Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Dieses Experiment durchsucht chemische Bibliotheken nach Verbindungen, die posttranskriptionelle Kontrollmechanismen über die drei wichtigsten untranslatierten Regionen von Transkripten modulieren. Identifizieren Sie zunächst die drei wichtigsten untranslatierten Regionen von Interesse im Zielgen. Klonieren Sie diese drei Primzahlen UTR in das El-Luziferase-Kontrollreporterplasmid, um ein chimäres El-Luziferase-Transkript mit drei Primzahlen zu erzeugen.

Dann stabil. Integrieren Sie die beiden Plasmide in eine krankheitsrelevante Zelllinie, säen Sie die Zellen aus, die das chimäre Transkript in 96 tragen. Well-Platten behandeln sie 24 Stunden lang mit einer Bibliothek von Verbindungen und identifizieren dann die Moleküle, die die Luciferase-Aktivität beeinflussen.

Wählen Sie die ausgewählten Moleküle für das weitere Validierungsscreening aus und behandeln Sie anschließend sowohl die Kontrollzellen als auch die Zellen, die das chimäre Transkript der Luciferase mit drei Primzahlen tragen, mit einer ausgewählten Bibliotheksuntergruppe. Die Ergebnisse werden unterscheiden, ob die Wirkung einer Verbindung über die drei primalen untranslatierten Regionen oder über andere Vektorsequenzen vermittelt wird. Im Gegensatz zu den meisten reporterbasierten Screening-Essays.

Diese Assays, die sich auf die Transkriptionsregulation konzentrieren, konzentrieren sich auf die Identifizierung von Verbindungen, die die mRNA-Transkriptspiegel über drei Prime- und translatierte Regionen modulieren. Ernte der stabil transfizierten Neuroblastomzellen mit Trypsin Asian. Verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von zwei mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter.

In RPMI mit 10% FBS und 1% L-Glutamin für 27 Platten. Bereiten Sie mindestens 250 Milliliter Zellsuspension unter Berücksichtigung der Handhabung der Flüssigkeit, des Trogtovolumens und wiederholter Pipettierschritte vor. Gießen Sie dann die Zellsuspension in ein steriles Reservoir und legen Sie es auf den Robotertisch.

Laden Sie neun weiße flache Strichcodes ein. Untere 96 Well-Platten und eine Schachtel mit sterilen Pipettenspitzen von 200 Mikrolitern auf dem Robotertisch. Mischen Sie die Zellsuspension und geben Sie dann 75 Mikroliter Zellen in jede Vertiefung mit neun Platten.

Decken Sie die Platten ab und lassen Sie die Zellen 30 Minuten lang auf dem Boden der Vertiefung sedimentieren, um Randeffekte zu minimieren. Stellen Sie dann alle neun Platten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid auf und inkubieren Sie 24 Stunden lang. Fahren Sie auf ähnliche Weise mit den restlichen Platten neun auf einmal fort.

Tauen Sie die Verbundbibliotheksplatten bei Raumtemperatur auf. Füllen Sie einen Trog mit sterilem PBS und einen anderen mit 0,5 % DMSO in PBS-Lösung und stellen Sie sie auf den Robotertisch. Für jeden Bibliotheksteller.

Vorbereiten und entsprechend etikettieren. Eine Verdünnungsplatte. Füllen Sie nun jede Vertiefung der Säulen, zwei bis 11 der Verdünnungsplatten mit 398 Mikrolitern sterilem PBS.

Füllen Sie dann die Spalten eins und 12 mit 50 Mikrolitern 0,5%DMSO in sterilem PBS. Laden Sie anschließend die beiden Verdünnungsplatten ein. Zwei Bibliotheksplatten, zwei Schachteln mit sterilen 50-Mikroliter-Spitzen und sechs Zellplatten auf dem Robotertisch.

Legen Sie nun die Zellplatten frei, pipettieren Sie zwei Mikroliter der 10 millimolaren Stammlösung von einer von zwei Bibliotheksplatten in die entsprechende Verdünnungsplatte und mischen Sie gut. Verwenden Sie die gleichen Tipps. Übertragen Sie drei Mikroliter der 50-Mikromol-Verdünnung in die drei weißen 96-Well-Platten mit Barcode, die die Zellen enthalten.

Tauschen Sie den vollständigen Satz Spitzen aus, und wiederholen Sie die Zellinduktion für die zweite Bibliotheksplatte. Decken Sie die Kulturen ab und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang. Wiederholen Sie dann den Verdünnungs- und Zellinduktionsprozess für die verbleibenden Bibliotheksplatten.

Äquilibrieren Sie das rekonstituierte Luciferase-Reagenz der Wahl auf Raumtemperatur. Stellen Sie das Luciferase-Reservoir auf den Robotertisch und gießen Sie das Reagenz hinein. Nehmen Sie neun Platten mit induzierten Kulturen aus dem Inkubator.

Stellen Sie sie auf den Robotertisch, decken Sie sie auf und gleichen Sie sie auf Raumtemperatur aus. Geben Sie dann 50 Mikroliter des Luciferase-Reagenzes pro Vertiefung zwischen die Platten. Führen Sie eine Verzögerung ein, die der Lumineszenz-Lesezeit einer Platte entspricht.

Nach einer 30-minütigen Inkubation. Notieren Sie zunächst den Barcode der Platte, um ihn mit der entsprechenden Datendatei zu verknüpfen. Legen Sie als Nächstes die erste Platte in das Luminometer und messen Sie die Lumineszenz.

Wiederholen Sie nach einem kurzen Schüttelschritt die Lumineszenzmessungen für alle Induktionsplatten. Sammeln Sie dann das restliche Luzifer-Rassenreagenz und lagern Sie es bei minus 20 Grad Celsius. Sobald die experimentellen Daten des primären Screenings verarbeitet sind, wählen Sie die Treffer aus, um die Spezifität der Verbindung durch eine Gegenscreening-Kirsche zu bestätigen.

Wählen Sie die ausgewählten Treffer aus und erstellen Sie ein Layout für die neue Rasterplatte, einschließlich der Positionen für die Steuerelemente. Erstellen Sie dann aus den Aliquoten, die in einzelnen 2D-Barcode-Röhrchen gespeichert sind, neue HIIT-Platten. Das gleiche Protokoll gilt für das Screening.

Bereiten Sie 3 96-Well-Platten jeder stabilen Zelllinie pro Hi-Platte vor. Behandeln Sie die Zellen am nächsten Tag mit Bibliotheksverbindungen. Mit jeder Hi-Platte werden innerhalb von 24 Stunden drei Platten mit CHP 1 34 micken, drei Prime-UTR- und drei Platten mit Kontrollzellen bei einer Arbeitskonzentration von zwei Mikromolaren behandelt.

Messung der Luziferase-Aktivität in allen CHP 1 34-Platten, den drei untranslatierten Primzahl- und Kontrollsätzen. Normalisieren Sie wie bei der Datenanalyse im primären Screening die experimentellen Daten aus den behandelten Wells auf den Durchschnitt der mit dem Plattenfahrzeug behandelten Kontrollen. Berechnen Sie dann den Mittelwert und die Standardabweichung über die Replikate für jede getestete Verbindung.

Die Faltungsänderung der Luciferase-Aktivität in CHP 1 34 McIn drei Primzahlen UTR gegenüber CHP 1 34. Kontrollzellen wählen beliebige Grenzwerte für vollständige Änderungen von mehr als 1,5 und Signifikanz-P-Werte von weniger als 0,01 aus. Dieses Experiment untersuchte eine 2000 umfassende Substanzbibliothek auf potenzielle Modulatoren posttranskriptioneller Kontrollmechanismen, die durch die drei Primzahlen der UTR des Mikrofons und des Onkogens ausgeübt wurden, die Ergebnisse der Luciferase-Signale einer einzelnen von 25 repräsentativen Bibliotheksplatten, die als Prozentsatz des behandelten Vehikels angezeigt wurden.

Die Kontrollen zeigen, dass die Mehrzahl der Verbindungen keinen offensichtlichen Effekt auf die drei Haupt-UTR hervorrief. Die Treffer wurden ausgewählt, bei denen der Mittelwert und die Standardabweichung über alle Assay-Werte berechnet wurden, Verbindungen, die die Luciferase-Aktivität unter 20% reduzieren, sind höchstwahrscheinlich ein Hinweis auf eine ausgeprägte zelluläre Toxizität der Verbindung. Diese Grafik zeigt repräsentative Ergebnisse für das Gegenscreening von vier ausgewählten Verbindungen, die als WX, Y und Z bezeichnet werden. Beide Verbindungen W und X führen zu einer erhöhten Luciferase-Expression aus dem Onkogen mit drei Haupt-UTR-Reportern, wie durch die Faltenänderungsdifferenz und den T-Test angezeigt wird. Beachten Sie, dass die Wirkungen beider Verbindungen W und X zwar wirklich von drei Haupt-UTR-Verbindungen abhängen, W jedoch keinen signifikanten Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen hat.

Während Verbindung X eine gewisse zytotoxische Aktivität zeigt, wie durch ein normalisiertes Luciferase-Signal in CHP 1 34 Kontrollzellen angezeigt wird, zeigen weder Verbindung Y noch Verbindung Z bei zwei mikromolaren Konzentrationen einen von drei Primzahlen abhängigen Effekt auf die Luziferasespiegel. Die verminderte Luciferase-Aktivität, die im primären Screening nach Behandlung mit Verbindung Y festgestellt wurde, ist eher eine Folge der Zytotoxizität. Im Fall von Verbindung Z ist die erhöhte Luciferase-Aktivität auf eine unspezifische Aktivierung des viralen Promotors in Bezug auf drei Primzahlen zurückzuführen.

Da eine äquivalente Hochregulation sowohl in Kontroll- als auch in untranslatierten Sets in diesem Hochdurchsatz-Assay beobachtet wird, denken Sie daran, dass die Validierung der Primärwärme in den Kontrollzellen entscheidend für die Unterscheidung der Verbindungen ist, die wirklich durch die drei wichtigsten untranslatierten Bereiche wirken, von den Verbindungen, die über den Promotor wirken.