Cell Rep. 7 (1), 281-292 (2014).</li>
<li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> J. Vis. Exp. (87), (2014).</li>
<li>Conne, B., Stutz, A., Vassalli, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3%E2%80%99+untranslated+region+of+messenger+RNA%3A+A+molecular+%E2%80%9Chotspot%E2%80%9D+for+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">The 3’ untranslated region of messenger RNA: A molecular “hotspot” for pathology.</a> Nat. Med. 6 (6), 637-641 (2000).</li>
<li>Cheneval, D., Kastelic, T., Fuerst, P., Parker, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+methods+to+monitor+the+modulation+of+mRNA+stability%3A+a+novel+approach+to+drug+discovery+and+therapeutic+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A review of methods to monitor the modulation of mRNA stability: a novel approach to drug discovery and therapeutic intervention.</a> J. Biomol. Screen. 15 (6), 609-622 (2010).</li>
<li>Pascale, A., Govoni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+world+of+post-transcriptional+mechanisms%3A+is+their+deregulation+a+common+link+for+diseases%3F+Focus+on+ELAV-like+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The complex world of post-transcriptional mechanisms: is their deregulation a common link for diseases? Focus on ELAV-like RNA-binding proteins.</a> Cell. Mol. Life Sci. 69 (4), 501-517 (2012).</li>
<li>Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+pre-mRNA+processing+and+altered+architecture+of+3%E2%80%99+untranslated+regions+contribute+to+the+development+of+human+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Impaired pre-mRNA processing and altered architecture of 3’ untranslated regions contribute to the development of human disorders.</a> Int. J. Mol. Sci. 14 (8), 15681-15694 (2013).</li>
<li>Bhattacharyya, A., Trotta, C. R., Peltz, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+the+GEMS--a+novel+platform+technology+targeting+post-transcriptional+control+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Mining the GEMS--a novel platform technology targeting post-transcriptional control mechanisms.</a> Drug Discov. Today. 12 (13-14), 553-560 (2007).</li>
<li>Peltz, S. W., Welch, E. M., Trotta, C. R., Davis, T., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+post-transcriptional+control+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeting post-transcriptional control for drug discovery.</a> RNA Biol. 6 (3), 329-334 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Dieses Protokoll beschreibt einen zellbasierten Reportergen-Assay, der auf die Identifizierung von Modulatoren abzielt, die auf 3'-UTR-abhängige posttranskriptionelle Prozesse abzielen. Es umfasst das primäre Screening und das Gegenscreening und kann bei Bedarf von einem Zytotoxizitätstest begleitet werden. Das Ergebnis des primären Screenings ist eine Reihe wertvoller Wirkstoffkandidaten, deren Reproduzierbarkeit und Spezifität im Gegenscreening weiter validiert wird.
Die Identifizierung prim...

Für eine lange Zeit der Transkriptionsregulation der Genexpression wurde gedacht, eine wichtige, wenn nicht ausschließliche Rolle bei der Kontrolle der Proteinproduktion zu spielen. Immer mehr deutet jedoch an, dass nach der Transkriptionsregulation trägt so viel, wenn nicht mehr als, Transkriptionsregulation, zelluläre Proteinmenge 1,2 zu bestimmen. Post-Transkriptionskontrolle der Genexpression ist viel komplexer und aufwendiger, als es auf den ersten Gedanken. In der Tat, alle verschiedenen Phasen der Post-Transkriptionskontrolle sind entstanden, um zu regeln, einschließlich mRNA-Prozessierung, Lokalisierung, Umsatz, Übersetzung 3 sowie die neu beschriebene reversible RNA-Methylierung 4. Aus einer Reihe von post-transkriptionale Regulationsprozesse potenziell betroffenen nachfolgend beschriebene Test konzentriert sich auf solche, die &#39;untranslatierten Region (3&#39;-mRNA 3 UTR). 3&#39;UTR breit wirkt mRNA Schicksal hauptsächlich über spezifische Wechselwirkung von RNA-bindenden proteins und nicht-kodierenden RNAs seine regulatorischen Sequenzen und / oder Sekundärstrukturen 5. Daher werden kleine Moleküle, die diese Interaktionen zu verändern oder beeinträchtigen aufwärts Signaltransduktionswege die Balance, die Proteinmenge reguliert verschieben. Dieser Therapieansatz ist für den menschlichen Krankheiten, für die Beweise vorliegen, die zeigen, dass krankheitsrelevante Gene zu posttranskriptionale Verordnung, die somit eine potenzielles Ziel für pharmakologische Intervention ausgesetzt besonderer Bedeutung. Daher können Systeme erlauben zum Screenen von mRNA-Niveaus &quot;Modulatoren durch Beeinträchtigung posttranskriptionalen Kontrollmechanismen in einem Hochdurchsatzformat wertvolle Hilfsmittel bei der Identifizierung von potentiellen neuen Medikamenten zu werden. Die beschriebenen zellbasierten Reportergentest erlaubt die Identifizierung von Verbindungen, die mRNA Schicksal über Mechanismen abhängig von seinem 3 &#39;UTR modulieren. Es besteht aus mehreren Haupt cBAUTEILE (Abbildung 1) und erfordert einige vorbereitende Schritte, um die Durchführbarkeit des Assays zu überprüfen. Zunächst wird das Reporterkonstrukt entworfen, um das 3&#39;-UTR von einem Gen in der Nähe sind. Die 3&#39;-UTR an das Ende eines Reportergens wie Luciferase (1) verschmolzen ist. Alle Änderungen, die in der posttranskriptionellen Kontrolle Mechanismen, durch die eingelegte 3&#39;UTR ausgeübt wird, die Stabilität und / oder Translationseffizienz dieses chimären Transkript zu verändern, was zu vielfältigen Luciferase Ebenen. Daher ändert der Luciferaseaktivität dienen als indirektes Maß der betroffenen posttranskriptionale Regulation des Gens von Interesse. Die zweite Komponente des Systems ist ein Steuerreporterkonstrukt eine identische Expressionsplasmid, das das gleiche Reportergen exprimiert, jedoch keine 3&#39;-UTR enthalten. Die beiden Reporter Plasmide können im Labor konzipiert mit konventionellen Molekularbiologie Protokolle werden oder von kommerziellen Quellen bezogen. Die Auswahl einer geeigneten Zelllinie ist für den Assay Konstruktion. Welche Zelllinie ist die optimale Modell hängt von zahlreichen Faktoren, die von klinischen Anforderungen wie maximale Ähnlichkeit mit Pathologie, nur praktische Fragen wie Verfügbarkeit, Transfizierbarkeit und Wachstumseigenschaften. Wichtig ist, dass vor gehen sollte man sicherstellen, dass die Fusion des 3&#39;-UTR an den Reporter-Gen einen erwarteten Einfluß auf die Höhe des chimären Transkript. Das Fehlen signifikanter Unterschied in Luciferase-Signal von dem 3&#39;-UTR-Lager und Steuerreporterkonstrukte transient in den ausgewählten Zellen transfiziert würde, dass der 3&#39;-UTR ist nicht funktionsfähig in diesem zellulären Modell, woraufhin zur Suche von anderen vorge. Für die Hochdurchsatz-Format, müssen die 3 &#39;UTR-Lager und Steuer Luciferase-Reporter-Konstrukte stabil in der gewählten Zelllinie integriert werden. Mit einem stabil über transient transfiziert integriertZelllinie ist bevorzugt aus mehreren Gründen. Dadurch wird die Auswahl einer zellulären Modell inklusive schwer zu transfizierenden Zelllinien zu erweitern, verringern die Variabilität in den Daten, die aus Schwankungen der Transfektionseffizienz, sinken die Kosten. Außerdem, auf transiente Transfektion Zellen werden sehr oft mit einem DNA-Plasmid, die zur Sättigung des Systems überlastet. In diesen Einstellungen eine weitere Erhöhung der Reporterexpression könnte eine Herausforderung sein, was zu einer verminderten Empfindlichkeit gegenüber potenziellen upregulating Verbindungen. Schließlich, wenn alle Testkomponenten eingerichtet sind, ist es kritisch, bevor er in die Hochdurchsatz-Format, um die Durchführbarkeit des Tests bestimmen, dh, ob die Luciferase-Aktivität kann in der Tat nach oben und nach unten reguliert und zwar über dem eingesetzten 3 &#39;sein UTR. Die besten Kontrollen wären kleine Moleküle berichtet, dass die Stabilität oder die Übersetzbarkeit der mRNA durch die 3&#39;-UTR von Interesse zu modulieren. Wenn mit diesen istnicht möglich ist, werden Ersatzkontrollen imitieren die gewünschte Wirkung angenommen. Diese könnten miRNAs oder RNA-Bindungsproteine ​​bekannt, ihre Wirkung über die Bindung an der 3&#39;-UTR von Interesse auszuüben. Auswertung solcher Kontrollen vor dem primären Screening zeigt nicht nur die Funktionalität des entwickelten Assays, sondern ermöglicht auch eine Schätzung seiner Dynamikbereich, die Empfindlichkeit und Leistung in der Hochdurchsatz-Format. Mit dem beschriebenen Protokoll wir abgeschirmte eine 2.000-Substanzbibliothek 6. Neuroblastom, die häufigste extrakranielle solide Tumor des Kindesalters, wurde als biologisches Modell verwendet und die 3&#39;-UTR des MYCN Onkogen, dessen Verstärkung stark prognostiziert negativen Ergebnis von Neuroblastom, als Zielgen 7. Abbildung 2 skizziert die Versuchsanordnung. Das Screening wurde in drei Durchgängen mit der Chargengröße von 27 Platten in einem Arbeitsgang abgeschirmt unterteilt. Die Charge von 27 Platten enthalten Spectrum Kollektion BibliothekPlatten n.1-n.8 + n.25 (zum ersten Mal ausgeführt), n.9-n.16 + n.25 (zweiten Lauf) und n.16-n.24 + n.25 (dritte Piste), jeweils Platte dreifach abgeschirmt. Auf diese Weise wurde eine Bibliothek Platte (n.25) in allen drei Läufen die Ermöglichung interLauf Vergleich untersucht. Das Protokoll beschreibt eine einzige Serie von 9 dreifach getestet Bibliotheksplatten.

<table><tbody><tr><td>Kulturplatte 96 Well Weiß</td><td>PerkinElmer</td><td>6005688</td><td></td></tr><tr><td>StorPlate 96 Well U Boden (Verdünnungsplatte)</td><td>PerkinElmer</td><td>6008190</td><td></td></tr><tr><td>100 ml Einweg-Trog für Reagenzien</td><td>Tecan</td><td>10 613 048</td><td></td></tr><tr><td>300 ml Einweg-Roboter-Reservoir</td><td>VWR</td><td>PB12001301</td><td></td></tr><tr><td>Roboterspitzen DITI 50&nbsp; &mu; l Sterile</td><td>Tecan</td><td>30038607</td><td></td></tr><tr><td>Roboterspitzen DITI 200&nbsp; &mu; l Sterile</td><td>Tecan</td><td>30038617</td><td></td></tr><tr><td>Matrix 1,4 ml 2D mit Barcode, Röhrchen mit flachem Boden</td><td>Thermo Scientific</td><td>3711</td><td></td></tr><tr><td>ONE-Glo Luziferase Assay System&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E6120</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Lonza</td><td>BE12-918F</td><td></td></tr><tr><td>PBS-1x, ohne Ca2+, Mg2+</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 200&nbsp; mM</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>The Spectrum collection (Compound Library)</td><td>MicroSource Discovery Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Freedom EVO200 Roboter</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tecan F200 Multiplatten-Lesegerät&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

hochdurchsatz-screening für chemische modulatoren der post-transkriptionell regulierten genen

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Sowohl der Transkription und post-transkriptionelle Regulation haben einen großen Einfluss auf Gene Expression. Jedoch konzentrieren sich allgemein angenommen zellbasierten Screening-Assays auf der transkriptionellen Regulation, wobei im wesentlichen auf die Identifizierung von Promotor-Targeting-Moleküle ab. Dadurch werden posttranskriptionale Mechanismen weitgehend durch Genexpression gezielte Medikamentenentwicklung aufgedeckt. Hier beschreiben wir ein Assay auf Zellbasis bei der Untersuchung der Rolle von der 3&#39;-untranslatierten Region (3 &#39;UTR) in der Modulation des Schicksal der mRNA ist, sowie für die Identifizierung von Verbindungen in der Lage, ihn zu ändern. Der Test basiert auf der Verwendung eines Luziferase-Reporterkonstrukt, das die 3&#39;-UTR des Gens von Interesse stabil in einer krankheitsrelevanten Zelllinie integriert basiert. Das Protokoll wird in zwei Teile aufgeteilt, wobei die anfängliche Konzentration auf der primären Screening auf die Identifizierung von Molekülen beeinflussen Luciferase-Aktivität nach 24 Stunden der Behandlung ab. Der zweite Teil des Protokollbeschreibt die Gegen Screening notwendig, Verbindungen modulieren Luciferase-Aktivität spezifisch durch die 3&#39;-UTR diskriminieren. Neben dem detaillierten Protokoll und repräsentative Ergebnisse stellen wir wichtige Überlegungen über die Assay-Entwicklung und bei der Validierung des Treffers (en) des endogenen Ziel. Die beschriebene zellbasierten Reportergentest ermöglicht es den Wissenschaftlern, um Moleküle zu modulieren Protein-Ebene über posttranskriptionale Mechanismen abhängig von einer 3&#39;-UTR identifizieren.

Mit dem beschriebenen Ansatz, abgeschirmt wir eine 2.000-Substanzbibliothek für potentielle Modulatoren der posttranskriptionellen Kontrollmechanismen durch die 3&#39;-UTR des Gens MYCN ausgeübt wird. Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse des primären Screening von einer einzigen Bibliotheksplatte veranschaulicht. Luciferase-Signal in Prozent der mit Träger behandelten Kontrollen angezeigt, wurde bestimmt, indem die Luciferase-Aktivität in dreifacher Platten CHP134-mycn3UTR Zellen mit Verbindungen e...

Hier beschreiben wir einen zellbasierten Reportergen-Assay als wertvolles Werkzeug zum Screening chemischer Bibliotheken auf Verbindungen, die posttranskriptionelle Kontrollmechanismen modulieren, die durch 3' UTR ausgeübt werden.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Dieses Experiment untersucht chemische Bibliotheken auf Verbindungen, die posttranskriptionelle Kontrollmechanismen über die drei-strandige nicht übersetzte Region von Transkripten modulieren. Zunächst identifizieren Sie die drei-strandige nicht übersetzte Region des Interesses im Zielgen. Klonen Sie diese drei-strandige UTR in ein El-Luciferase-Kontrollreporter-Plasmid, um ein chimäres El-Luciferase-drei-strandiges-UTR-Transkript zu erzeugen.Anschießend stabil. Integrieren Sie die beiden Plasmide in eine krankheitsrelevante Zelllinie, säen Sie die Zellen, die den chimären Transkript tragen, in 96-Well-Platten aus, behandeln Sie sie 24 Stunden lang mit einer Bibliothek von Verbindungen und identifizieren Sie anschließend die Moleküle, die die Luciferase-Aktivität beeinflussen.Wählen Sie die ausgewählten Moleküle zur weiteren Validierungsscreening aus und behandeln Sie anschließend sowohl die Kontrollzellen als auch die Zellen mit dem Luciferase-3'-UTR-chimären Transkript mit einem gezielt ausgewählten Teil der Bibliothek. Die Ergebnisse werden unterscheiden, ob die Wirkung einer Verbindung über die 3'-unübersetzte Region oder über andere Vektorsequenzen vermittelt wird. Im Gegensatz zu den meisten berichterstattenden basierten Screening-Assays.Assays, die auf die Regulation der Transkription abzielen, sind zellbasierte Assays, die auf die Identifizierung von Verbindungen ausgerichtet sind, die die mRNA-Transkriptmengen über die drei prime und die translatierte Region modulieren. Gewinnen Sie die stabil transfizierten Neuroblastomzellen durch Trypsinierung. Verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von 2 × 10⁵ Zellen pro Milliliter.In RPMI mit 10 % FBS und 1 % L-Glutamin für 27 Platten. Bereiten Sie mindestens 250 Milliliter Zellsuspension vor, wobei Flüssigkeitsverluste durch Handhabung, tote Volumina in den Vorratsbehältern und wiederholte Pipettierschritte berücksichtigt werden. Gießen Sie anschließend die Zellsuspension in ein steriles Vorratsgefäß und stellen Sie es auf den Robotertisch.Laden Sie neun weiß-beschichtete 96er-Platten mit Barcode und eine Box mit 200-Mikroliter-Sterilpipettenspitzen auf den Robotertisch. Mischen Sie die Zellsuspension und geben Sie anschließend 75 Mikroliter Zellen in jedes Loch der neun Platten.Bedecken Sie die Platten und lassen Sie die Zellen 30 Minuten lang auf den Boden der Vertiefung sedimentieren, um Randeffekte zu minimieren. Danach platzieren Sie alle neun Platten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid und inkubieren sie 24 Stunden lang. Genauso verfahren Sie mit den verbleibenden Platten, jeweils neun auf einmal.Tauen Sie die Platten der Wirkstoffbibliothek bei Raumtemperatur auf. Füllen Sie einen Vorratstank mit steriler PBS und einen weiteren mit einer Lösung aus 0,5 % DMSO in PBS und stellen Sie diese auf den Robotertisch. Für jede Bibliotheksplatte.Bereiten Sie entsprechend vor und beschriften Sie. Eine Verdünnungsplatte. Füllen Sie nun jedes Loch der Spalten zwei bis elf der Verdünnungsplatten mit 398 µL steriler PBS.Füllen Sie anschließend die Spalten eins und 12 mit jeweils 50 µL 0,5 % DMSO in steriler PBS. Danach laden Sie die beiden Verdünnungsplatten. Zwei Bibliotheksplatten, zwei Boxen mit 50 µL sterilen Pipettenspitzen und sechs Zellplatten auf dem Robotertisch.Entfernen Sie nun die Abdeckung der Zellplatten, pipettieren Sie zwei Mikroliter der 10-Millimolar-Stammlösung von einer der beiden Bibliotheksplatten in die entsprechende Verdünnungsplatte und mischen Sie gründlich. Verwenden Sie dabei denselben Satz an Pipettenspitzen. Übertragen Sie drei Mikroliter der 50-Mikromolar-Verdünnung in die drei mit Barcode versehenen weißen 96-Well-Platten, die die Zellen enthalten.Ersetzen Sie den kompletten Satz an Spitzen und wiederholen Sie die Zellinduktionen für die zweite Bibliotheksplatte. Decken Sie die Kulturen ab und inkubieren Sie sie für 24 Stunden. Wiederholen Sie anschließend den Prozess der Verdünnung der Verbindung und der Zellinduktion für die verbleibenden Bibliotheksplatten.Den rekonstituierten Luciferase-Reagenz der Wahl auf Raumtemperatur anstellen. Das Luciferase-Vorratsgefäß auf den Roboterarbeitsplatz stellen und das Reagenz hineingießen. Neun Platten mit induzierten Kulturen aus dem Inkubator entnehmen.Stellen Sie sie auf den Robotertisch, nehmen Sie die Abdeckung ab und lassen Sie sie auf Raumtemperatur akklimatisieren. Geben Sie anschließend 50 µL des Luciferase-Reagens pro Vertiefung zwischen den Platten hinzu. Fügen Sie eine Verzögerung ein, die der Lumineszenzlesezeit einer Platte entspricht.Nach einer 30-minütigen Inkubation. Zunächst den Barcode der Platte erfassen, um ihn mit der entsprechenden Datendatei zu verknüpfen. Danach die erste Platte in das Luminometer geben und die Lumineszenz messen.Nach einem kurzen Schüttelschritt die Lumineszenz-Messungen für alle Induktionsplatten erneut durchführen. Danach das verbleibende Lucifer-Race-Reagenz sammeln und bei minus 20 Grad Celsius lagern. Sobald die experimentellen Daten des Primärscreenings ausgewertet sind, die Hits auswählen, um die Verbindungsspezifität mittels einer Gegenprüfung im Cherry-Picking-Verfahren zu bestätigen.Wählen Sie die ausgewählten Hits aus und erstellen Sie ein Layout für die neue Screening-Platte, einschließlich Positionen für Kontrollen. Erstellen Sie anschließend aus den in einzelnen 2D-barkodierten Röhrchen gelagerten Aliquots neue HIIT-Platten. Befolgen Sie dafür denselben Protokollablauf wie beim Screening.Bereiten Sie pro hi-Platte drei 96-Well-Platten jeder stabilen Zelllinie vor. Behandeln Sie die Zellen am nächsten Tag mit Bibliotheksverbindungen. Verwenden Sie jede hi-Platte, um drei Platten mit CHP 1 34 micken, drei mit prime UTR und drei Platten mit Kontrollzellen bei einer Arbeitskonzentration von zwei Mikromolar über einen Zeitraum von 24 Stunden zu behandeln.Messen Sie die Luciferase-Aktivität in allen CHP 1 34-Platten, den drei nicht übersetzten Bereichen und den Kontrollgruppen. Normalisieren Sie die experimentellen Daten aus den behandelten Vertiefungen wie bei der Datenanalyse im Primärscreening auf den Mittelwert der jeweiligen Plattenkontrollen mit Fahrzeugsubstanz. Berechnen Sie anschließend den Mittelwert und die Standardabweichung über die Wiederholungen für jede getestete Verbindung.Die Faltungsänderung der Luciferase-Aktivität in CHP 1 34 McIn drei-Prim-UTR im Vergleich zu CHP 1 34. Kontrollzellen wählten willkürliche Grenzwerte für die Faltungsänderung von mehr als 1,5 und signifikante P-Werte von weniger als 0,01. Dieses Experiment untersuchte eine Bibliothek mit 2000 Verbindungen auf potenzielle Modulatoren posttranskriptioneller Kontrollmechanismen, die über die drei-Prim-UTR des mic-Onkogens ausgeübt werden. Die Ergebnisse der Luciferase-Signale einer einzelnen, repräsentativen Bibliotheksplatte von 25 sind als Prozentsatz der mit Vehicle behandelten angegeben.Die Kontrollen zeigen, dass der Großteil der Verbindungen keine offensichtliche Wirkung auf das drei-Strang-UTR hatte. Die Treffer wurden ausgewählt, wobei der Mittelwert und die Standardabweichung über alle Testwerte berechnet wurden; Verbindungen, die die Luciferase-Aktivität unter 20 % senkten, deuten höchstwahrscheinlich auf eine ausgeprägte zelluläre Toxizität der Verbindung hin. Dieses Diagramm zeigt repräsentative Ergebnisse für die Gegenprüfung von vier ausgewählten Verbindungen, die als W, X, Y und Z gekennzeichnet sind. Sowohl die Verbindungen W als auch X führen zu einer erhöhten Luciferase-Expression aus dem Onkogen-drei-Strang-UTR-Reporter, wie der Unterschied in der Faltungsänderung und der T-Test zeigen. Beachten Sie, dass, obwohl die Wirkungen beider Verbindungen W und X tatsächlich vom drei-Strang-UTR abhängig sind, Verbindung W keine signifikante Wirkung auf die Zellviabilität hat.Während Verbindung X eine gewisse zytotoxische Aktivität zeigt, wie durch das normalisierte Luciferase-Signal in CHP 134-Kontrollzellen angegeben, zeigen weder Verbindung Y noch Verbindung Z bei einer Konzentration von zwei Mikromolar einen dreifünfstrich-UTR-abhängigen Effekt auf die Luciferase-Spiegel. Die bei der Primär-Screening-Analyse nach Behandlung mit Verbindung Y festgestellte verminderte Luciferase-Aktivität ist vielmehr eine Folge der Zytotoxizität. Im Fall von Verbindung Z beruht die erhöhte Luciferase-Aktivität auf einer unspezifischen, hinsichtlich der dreifünfstrich-UTR, Aktivierung des viralen Promotors.Da eine äquivalente Hochregulation sowohl in den Kontroll- als auch in den nicht translatierten Sätzen beobachtet wird, bedenken Sie bei diesem Hochdurchsatz-Assay, dass die Validierung des primären Effekts in den Kontrollzellen entscheidend ist, um Verbindungen, die tatsächlich über die drei End-unübersetzte Region wirken, von solchen zu unterscheiden, die über den Promotor wirken.

high-throughput-screening-for-chemical-modulators-post

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Verfahren zum Entwickeln und Validieren eines quantitativen Fluoreszenz-Assay zur Messung der Aktivität von Kalium Einwärtsgleichrichter (KIR) Kanäle für das Hochdurchsatz-Screening Verbindung wird vorgestellt.

High-throughput Screening niedermolekularer Modulatoren von Inward Gleichrichter-Kaliumkanäle

Wir präsentieren Ihnen eine schnelle und kostengünstige Screening-Methode zur Identifizierung von Transkriptionsregulatoren mit Hochdurchsatz-Roboter-Transfektionen und ein hausgemachtes Dual-Luciferase-Assay glühen. Dieses Protokoll erzeugt schnell direkten Seite-an-Seite funktionellen Daten für Tausende von Genen und ist leicht modifizierbar, um jedes Gen von Interesse zielen.

Hochdurchsatz-Screening mit einem Funktionshomemade Dual-Luciferase Assay-Schein

Das Erreichen einer Systemebene Verständnis zellulärer Prozesse ist ein Ziel der modernen Zellbiologie. Wir beschreiben hier Strategien zum Multiplexen Luciferase Reporter von verschiedenen zellulären Funktion Endpunkte zur Genfunktion mit genomweiten RNAi-Bibliotheken zu verhören.

Ein Multiplex-Luciferase-basierte Screening-Plattform zur Abfrage Krebs-assoziierte Signaltransduktion in kultivierten Zellen

Persistent Aktivierung inhibierenden G-Protein-gekoppelten Rezeptoren führt Sensibilisierung von Adenylylcyclase-Signalisierung. Um die wesentlichen molekularen Signalwege zu identifizieren, sind nonbiased Ansätze notwendig, aber diese Strategie erfordert die Entwicklung einer skalierbaren zellbasierten Assay-cAMP-Sensibilisierung. Hier beschreiben wir eine Sensibilisierung Assay für Kleinmolekül-und siRNA-Screening.

Drug-induzierte Sensibilisierung der Adenylatzyklase: Assay Straffung und Miniaturisierung für Small Molecule-und siRNA-Screening-Anwendungen

Hier beschreiben wir eine Methode, um eine gezielte siRNA "ubiquitome"-Bildschirm, um neue Ubiquitin und Ubiquitin-ähnliche Regulatoren des HIF1A-vermittelte zelluläre Antwort auf Hypoxie zu identifizieren durchzuführen. Dies kann zu jedem biologischen Weg, wo ein robuster Auslesen der Reporteraktivität ist angepasst werden.

siRNA Screening zu Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen System Regler der biologischen Stoffwechselwege in kultivierten Säugerzellen identifizieren

Wir präsentieren in der aktuellen Studie eine neuartige fluoreszenzbasierten Assays von einer transgenen Maus abgeleiteten Lymphozyten. Dieser Assay ist für Hochdurchsatz-Screening (HTS) von kleinen Molekülen dotiert mit einer Kapazität von entweder Hemmung oder Förderung der Lymphozytenaktivierung geeignet.

Ein Fluoreszenz-basierte Lymphocyte Assay geeignet für Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen

Hier stellen wir ein quantitatives und skalierbares Protokoll vor, um gezielte kleine Molekülbildschirme für Kinase-Regulatoren des naiv-grundierten pluripotenten Übergangs durchzuführen.

Eine einfache Methode zur Identifizierung von Kinasen, die die embryonale Stammzell-Pluripotenz durch Hochdurchsatz-Inhibitor-Screening regulieren

Dieses Protokoll beschreibt die kombinatorische Verwendung von ChIP-Seq, 4sU-Seq, total RNA-Seq und Ribosom profiling für Zelllinien und Primärzellen. Nachverfolgen von Änderungen im Transkriptionsfaktor verbindlich, de Novo Transkription, RNS-Verarbeitung, Umsatz und Übersetzung im Laufe der Zeit und zeigt den gesamten Verlauf der Ereignisse in aktivierten und/oder sich rasch verändernden Zellen ermöglicht.

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Um neue Regulatoren von Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, entwickelten wir einen Ansatz für die Bildschirmanordnung von lentiviralen oder retroviralen RNAi-Bibliotheken unter Verwendung eines auf Dual-Luciferase basierenden Transkriptions-Reporter-Assays. Dieser Ansatz bietet eine schnelle und relativ kostengünstige Möglichkeit, Hunderte von Kandidaten in einem einzigen Experiment zu überprüfen.

Identifizierung von Transkriptionsfaktor-Regulierern mit Medium-Throughput-Screening von Arrayed Libraries und einem Dual-Luciferase-basierten Reporter

Dieses Protokoll beschreibt einen Arbeitsablauf von Ex-vivo - oder In-vitro-Zellkulturen bis hin zur transkriptomischen Datenvorverarbeitung für ein kostengünstiges Transkriptom-basiertes Wirkstoff-Screening.

Kosteneffizientes transkriptomisches Wirkstoff-Screening

Lernen Sie ein zellbasiertes Reportergen-Assay zur Identifizierung chemischer Modulatoren der post-transkriptionellen Genregulation über die 3'-UTR. Diese Methode nutzt Luciferase-Reporterplasmide in krankheitsrelevanten Zelllinien.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Weitere Videos entdecken