Imaging Ca

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, kalziuminduzierte Signale, die durch Lichtreize in den Zapfenzellen der Mausretina hervorgerufen werden, mithilfe eines fluoreszenten Biosensors aufzuzeichnen. Dies wird erreicht, indem die Retina aus einer transgenen Mauslinie isoliert wird, die einen genetisch kodierten Kalziumsensor ausschließlich in den Zapfenzellen exprimiert. Der zweite Schritt besteht darin, vertikale Schnitte des retinalen Gewebes anzufertigen.

Anschließend werden die Netzhautschnitte auf Deckgläsern aufgebracht und unter ein Zwei-Photonen-Mikroskop platziert. Der letzte Schritt besteht darin, Kalziumsignale aus den einzelnen synaptischen Endigungen der Zapfenphotorezeptoren als Reaktion auf Lichtstimulation aufzuzeichnen. Letztendlich werden die aufgezeichneten Kalziumsignale offline analysiert.

Mithilfe dieser Methode können wir die Aktivität vieler Mais-Futterrezeptoren gleichzeitig mit subzellulärer Auflösung aufzeichnen. Dies ist der Hauptvorteil gegenüber bestehenden Techniken wie elektrischen Einzelzell-Ableitungen, die schwieriger und zeitaufwändiger sind. Die Frage, die wir daher untersuchen möchten, lautet, ob und wie Calcium an der Photorezeptor-Degeneration beteiligt ist.

Mithilfe dieser Methode können wir bestimmen, ob ein Calciumeinstrom die Photorezeptor-Degeneration verursacht oder ob er lediglich eine Folge des Zelltods ist. Personen, die mit dieser Methode neu beginnen, haben in der Regel vor allem deshalb Schwierigkeiten, weil die Lichtempfindlichkeit der Netzhaut von Woche zu Woche erhalten bleiben muss und daher alle empfindlichen Schritte – einschließlich der Netzhaut-Dissektion und der Schnitterstellung – unter rotem Grünlicht durchgeführt werden müssen. Um dieses Verfahren zu beginnen, überführen Sie einen Mausaugapfel in eine Petrischale, die frisch mit Sauerstoff angereicherte extrazelluläre Lösung enthält.

Stechen Sie mit einer scharfen Injektionsnadel an einer beliebigen Stelle entlang der Grenze zwischen Hornhaut und Lederhaut in den Augapfel ein. Halten Sie das Auge anschließend mit einer Pinzette an der Lederhaut fest und führen Sie vorsichtig eine Scherenklinge in das Loch ein. Schneiden Sie entlang der ora serrata, um den vorderen Augenabschnitt vom Augenbecher zu trennen.

Schneiden Sie die Augenschale anschließend radial an der Position der Stiftmarkierung, um die dorsale Position auf der Netzhaut zu markieren. Positionieren Sie dann die Augenschale so, dass der dorsale Schnitt nach außen weist. Greifen Sie die Sklera auf der linken und rechten Seite der Augenschale, indem Sie die Pinzettenspitzen zwischen Netzhaut und Sklera einführen.

Anschließend lösen Sie die Netzhaut, indem Sie vorsichtig den skleralen Teil des iica nach innen umstülpen. Schließlich durchtrennen Sie den Sehnerv, um die Netzhaut von der Sklera zu befreien. Halten Sie den Rand der Netzhaut mit einer Pinzette fest und entfernen Sie vorsichtig Ablagerungen und Glaskörper von der Netzhautoberfläche, indem Sie eine zweite Pinzette verwenden.

Wenn die Netzhautoberfläche sauber ist, führen Sie drei weitere kürzere radiale Schnitte durch. Tauchen Sie nun langsam einen Objektträger in die extrazelluläre Lösung in der Nähe des Gewebes ein. Ziehen Sie vorsichtig die Netzhaut mit der Ganglienzellseite nach oben auf den Objektträger, indem Sie am Rand anfassen, um mechanische Schäden und Faltung des Gewebes zu vermeiden.

Schneiden Sie als Nächstes mit einer gekrümmten Skalpellklinge ein Rechteck von etwa einem mal zwei Millimetern aus dem ausgewählten Netzhautbereich aus und wischen Sie überschüssige Flüssigkeit um das Gewebe herum ab. Legen Sie dann die vorbereitete Nitrocellulose-Fasermembran auf das Netzhautstück, sodass die Seite mit den Ganglienzellen an der Membran haftet. Geben Sie unverzüglich einen Tropfen extrazelluläres Medium auf die Membran, um das Gewebe fest darauf zu befestigen.

Überführen Sie das auf einer Membran montierte Netzhautgewebe in die Schneidekammer, die frische extrazelluläre Lösung enthält. Anschließend schneiden Sie die Netzhaut in vertikale Schnitte mit einer Dicke von 200 Mikrometern. Befestigen Sie mit Hilfe eines Gewebeklebers einen einzelnen, auf Membran montierten Schnitt auf einem Glasdeckel, der zuvor mit Hochvakuumfett vorbereitet wurde.

Halten Sie die Glasoberfläche unterhalb der Netzhaut fettfrei. Fügen Sie danach einen Tropfen extrazellulärer Lösung zu jedem am Deckglas montierten Schnitt in der Haltekammer bei Raumtemperatur hinzu. Leiten Sie Carbogen in die Kammer ein, indem Sie ein kleines Wasserreservoir durchbläsen, um die Atmosphäre in der Haltekammer feucht zu halten.

Lassen Sie die Schnitte 10 bis 15 Minuten im Haltebehälter ruhen, bevor Sie sie nacheinander in die Ableitungskammer überführen. Überführen Sie einen Schnitt aus dem Haltebehälter in die Ableitungskammer und beginnen Sie unverzüglich mit der Perfusion mit einer angesäuerten extrazellulären Lösung. Halten Sie eine Perfusionsgeschwindigkeit von zwei Milliliter pro Minute und eine Temperatur von 37 Grad Celsius aufrecht.

Im Aufnahmekammer. Verwenden Sie ein 20x0,95-NA-Wasserimmersionsobjektiv und eine CCD-Kamera in Kombination mit einer Infrarot-LED unterhalb der Aufnahmekammer. Um den Netzhautschnitt zu lokalisieren, starten Sie das Zwei-Photonen-Bildgebungssystem gemäß den Angaben des Herstellers.

Schalten Sie als Nächstes den Laser ein und stellen Sie ihn auf 860 Nanometer ein. Schalten Sie die beiden Detektionskanäle für die Fluoreszenzbildgebung von ECFP und Citrin ein. Steuern Sie anschließend mithilfe der Bildaufnahmesoftware das Zweiphotonenmikroskop, um eine Reihe von Zapfenendigungen zur Aufnahme auszuwählen; setzen Sie die Bildaufnahme auf 128 mal 16 Pixel-Bilder oder eine ähnliche Konfiguration, und beschränken Sie den gescannten Bereich auf die Zapfenendigungen, um eine Bleiche der Photopigmente in den äußeren Segmenten zu vermeiden.

Schalten Sie den Laser ein. Lassen Sie die Zapfen 20 bis 30 Sekunden lang an den Scanning-Laser und das stimulierte Hintergrundlicht adaptieren, bevor Sie Lichtreize präsentieren oder pharmakologische Substanzen anwenden. Beginnen Sie nun mit der Präsentation der beliebigen Reize.

Die Reize werden erzeugt, indem die Intensität der beiden LEDs über die Zeit moduliert wird, wobei eine Mikroprozessorplatine verwendet wird, die von einer angepassten Software gesteuert wird. Anschließend beginnen Sie mit der gleichzeitigen Aufnahme der beiden Fluoreszenzkanäle mithilfe der jeweiligen Bildaufnahmesoftware. Die Aufnahmen konzentrierten sich auf die synaptischen Endigungen der Zapfen-Photorezeptoren in den Netzhautschnitten.

Dies ist ein Beispiel einer aufgezeichneten Region mit sieben einzelnen Endigungen. Die Fluoreszenz wurde mit zwei Kanälen aufgezeichnet, einer für den freien Szepter-Citrin und einer für den FRET-Donor ECFP. Dargestellt sind hier die lichtinduzierten Änderungen der Citrin- und ECFP-Fluoreszenz, die in einer einzelnen Region von Interesse aufgezeichnet wurden.

Und hier sind die Kalziumantworten eines Zapfenendes auf eine Serie von jeweils eine Sekunde langen, hellen Lichtblitzen in Abständen von fünf Sekunden. Diese Abbildung zeigt die beispielhafte quantitative Analyse lichtinduzierter Kalziumantworten in Zapfen. Und hier sind die lichtinduzierten Kalziumantworten von einem einzelnen Zapfenende.

Diese Abbildung zeigt die Bestimmung der mittleren Kalziumantwort. Der Ruhe-Kalziumspiegel repräsentiert die Grundlinie vor der Lichtstimulation, und die Antwortgröße ist ra, also die Fläche zwischen dem Ruhe-Kalziumspiegel und der maximalen Amplitude sowie zwischen der Kinetik des Ansprechens und der Rückbildung. Dieses Verfahren kann weiter ausgedehnt werden.

Beispielsweise können photorezeptorische Kalziumsignale unter unterschiedlichen pharmakologischen Bedingungen und bei starker Stimulation untersucht werden, um beispielsweise die Anpassung oder verschiedene Schritte der Phototransduktion im Detail zu erforschen. Diese Technik ermöglicht es, die Kalziumdynamik in Zapfenphotorezeptoren unter normalen physiologischen Bedingungen zu untersuchen. Dies ist insbesondere wichtig, um primäre und sekundäre Zapfenphotorezeptor-Degeneration bei menschlichen Erkrankungen, die zur Erblindung führen, wie beispielsweise Akrotopie oder Retinopathia pigmentosa, zu verstehen.