Die Analyse der Autophagie in

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Autophagie in einem fadenförmigen Pilz hervorzurufen und zu beobachten. Dies wird erreicht, indem zunächst kleine Volumina eines nährstoffhaltigen Mediums mit Sporen oder kleinen Mycelstücken beimpft werden. Im zweiten Schritt werden Nährstoffentzugs-Pads in den Vertiefungen von Glasobjektträgern vorbereitet und anschließend das Inokulum auf die Pads übertragen.

Im letzten Schritt werden die Hungerplättchen in einer feuchten Kammer inkubiert, um die Autophagie zu induzieren. Letztendlich kann die Autophagie verfolgt werden, indem die Translokation fluoreszierender Markerproteine der gewünschten Art zu den Vakuolen mittels Fluoreszenzmikroskopie überwacht wird. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragestellungen im Bereich der Zellbiologie zu untersuchen, wie beispielsweise die Identifizierung neuer Verbindungen, die den Autophagieprozess modulieren.

Um ein Hungerexperiment vorzubereiten, falls der interessierende P cresa genum-Stamm auf grünem Reis aufbewahrt wird, geben Sie zunächst zwei bis drei Reiskörner, die mit satiniertem Mycel bedeckt sind, in ein 1,5-Mikrozentrifugenröhrchen und füllen das Röhrchen mit 500 Mikrolitern Hefeextrakt-Glukose-Wachstumsmedium oder breitem GG-Medium. Vortexen Sie danach das Röhrchen 30 Sekunden lang, damit sich die Sporen vom Reis lösen, und inkubieren Sie das Röhrchen einen Tag bei Raumtemperatur. Verdünnen Sie am nächsten Tag die Sporensuspension in sterilem Leitungswasser auf eine Konzentration von 1 zu 50 und mischen Sie gründlich, falls der p cryogen-Stamm auf Agar aufbewahrt wird.

Überführen Sie mit einer Pipettenspitze kleine Stücke des Myzels in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das 400 Mikroliter sterilem Leitungswasser und etwa 100 Milligramm Glasperlen enthält. Vortexen Sie danach das Röhrchen zwei Minuten lang, damit die Mycelien fragmentiert werden. Um das PCE-Genum auf einem Hungermedium zu kultivieren, erwärmen Sie zunächst die Heizplatte auf etwa 60 Grad Celsius.

Als Nächstes werden zwei Gramm Aros in 100 Milliliter Leitungswasser in einer Mikrowelle erhitzt, bis die resultierende Lösung vollständig klar ist, während das Aros auf etwa 60 Grad Celsius abkühlt. Beschriften Sie je eine 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenprobe mit 400 Mikrolitern sterilen Leitungswassers oder einer Wirkstofflösung. Anschließend erwärmen Sie die Röhrchen und Objektträger mindestens 60 Sekunden lang auf der Heizplatte.

Übertragen Sie 400 Mikroliter 60 Grad Celsius heißes Aros auf alle Röhrchen, wodurch das Gesamtvolumen in jedem Röhrchen auf 800 Mikroliter ansteigt, und wirbeln Sie die Röhrchen kurz an. Stellen Sie die Röhrchen danach wieder auf die Heizplatte, um eine vorzeitige Verfestigung zu verhindern. Pipettieren Sie nun 140 Mikroliter der entsprechenden Aros-Lösung in die Vertiefung jedes Objektträgers. Achten Sie darauf, keine Blasen zu erzeugen, und glätten Sie das Aros unmittelbar mit Deckgläsern. Anschließend lassen Sie die Objektträger etwa vier Minuten ruhen.

Wenn die Aros-Pads bei Raumtemperatur erstarrt sind, entfernen Sie vorsichtig mit dem Daumen oder Zeigefinger die Deckgläser und legen Sie die Objektträger mit den Pads in eine feuchte Kammer. Geben Sie anschließend fünf Mikroliter der zuvor hergestellten P. er genum-Lösung mittig auf das Hungerpad und wickeln Sie die feuchte Kammer zur zusätzlichen Vermeidung von Austrocknung in eine Plastiktüte, wobei darauf zu achten ist, die Box nicht zu stark zu bewegen oder die Kulturen zu stören. Danach lagern Sie die beimpften Proben mindestens 20 Stunden bei Raumtemperatur, bevor Sie die Analysen durchführen.

Am nächsten Tag die Objektträger auf trockenes Tissue-Papier übertragen und anschließend 50 Mikroliter Wasser auf jedes Hungermedium geben. Mit einem Deckglas das überschüssige Wasser herausdrücken und mit frischem Tissue-Papier entfernen. Verwenden Sie dann für jeden Objektträger ein 20×-Objektiv, um einen Überblick über das Mycelwachstum zu erhalten.

Um die Lokalisation des GFP im Hy-Fi zu beurteilen, öffnen Sie die Bilder mit dem 63x- oder 100x-Objektiv. Legen Sie die Objektträger nach jeder Betrachtung schließlich wieder in die Feuchtkammer zurück, bis zum nächsten experimentellen Zeitpunkt.

In diesen Bildern wurde der G-F-P-S-K-L-P Creo Genum-Stamm verwendet, um den Peroxisom-Abbau nach 20 Stunden Inkubation zu bewerten. GFP wurde in den Vakuolen nicht beobachtet, und auch diese Organellen waren nicht vergrößert. Nach 40 Stunden Wachstum konnten jedoch GFP-markierte Vakuolen in einigen Hyphen sichtbar gemacht werden, was auf die Aktivierung der Autophagie hinweist, wobei eine stärkere GFP-Fluoreszenz und vergrößerte Vakuolen nach 60 Stunden weiter beobachtet wurden.

In diesem Experiment wurde ein Delta-80-G-eins-Mutant von p caressa Genum als negativer Kontrollstamm verwendet. Beachten Sie, dass keine Vakuolenvergrößerung und kein GFP nachweisbar sind, selbst nach 60 Stunden Wachstum. Als positiver Kontrollansatz wurde das Autophagie-stimulierende Medikament Rapamycin verwendet, wie bei dem unbehandelten G-F-P-S-K-L-Stamm beobachtet. Mit GFP markierte Vakuolen wurden nach 40 Stunden Wachstum sichtbar, wobei das Hy-Fi nach 60 Stunden vollständig mit großen, GFP-haltigen Vakuolen gefüllt war.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Autophagie in Mentis-Pilzen analysiert.