Visualisierung Streptococcus pneumoniae Innerhalb Cardiac Mikroläsionen und anschließende Herz Remodeling

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, ein reproduzierbares Protokoll für die Bildung von kardialen Mikroläsionen von ESMO im Herzen infizierter Mäuse zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem Mäuse mit ESMO infiziert werden und die Entwicklung von Bakteriämie ermöglicht wird, wodurch Bakterien Zugang zu den Herzgefäßen erhalten, wo sie in das Myokard eindringen und mikroskopisch kleine Läsionen bilden können. Dann werden die Herzen entweder paraffinhaltig eingebettet und konventionell gefärbt oder in einer OCT-Verbindung für die Immunfluoreszenzfärbung fixiert.

Die Auswertung der gefärbten Schnitte kann kardiale Mikroläsionen zeigen, die zufällig über das Myokard, die Kollagenablagerungen und die Rekonvaleszenz-My-Herz-Schnitte und Pneumokokken-Kapseln innerhalb der kardialen Mikroläsion verteilt sind. Ist Armand Brown ein Doktorand in meinem Labor? Diese Methode kann jedoch Aufschluss über die herzschädigenden Auswirkungen der S-Pneumonie während einer invasiven Pneumokokken-Erkrankung bei Mäusen geben.

Es kann auch auf kardiale Proben aus anderen Systemen wie nicht-menschlichen Primaten oder Menschen angewendet werden. Beginnen Sie mit dem Aufwachsen des ESMO-Serotyps mit vier Stämmen und Tiger vier in Todd-Hewitt-Brühe auf eine optische Dichte von 0,5 bei 620 Nanometern. Wenn das Pellet die richtige Dichte erreicht hat, wird die Kultur 10 Minuten lang bei 3.500 g gehalten.

Entfernen Sie dann den Überstand mit einer Vakuumleitung und resuspendieren Sie die Bakterien mit sterilem PBS bei 10.000 koloniebildenden Einheiten pro Milliliter. Betäuben Sie nun 10 bis 12 Wochen alte Klappe C-Mäuse und bestätigen Sie ihren anästhesierten Zustand mit einem sanften Zehenkneifen aus einer stumpfen Pinzette, einer Lotusspritze mit der Bakteriensuspension und einer 27- bis 30-Gauge-Nadel. Fassen Sie dann eine betäubte Maus mit einer Hand am Genick, während Sie mit der anderen Hand intraperitoneal 100 Mikroliter Suspension injizieren, und setzen Sie jede Maus wieder in ihren Käfig ein.

Die Mäuse wachen in der Regel 30 bis 40 Sekunden nach der Injektion auf. Die richtige Dosis der S-Pneumonie ist entscheidend, da sich die Mäuse sonst von einer Infektion erholen können oder zu schnell zu einer invasiven Pneumokokkenerkrankung kommt, um Läsionen zu entwickeln. Da jeder Bakterienstamm unterschiedlich viele Ohrlinsen hat, kann es Versuch und Irrtum erfordern, um die richtige Dosis zu ermitteln.

Lassen Sie die Infektion mindestens 24 Stunden bis zu einem frühen Stadium oder bis zu 30 Stunden bei einer fortgeschrittenen Infektion fortschreiten. Später euthanasieren Sie jede infizierte Maus. Zuerst eine Blutprobe entnehmen, den Schwanz mit einem Alkoholtupfer desinfizieren und ein zwei bis drei Millimeter langes Stück abschneiden.

Entnehmen Sie zwei Mikroliter Blut von der Schnittstelle. Verdünnen Sie das Blut seriell um das Zehnfache in PBS, das Natriumheparin enthält, in einer Einheit pro Milliliter. Platten Sie fünf Verdünnungsstufen auf Triptychon-Sojablut-Agar-Platten und inkubieren Sie sie über Nacht.

Am nächsten Tag wird die Kolonie gezählt. Fahren Sie mit der Entnahme des Herzens fort, wie im nächsten Abschnitt beschrieben. Alternativ 30 Stunden nach der Infektion.

Versuchen Sie, die Maus zu retten, indem Sie Ampicillin interperitoneal in 100 Mikrolitern Kochsalzlösung verabreichen. Verabreichen Sie 36 Stunden lang alle 12 Stunden Ampicillin und sammeln Sie Herzen zu den gewünschten Zeitpunkten. Ernten Sie zuerst das Herz.

Immobilisieren Sie die euthanasierte Maus in Rückenlage auf einer chirurgischen Plattform, besprühen Sie die Brust mit 70% Ethanol und tupfen Sie sie trocken. Öffnen Sie mit einer chirurgischen Schere und Pinzette die Brusthöhle. Entfernen Sie den Brustkorb und durchschneiden Sie das Zwerchfell, um Herz und Lunge freizulegen.

Schneiden Sie dann die Blutgefäße durch, die mit dem Herzen verbunden sind, und verwenden Sie eine Pinzette, um das Herz sanft zu entfernen, ohne Blutergüsse zu bekommen. Spülen Sie das Herz mit PBS und legen Sie es in eine Gewebeprobenentnahmekassette für den koronalen Schnitt. Übertragen Sie dann die Kassetten in eine 10%ige gepufferte Formalinlösung und senden Sie sie am nächsten Tag zur Paraffineinbettung.

In frühen Stadien können kardiale Läsionen durch ihre Veränderung des Farbaussehens und in einigen Fällen durch das Vorhandensein von Immunzellen identifiziert werden. Bei fortgeschrittenen Läsionen fehlen Immunzellen und sind groß. An ihrer Stelle befinden sich VA-ähnliche Läsionen.

Mit einem Fünf-Mikron-Herzschnitt auf positiv geladenen Objektträgern frieren Sie die Schnitte zunächst ein, tauen sie dann auf und lassen sie an der Luft trocknen. Fixieren Sie die Objektträger 10 Minuten lang bei 25 Grad Celsius in einer 10%igen neutral gepufferten Formin. Entfernen Sie dann das Fixiermittel mit drei Wäschen und PBS für fünf Minuten pro Wäsche.

Anschließend das Gewebe mit 0,2% Tritton X 100 in PBS für 15 Minuten durchlässig machen. Entfernen Sie das Waschmittel mit drei weiteren Wäschen in reinem PBS. Blockieren Sie dann das Gewebe nach einer Spülung in PBS eine Stunde lang mit 10%-Coat-Serum in PBS, bedecken Sie den Abschnitt zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit Antiserum.

Behandeln Sie Negativkontrollen mit naivem Kaninchen-Antiserum Da das Herzgewebe den XI-Immunfluoreszenz-Farbstoff leicht absorbiert, was zu hohen Hintergrundwerten führt, muss die Konzentration in der Inkubationszeit für verschiedene Arten von Antikörpern wahrscheinlich optimiert werden. Zwei Stunden später waschen Sie das Anti-Serum mit PBS ab. Ersetzen Sie dann die Lösung durch einen Sekundärantikörper und lassen Sie die Objektträger 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Tragen Sie nun DPI mit fünf Milligramm pro Milliliter auf und waschen Sie die Objektträger mit PBS.

Montieren Sie abschließend die Objektträger in den Boden, speichern Sie sie und bilden Sie sie mit konfokaler Mikroskopie ab. Beginnen Sie damit, das Paraffin zu entfernen und die Gewebeabschnitte mit Feuchtigkeit zu versorgen. Verwenden Sie Xylol-Waschungen, gefolgt von einer abgestuften Reihe von Alkoholwaschungen.

Baden Sie dann die Abschnitte fünf Minuten lang in 0,2 % Phosphometsäure, gefolgt von einer fünfminütigen Wasserspülung, spülen Sie den nächsten Fleck zwei Stunden lang mit 0,1 % schwerer roter und Ricsäure aus. Waschen Sie dann die Abschnitte drei Minuten lang in 0,01 % normaler Salzsäure und spülen Sie sie eine Minute lang mit 70 % Ethanol ab. Entwässern Sie nun die Schnitte, indem Sie die abgestufte Alkoholbadreihe umkehren, gefolgt von Xylol-Waschungen mit Hilfe des Lichtmikroskops, montieren Sie die Objektträger und bewerten Sie sie.

Mäuse entwickelten nach einer Auseinandersetzung mit dem Tiger eine invasive Pneumokokken-Krankheit. In den Ventrikeln wurden vier kardiale Mikroläsionen des Stammes beobachtet und zwischen 24 und 30 Stunden nach der Infektion wurde eine Zunahme der Läsionsgröße und -anzahl festgestellt, um zu überprüfen, ob sich eine Lungenentzündung tatsächlich innerhalb der Läsionen befand. Die Schnitte wurden für das Kapselpolysaccharid des Serotyps vier gefärbt, das von Tiger 4 produziert wurde.

Dies bestätigte das Vorhandensein von dicht gepackten und dichten Aggregaten innerhalb der Mikroläsionsstellen. Eine schwere Piro-Rotfärbung wurde an Herzschnitten von Mäusen durchgeführt, die mit Ampicillin und nicht infizierten Kontrollen gerettet worden waren. Bei Rettungen.

Es kam zu einer dramatischen Zunahme des Vorhandenseins und der Intensität des Flecks, wobei Bänder aus ehemaligen Läsionsstellen in den Ventrikeln strömten. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, Mäuse mit ausreichender Verwendung von S-Pneumonie zu infizieren, damit die Infektion mindestens 28 bis 30 Stunden lang fortschreiten kann, damit Bakteriämie und kardiale Mikroläsionen genügend Zeit haben, sich zu bilden.