Name: Visualisierung Streptococcus pneumoniae Innerhalb Cardiac Mikroläsionen und anschließende Herz Remodeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Erfahren Sie ein reproduzierbares Protokoll zur Visualisierung von Streptococcus pneumoniae in kardialen Mikroläsionen bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Herzremodellierung nach bakterieller Infektion.

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Diese Arbeit wurde durch den Zuschuss 13IRG14560023 der American Heart Association und NIH-Zuschüsse AI078972 und HL108054 an CJO unterstützt. Unterstützung für AOB kam vom NIH National Center for Advancing Translational Sciences, NIH ULTR001120 und F31 A110417701.

HINWEIS: Alle Maus-Experimente wurden überprüft und von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschüsse an der University of Texas Health Science Center in San Antonio (Protokoll # 13032-34-01C) zugelassen. Tierpflege und experimentelle Protokolle, um öffentliches Recht 89-544 (Tierschutzgesetz) und ihren Anhängen, Public Health Service Richtlinien, und der Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (US Department of Health &amp; Human Services) eingehalten werden. 1. Infektion <ol><li> Erhalten BALB / c Mäusen beiderlei Geschlechts im Alter von 10 bis 12 Wochen alt sind zwischen. HINWEIS: S. pneumoniae Serotyp 4 Dehnungs TIGR4 ist ein virulenter klinischen Isolat, das sequenziert wurde 16. </li><li> Wachsen TIGR4 in Todd-Hewitt-Brühe bei 37 ° C in 5% CO 2 bis zum Erreichen einer optischen Dichte (OD) 620 0,5 (entsprechend 1,0 x 10 &amp; sup8; koloniebildende Einheiten [CFU] / ml). Pellet die Pneumokokken-Kultur durch Zentrifugation für 10 min bei 3500 · g und Überstand mit einer Vakuumleitung. Auszusetzen und verdünnte Bakterien mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bis zu einer Endkonzentration von 1,0 x 10 4 KbE / ml. </li><li> Mit Hilfe eines Induktionskammer, betäuben Mäuse mit 2,5% Isofluran in Sauerstoff verdampft. Bestätigen narkotisierten Zustand von sanften toe Prise mit stumpfen Pinzette. <ol><li> Halten Sie den narkotisierten Maus durch sein Genick und aufrecht mit einer Hand zu injizieren jede Maus intraperitoneal (ip) mit 100 ul des S. pneumoniae Suspension mit einer Spritze mit einer 27-30 Gauge-Nadel (entsprechend einer Provokationsdosis von 1,0 x 10 3 CFU). Platzieren Sie die Maus wieder in seinem Käfig. Mäuse erwachen normalerweise 30-40 sec nach der Injektion. </li></ol></li><li> Lassen Sie die Infektion zu mindestens 24 (Anfang) oder 30 (erweitert) h fahren. <ol><li> Euthanize die Mäuse durch CO 2 Ersticken. Führen Genickbruch an der Maus zu gewährleisten verstorben. Sterbehilfe wird durch Entfernen bestätigtdes Herzens in Schritt 1.6. </li></ol></li><li> Desinfizieren Sie den Schwanz mit einem Alkoholtupfer und schneiden eine 2-3 mm Abschnitt. Sammel 2 ul Blut und seriell verdünnt das Blut 10-fach in PBS Natriumheparin 1 U / ml fünfmal enthält. Plattenreihenverdünnungen auf einer tryptischer Soja Blutagarplatte und Inkubation über Nacht bei 37 ° C in 5% CO 2. Am nächsten Tag extrapolieren aus Kolonie zählt das Niveau der Bakteriämie. </li><li> Immobilisierung der Maus in Rückenlage auf einer chirurgischen Plattform. Sprühen Sie die Brust mit 70% Ethanol und trocken tupfen. Mit chirurgische Scheren und Zangen öffnen Sie die Brusthöhle, nehmen Sie den Brustkorb und durchschneiden die Membran, um das Herz und die Lunge aus. Mit einer Schere schneiden die Blutgefäße mit dem Herzen verbunden und vorsichtig herausschneiden das Herz mit Sorgfalt zu vermeiden Druck mit einer Pinzette. </li><li> Spülen Sie das Herz mit PBS und dann in Gewebeprobenentnahme Kassetten, so dass Koronalschnitte würde während der Gewebeschneide erhalten zu platzieren. Für Paraffineinbettung, place die Kassetten in 10% gepuffertem Formalin-Lösung und den nächsten Tag zu senden für die Paraffineinbettung. <ol><li> Alternativ Flash-Freeze mit OCT-Verbindung innerhalb eines cryomold, die auf Trockeneis platziert wurde. </li></ol></li></ol> 2. Visualisierung der Herz Läsionen und Pneumokokken innerhalb Läsionen <ol><li> Reduzieren Sie in Paraffin eingebetteten Herzen Abschnitte, so dass die vier Kammern des Herzens in jedem Gewebeschnitt zu sehen sind. Geschnitten Folien in einer Dicke von 5 um. </li><li> Entparaffinieren und schmutz Folien mit Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) mit Standardverfahren 17. </li><li> Ansicht H &amp; E gefärbten Herz Abschnitte mit einem Lichtmikroskop bei niedrigen (100X, 200X) und hoher (Öl-Immersion: 400X, 1,000x) Vergrößerungen. Charakterisieren Herzen auf das Vorhandensein von Mikroläsionen im Myokard. Hier erwerben H &amp; E-Bilder mit einem Zeiss Axioskop 2 Mikroskop mit einer 100X 1.3 numerische Apertur Plan-Neofluar Ziel ausgestattet. HINWEIS: Bei inszeniert frühen Herz lesions werden von ihren Differential gefärbte Aussehen und in manchen Fällen das Vorhandensein von Immunzellen (Monozyten und Granulozyten), was anscheinend Monocyten diskriminiert. In fortgeschrittenen Läsionen, insbesondere diejenigen, bei 30 Stunden zu sehen, sind die Immunzellen fehlen und große vakuolenartigen Läsionen an ihrer Stelle beobachtet. Es ist wichtig anzumerken, dass, während Immunzellzufluss in den frühen Stadien der Herz Läsionsentwicklung auftreten kann es scheint nicht eine Voraussetzung sein. </li></ol> 3. Immunfluoreszenz-Mikroskopie für Pneumokokken innerhalb von Mikroläsionen <ol><li> Abschnitt Herz in cryomolds mit Mikrotom bis zu einer Dicke von 5 um und Ort Schnitte auf positiv geladene Objektträger aus Glas. Lassen Sie gefrorene Herz-Abschnitte zu tauen und der Luft trocknen. Fix Sektionen für 10 min in 10% neutral gepuffertem Formalin (pH 6,8-7,2 bei 25 ° C). </li><li> Waschen Folien (3x) in PBS für 5 min, 15 min permeabilisiert in 0,2% Triton X-100 in PBS, dann einmal in PBS gewaschen. </li><li> Block Gewebe Abschnit<html> auf auf Objektträger mit 10% Ziegenserum in PBS für 1 Stunde. </li><li> Spülen Folien mit PBS, Deckel und inkubieren Herzschnitte mit Kaninchen-Anti-Serotyp 4 Pneumokokken-Antiserum bei 1: 1000 in PBS mit 10% Ziegenserum für 2 Stunden bei 37 ° C. HINWEIS: Für negative Kontrollen sollten Ermittler naive Kaninchen-Antiserum verwenden </li><li> Nach dem Waschen mit PBS, Deckel und inkubieren Abschnitte mit 10% Ziegenserum-PBS mit Ziegen-Anti-Kaninchen-FITC-konjugiertem Antikörper bei 1: 2.000 für 30 Minuten bei 37 ° C. </li><li> Nach den Anweisungen des Herstellers, verwendet DAPI (4 &#39;, 6- Diamidino-2-Phenylindol) bei 5 mg / ml für die Visualisierung von eukaryotischen Kernen. Waschen und montieren Gewebeschnitte mit FluorSave. </li><li> Erwerben Fluoreszenzbilder mit einem konfokalen Mikroskopsystem bei niedrigen und hohen Vergrößerung. Stellen Sie die numerische Apertur entsprechend optimale Ergebnisse zu erhalten. Hier erwerben Fluoreszenzbilder mit einem konfokalen System mit einem 60X 1,42 numerischer Apertur Ziel. </li></ol>&quot;&gt; 4. Antibiotika Rettung von Septic Mäuse <ol><li> Beginnen mit Mäusen infiziert ip mit 1,0 x 10 3 CFU von TIGR4 wie zuvor in Schritt 1 angezeigt. </li><li> Beginnend bei 30 Stunden nach der Infektion zu verwalten pharmazeutischer Qualität ip Ampicillin (80 mg / kg Körpergewicht) in 100 ul Kochsalzlösung alle 12 Stunden 36 Stunden. Sammeln Herzen am gewünschten Zeitpunkt und Verfahren, wie in Schritt 1.6 für Paraffineinbettung und Gewebe, Schnitt beschrieben. </li></ol> 5. Kollagenablagerung Erkennung <ol><li> Mit Xylol und abgestufte Alkoholschlichten mit VE-Wasser, entparaffinieren und Hydrat Gewebeschnitte mit Standardverfahren 17. Gönnen Abschnitte mit einer wässrigen 0,2% Phosphormolybdänsäure für 5 Minuten einwirken lassen und mit VE-Wasser für 5 min. </li><li> Fleckenabschnitte mit 0,1% Sirius Rot in Pikrinsäure für 2 h bei Raumtemperatur. </li><li> Auswaschbereiche in 0,01 N Salzsäure für 3 min und Spülen mit 70% Ethanol für 1 min. </li><li> Dehydrate die Abschnitte mit dem identisch, aber in umgekehrter Reihenfolge der Waschgänge wie in 5.1 dargelegt, dehydrieren Herz Abschnitte bei der Steigerung und abgestuften Konzentrationen von Ethanol dann Xylol. </li><li> Berg Gewebeschnitte mit einem Befestigungslösung für mikroskopische Auswertung. </li><li> Um festzustellen, Regionen Kollagenablagerung, untersuchen Buntgewebeschnitten für Bereiche der tiefen Lese Färbung bei geringer und hoher Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop. Jeder Bereich, in den Kammern des Herzens, die rot ist, ist ein Bereich, wo Kollagen abgeschieden wurde. Bereiche ohne diese roten Flecken sind Websites von gesundem Gewebe fehlt Kollagenablagerung. Hier erwerben picro Sirius Red Bunt Bilder mit Hilfe eines Mikroskops mit einem 20X 0,5 numerische Apertur Ziel ausgestattet. HINWEIS: Die Atrium Flecken rot in gesunden Geweben. </li></ol>

<ol><li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+complications+in+patients+with+community-acquired+pneumonia%3A+incidence%2C+timing%2C+risk+factors%2C+and+association+with+short-term+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: incidence, timing, risk factors, and association with short-term mortality.</a> Circulation. 125, 773-781 (2012).</li>
<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+bacterial+pneumonia+is+associated+with+the+occurrence+of+acute+coronary+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Acute bacterial pneumonia is associated with the occurrence of acute coronary syndromes.</a> Medicine (Baltimore). 88, 154-159 (2009).</li>
<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+complications+in+patients+with+community-acquired+pneumonia%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+observational+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: a systematic review and meta-analysis of observational studies.</a> PLoS Med. 8, e1001048(2011).</li>
<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+stratification+for+cardiac+complications+in+patients+hospitalized+for+community-acquired+pneumonia.+Mayo+Clin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc%22%5BJournal%5D)">Risk stratification for cardiac complications in patients hospitalized for community-acquired pneumonia. Mayo Clin.</a> Proc. 89, 60-68 (2014).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+11+common+viral+and+bacterial+pathogens+causing+community-acquired+pneumonia+or+sepsis+in+asymptomatic+patients+by+using+a+multiplex+reverse+transcription-PCR+assay+with+manual+%28enzyme+hybridization%29+or+automated+%28electronic+microarray%29+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection of 11 common viral and bacterial pathogens causing community-acquired pneumonia or sepsis in asymptomatic patients by using a multiplex reverse transcription-PCR assay with manual (enzyme hybridization) or automated (electronic microarray) detection.</a> Journal Of Clinical Microbiology. 46, 3063-3072 (2008).</li>
<li>Musher, D. M., Rueda, A. M., Kaka, A. S., Mapara, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+pneumococcal+pneumonia+and+acute+cardiac+events%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The association between pneumococcal pneumonia and acute cardiac events.</a> Clin Infect Dis. 45, 158-165 (2007).</li>
<li>Brown, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+translocates+into+the+myocardium+and+forms+unique+microlesions+that+disrupt+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae translocates into the myocardium and forms unique microlesions that disrupt cardiac function.</a> PLoS Pathogens. In press, (2014).</li>
<li>Orihuela, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+receptor+initiates+bacterial+contact+with+the+blood+brain+barrier+in+experimental+meningitis+models%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Laminin receptor initiates bacterial contact with the blood brain barrier in experimental meningitis models.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119, 1638-1646 (2009).</li>
<li>Flick, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+elimination+of+the+binding+motif+on+fibrinogen+for+the+S.+aureus+virulence+factor+ClfA+improves+host+survival+in+septicemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Genetic elimination of the binding motif on fibrinogen for the S. aureus virulence factor ClfA improves host survival in septicemia.</a> Blood. 121, 1783-1794 (2013).</li>
<li>Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+play+in+four+acts%3A+Staphylococcus+aureus+abscess+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation.</a> Trends Microbiol. 19, 225-232 (2011).</li>
<li>Arenal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+the+spatial+characteristics+of+myocardial+scar+tissue+determine+the+risk+of+ventricular+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Do the spatial characteristics of myocardial scar tissue determine the risk of ventricular arrhythmias.</a> Cardiovasc Res. 94, 324-332 (2012).</li>
<li>Deneke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+histopathology+of+electroanatomic+mapping+after+cooled-tip+radiofrequency+ablation+to+treat+ventricular+tachycardia+in+remote+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Human histopathology of electroanatomic mapping after cooled-tip radiofrequency ablation to treat ventricular tachycardia in remote myocardial infarction.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 1246-1251 (2005).</li>
<li>Bakker, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reentry+as+a+cause+of+ventricular+tachycardia+in+patients+with+chronic+ischemic+heart+disease%3A+electrophysiologic+and+anatomic+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Reentry as a cause of ventricular tachycardia in patients with chronic ischemic heart disease: electrophysiologic and anatomic correlation.</a> Circulation. 77, 589-606 (1988).</li>
<li>Verma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+successful+ablation+sites+and+the+scar+border+zone+defined+by+substrate+mapping+for+ventricular+tachycardia+post-myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Relationship between successful ablation sites and the scar border zone defined by substrate mapping for ventricular tachycardia post-myocardial infarction.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 465-471 (2005).</li>
<li>Wu, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+risk+for+ventricular+tachyarrhythmias+and+sudden+cardiac+death%3A+is+there+a+role+for+cardiac+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Cardiovasc+Imaging%22%5BJournal%5D)">Assessing risk for ventricular tachyarrhythmias and sudden cardiac death: is there a role for cardiac MRI.</a> Circ Cardiovasc Imaging. 5, 2-5 (2012).</li>
<li>Tettelin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+a+virulent+isolate+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae.</a> Science. 293, 498-506 (2001).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass in dieser Studie kein Interessenkonflikt besteht.

In diesem Bericht wird eine hohe Reproduzierbarkeit der Methode, S. induzieren pneumoniae vermittelten kardialen Mikroläsionen bei Mäusen während IPD und die Techniken für die Visualisierung demonstriert. Mäuse werden mit einer Dosis von Bakterien, die Schwelle des Immunsystems für die Abfertigung übertrifft, was zu einer hochgradigen Bakteriämie, ähnlich der, die bei der menschlichen Sepsis auftritt, und führt zu möglichen bakteriellen Translokation in den Herzmuskel infiziert. Für noch unbekannten Gr...

Krankenhausaufenthalt von Erwachsenen für ambulant erworbener Pneumonie (CAP) trägt eine dokumentierte Risiko für unerwünschte kardiale Ereignisse, die Sterblichkeit 1-4 beiträgt. In einer aktuellen Studie von Corrales-Medina et al. Herzkomplikationen wurden gefunden, um mit und / oder verantwortlich für 27% der Pneumonie-assoziierten Todesfälle 3 zugeordnet werden. Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken die), die häufigste Ursache der GAP und Sepsis 5, wurde direkt mit unerwünschter kardialer Ereignisse bei nicht weniger als 19% der erwachsenen Patienten zugelassen 6 verbunden. MACE mit Lungenentzündung sind neu oder verschlimmert Herzinsuffizienz, Herzrhythmusstörungen und Herzinfarkt in abnehmender Häufigkeit 6. In einer aktuellen PLoS Pathogens Artikel von Brown et al., S. pneumoniae wurde gefunden, fähig Translokation durch die Herz Gefäßendothel Eintritt in die myocardium, und die Bildung von diskreten nicht-eitriger mikroskopische Läsionen (Mikroläsionen) mit Bakterien in den Herzkammern während invasive Pneumokokkenerkrankung (IPD) 7 gefüllt. Der Nachweis der Herz Mikroläsion Bildung wurde in der Herzproben von nicht-menschlichen Primaten und Einzelpersonen, die Pneumokokkeninfektion erlegen beobachtet. Ebenso experimentell infizierten Mäusen reproduzierbar kardialen Mikroläsionen entwickelt. Bei Mäusen wurde Mikroläsion Größe und Anzahl positiv mit der Dauer und Schwere der Bakteriämie Ebenen Troponin in Seren und aberrante kardialen Elektro korreliert. Bakterielle Translokation in das Herz wurde gefunden, durch die gleichen Mechanismen für die Translokation des Pneumokokken durch die Blut-Hirn-Schranke und die Entwicklung einer Pneumokokken-Meningitis, dh Cholin-Bindungsprotein A vermittelte Invasion von vaskulären Endothelzellen in einem Laminin-Rezeptor und Platelet verantwortlich auftreten aktivierenden Faktor-Rezeptor-abhängigen Weise 8. MicrolesIonenbildung benötigt auch die Pneumokokken-porenbildende Toxin Pneumolysin, die gefunden wurde, um Kardiomyozyten 7 töten. Pneumokokken Herzmikroläsionen sind verschieden von eitrigen Weichgewebe und Herz Abszessen, die von anderen Gram-positive Bakterien einschließlich Staphylococcus aureus hervorgerufen werden. Diese werden durch einen einzelnen Brennpunkte der Bakterien durch Neutrophile und Fibrinablagerung 9,10 umgeben ist. Mikroläsionen von S. gebildet pneumoniae sind kleiner, im gesamten betroffenen Herz verteilt, und es fehlt Immun Zellinfiltrate. Während der frühen Stadien der Infektion, Mikroläsionen verursacht durch S. pneumoniae erscheinen als Bereiche der beschädigte oder entzündete Gewebe erinnert an die pathologische Anzeichen einer Kardiomyopathie. Einige Monozyten kann während dieser Zeit beobachtet werden, aber ihre Anwesenheit ist von kurzer Dauer und Läsionen schnell nekrotischen Stellen entstehen und bei gleichzeitig weiterhin gr mit Bakterien gefülltow Größe bis zum Tod des Tieres oder antimikrobielle Intervention. Wichtig ist, dass innerhalb 3 Tage der antibiotischen Intervention, starkes Immunzellinfiltration wird am ehemaligen Läsion beobachtet und dies wird durch robuste Kollagenablagerung begleitet. Ähnliche kardialen Remodeling wurde berichtet, kommen folgenden Infarkt mit nachhaltigen Folgen auf die Herzfunktion 11-15. So sind Mikroläsionen eine mögliche Erklärung für die unerwünschten kardialen Ereignissen, die während IPD und möglicherweise die erhöhte Inzidenz von Herz-Mortalität in rekonvaleszenten Menschen, die die Krankheit Folge überlebt haben, auftreten. Hierin wird Anweisungen auf dem experimentellen Mausmodell der IPD und Herz-Läsion Bildung und Visualisierung von kardialen Mikroläsionen in frühen und späten Stadien der Infektion zur Verfügung gestellt. Das Protokoll für die Erfassung der Kollagenabscheidung in Tieren, die von antimikrobiellen Intervention gespeichert wurden demonstriert. Das Ziel dieses Artikels ist es, facilitate die Forschung von anderen Forschern auf diesem wichtigen und neuartigen Pneumokokken-Pathologie.

<table><tbody><tr><td>Todd-Hewitt Brühe&nbsp;</td><td>Neogen</td><td>7161A</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Mischung&nbsp;</td><td>Tissue-Tek (Sakura Finetek)&nbsp;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Fisher Scientific (Acros)</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Serotyp 4 Pneumokokken Antiserum&nbsp;</td><td>Statens Serum Institut</td><td>16747</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen-FITC-Antikörper für Ziegen</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-096-144</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Fluorsave</td><td>Millipore</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>S70104</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9393</td><td></td></tr><tr><td>Phosphomolybdsäure 0,2%&nbsp;</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>26357-01</td><td></td></tr><tr><td>0,1 % Sirius Rot in Pikrinsäure&nbsp;</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>26357-02</td><td></td></tr><tr><td>0,01 N Salzsäure&nbsp;</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>26357-03</td><td></td></tr><tr><td>Gewebe-Greifmikroskop-Objektträger</td><td>Polysciences, Inc</td><td>24216</td><td></td></tr><tr><td>Paralube Vet Salbe</td><td>Dechra</td><td>12920060</td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylin- und Eosin-Färbeset</td><td>nicht spezifiziert&nbsp;</td><td></td><td>Norm</td></tr></tbody></table>

visualisierung<em&gt; streptococcus pneumoniae</em&gt; innerhalb cardiac mikroläsionen und anschließende herz remodeling

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Während Bakteriämie Streptococcus pneumoniae können über das vaskuläre Endothelium in das Myokard zu translozieren und bilden diskrete Bakterien gefüllte mikroskopische Läsionen (Mikroläsionen), die bemerkenswert sind aufgrund der Abwesenheit von infiltrierenden Immunzellen. Aufgrund ihrer Freisetzung von kardiotoxischen Produkte, S. pneumoniae im Mikroläsionen werden gedacht, um auf die Herzinsuffizienz, die häufig während der Knall invasive Pneumokokken-Erkrankungen bei Erwachsenen beobachtet bei. Hierin ist ein Protokoll zur experimentellen Maus-Infektion, die zu Herz Mikroläsion Bildung innerhalb von 30 Stunden führt reproduzierbar nachgewiesen. Der Unterricht wird auf Mikroläsion Identifikation in Hämatoxylin &amp; Eosin Herzschnitte und die morphologischen Unterschiede zwischen frühen und späten Mikroläsionen zur Verfügung gestellt werden hervorgehoben. Der Unterricht wird über ein Protokoll zur Überprüfung der S. bereitgestellt pneumoniae im Mikroläsionen mit Antikörpern gegen Pneumokokken-Kapselpolysaccharid undImmunfluoreszenzmikroskopie. Zuletzt wurde ein Protokoll für die Antibiotika-Intervention, infizierten Mäusen und für die Erfassung und Beurteilung der Narbenbildung in den Herzen der rekonvaleszenten Mäusen befreit ist. Zusammen werden diese Protokolle die Untersuchung der molekularen Mechanismen Pneumokokken Herz Invasion Kardiomyozyten Tod kardialen Remodeling als Folge der Exposition gegenüber S. erleichtern pneumoniae, und die Immunantwort auf das Pneumokokken im Herzen.

Visualisierung von Mikroläsionen von H &amp; E Herzmikroläsionen wurden in den Ventrikeln des H &amp; E gefärbten Herzschnitten von Mäusen mit IPD nach ihrer ip Herausforderung TIGR4 beobachtet. Figur 1 veranschaulicht die Zunahme der Größe dieser Läsionen zwischen 24 und 30 h nach der Infektion (hpi), mit einer größeren Anzahl von Hämatoxylin färbten (dh, lila-blau) Pneumokokken innerhalb der Läsion sichtbar. Mikroläsionen wurden durch eine vakuolenartigen...

Streptococcus pneumoniae bildet diskrete, nicht eitrige mikroskopische Läsionen im Herzen. Dargestellt ist das Protokoll für ein Mausmodell der kardialen Mikroläsionsbildung. Es werden Anweisungen zur Visualisierung von Mikroläsionen mittels Mikroskopie, zur Unterscheidung zwischen frühen und späten Mikroläsionen und Methoden zum Nachweis des kardialen Umbaus im Herzen von Rekonvaleszenten gegeben.

Visualisierung<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Innerhalb Cardiac Mikroläsionen und anschließende Herz Remodeling

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, einen reproduzierbaren Protokollablauf zur Bildung von ESMO-kardialen Mikroläsionen im Herzen infizierter Mäuse zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem Mäuse mit ESMO infiziert werden und eine Bakteriämie ausbilden, wodurch die Bakterien Zugang zum kardialen Gefäßsystem erhalten, in den Myokardgewebe eindringen und mikroskopische Läsionen bilden können. Anschließend werden die Herzen entweder in Paraffin eingebettet und konventionell gefärbt oder in OCT-Compound fixiert, um immunfluoreszenzfarbliche Färbungen durchzuführen.Die Auswertung der gefärbten Schnitte kann zufällig im Myokard verteilte mikroscopische Herdesläsionen, Kollagenablagerungen und genesende Myokardschnitte sowie Pneumokokkenkapseln innerhalb der kardialen Mikroläsionen zeigen, was das Verfahren veranschaulicht. Ist Armand Brown ein Doktorand in meinem Labor? Obwohl diese Methode Einblicke in die kardialen Schädigungen durch S. pneumoniae während einer invasiven Pneumokokkeninfektion bei Mäusen ermöglichen kann.Sie kann auch auf Herzproben aus anderen Systemen wie nichtmenschlichen Primaten oder Menschen angewendet werden. Beginnen Sie damit, den ESMO-Serotyp-Vier-Stamm Tiger vier in Todd-Hewitt-Brühe auf eine optische Dichte von 0,5 bei 620 Nanometern anzuziehen. Wenn die korrekte Dichte erreicht ist, pelletieren Sie die Kultur bei 3.500 ×g für 10 Minuten.Entfernen Sie anschließend den Überstand mithilfe einer Vakuumleitung und resuspendieren Sie die Bakterien in steriler PBS-Pufferlösung mit einer Konzentration von 10.000 koloniebildenden Einheiten pro Milliliter. Betäuben Sie nun 10 bis 12 Wochen alte Valve C-Mäuse und überprüfen Sie den betäubten Zustand durch leichtes Zupinzen der Zehen mit einer stumpfen Pinzette. Laden Sie eine Lotusspritze mit der bakteriellen Suspension und befestigen Sie eine Nadel mit einer Größe von 27 bis 30 Gauge. Halten Sie eine betäubte Maus mit einer Hand am Nackenfell fest und injizieren Sie mit der anderen Hand 100 Mikroliter der Suspension intraperitoneal. Stellen Sie jede Maus danach zurück in ihren Käfig.Die Mäuse erwachen gewöhnlich 30 bis 40 Sekunden nach der Injektion. Die korrekte Dosierung von S. pneumoniae ist entscheidend, da die Mäuse sich sonst von der Infektion erholen oder zu schnell an einer invasiven Pneumokokkenerkrankung erkranken, sodass keine Läsionen entstehen können. Da jeder Bakterienstamm unterschiedliche Virulenzgrade aufweist, kann es erforderlich sein, durch Versuch und Irrtum die richtige Dosis zu ermitteln.Lassen Sie die Infektion mindestens 24 Stunden bis zu einem frühen Stadium oder 30 Stunden für ein fortgeschrittenes Infektionsstadium fortschreiten. Danach euthanasieren Sie jede infizierte Maus. Nehmen Sie zunächst eine Blutprobe, desinfizieren Sie die Schwanzspitze mit einem Alkoholtupfer und schneiden Sie einen zwei bis drei Millimeter langen Abschnitt ab.Entnehmen Sie zwei Mikroliter Blut von der Schnittstelle. Verdünnen Sie das Blut seriell zehnfach in PBS, das Natriumheparin mit einer Einheit pro Milliliter enthält. Impfen Sie fünf Verdünnungsstufen auf Triptisch-Soja-Blutagarplatten aus und inkubieren Sie diese über Nacht.Am nächsten Tag Koloniezahlen bestimmen. Fahren Sie mit der Entnahme des Herzens wie im nächsten Abschnitt beschrieben fort. Alternativ 30 Stunden nach der Infektion.Versuchen Sie, die Maus zu retten, indem Sie Ampicillin in 100 Mikroliter Kochsalzlösung intraperitoneal verabreichen. Setzen Sie die Gabe von Ampicillin alle 12 Stunden über einen Zeitraum von 36 Stunden fort und entnehmen Sie die Herzen zu den gewünschten Zeitpunkten. Entnehmen Sie zuerst das Herz.Fixieren Sie die euthanasierte Maus in Rückenlage auf einer chirurgischen Unterlage, besprühen Sie die Brust mit 70 % Ethanol und tupfen Sie sie trocken. Öffnen Sie mit chirurgischen Scheren und einer Pinzette die Brusthöhle. Entfernen Sie den Rippenkorb und durchtrennen Sie das Zwerchfell, um Herz und Lungen freizulegen.Danach schneiden Sie die mit dem Herzen verbundenen Blutgefäße durch und entfernen das Herz vorsichtig mit einer Pinzette, ohne es zuquetschen. Spülen Sie das Herz mit PBS ab und legen Sie es in eine Gewebeprobe-Kassette für die koronare Schnittführung. Anschließend überführen Sie die Kassetten in eine 10 %ige gepufferte Formalinlösung und senden sie am folgenden Tag zur Paraffineinbettung.In frühen Stadien können Herzläsionen anhand ihrer veränderten Farbgebung und in einigen Fällen durch das Vorhandensein von Immunzellen identifiziert werden. Bei fortgeschrittenen Läsionen fehlen Immunzellen, und es finden sich stattdessen große, VA-ähnliche Läsionen.Unter Verwendung eines fünf Mikrometer dicken Herzabschnitts auf positiv geladenen Objektträgern die Schnitte zuerst einfrieren, dann auftauen und an der Luft trocknen lassen. Die Objektträger 10 Minuten lang bei 25 Grad Celsius in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixieren. Anschließend das Fixativ durch drei Waschungen mit PBS entfernen, wobei jede Waschung fünf Minuten dauert.Permeabilisieren Sie das Gewebe anschließend mit 0,2 % Triton X-100 in PBS für 15 Minuten. Entfernen Sie das Detergens durch drei weitere Waschungen mit reinem PBS. Blockieren Sie das Gewebe danach für eine Stunde mit 10 % Kokumserum in PBS, nachdem es mit PBS gespült wurde; bedecken Sie den Schnittabschnitt zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit Antiserum.Behandeln Sie die Negativkontrollen mit naivem Kaninchenserum. Da Herzmuskelgewebe die XI-Immunfluoreszenzfärbung leicht aufnimmt und dadurch hohe Hintergrundsignale entstehen können, muss die Konzentration und die Inkubationszeit für verschiedene Antikörpertypen wahrscheinlich optimiert werden. Zwei Stunden später waschen Sie das Antiserum mit PBS ab. Ersetzen Sie dann die Lösung durch einen sekundären Antikörper und lassen Sie die Objektträger 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Geben Sie anschließend DPI in einer Konzentration von fünf Milligramm pro Milliliter zu und waschen Sie die Objektträger erneut mit PBS.Schließlich die Objektträger eindeckeln, aufbewahren und mit konfokaler Mikroskopie aufnehmen. Beginnen Sie damit, das Paraffin zu entfernen und die Gewebeschnitte zu hydratisieren. Verwenden Sie Xylolwäschen, gefolgt von einer abgestuften Reihe von Alkoholwäschen.Anschließend die Schnitte fünf Minuten lang in 0,2 % Phosphomolybdänsäure baden, gefolgt von einer fünfminütigen Spülung mit Wasser; danach zwei Stunden lang mit 0,1 % Siriusrot und Pikrinsäure anfärben. Danach die Schnitte drei Minuten lang mit 0,01 normaler Salzsäure waschen und eine Minute lang mit 70 %igem Ethanol spülen. Nun die Schnitte durch Umkehrung der alkoholischen Gradientenbäder dehydratisieren, gefolgt von Xylolwäschen, und die Präparate mittels Lichtmikroskopie eindecken und auswerten.Mäuse entwickelten eine invasive Pneumokokkenerkrankung nach einer Infektion mit dem Tiger. Vier Stämme zeigten mikroskopisch kleine Herde im Herzen, die in den Ventrikeln beobachtet wurden, und eine Zunahme der Größe und Anzahl der Läsionen wurde zwischen 24 und 30 Stunden nach der Infektion festgestellt, um zu überprüfen, ob tatsächlich S. pneumoniae in den Läsionen vorhanden waren. Schnitte wurden auf das von Tiger vier produzierte kapselbildende Polysaccharid des Serotyps vier gefärbt.Dies bestätigte das Vorhandensein dicht gepackter und kompakter Aggregate innerhalb der Mikroläsionsstellen. Die Piro-Serienrot-Färbung wurde an Herzpräparaten von Mäusen durchgeführt, die mit Ampicillin behandelt worden waren, sowie an nicht infizierten Kontrollen. Bei den Behandlungen.Es zeigte sich eine deutliche Zunahme des Vorkommens und der Intensität der Färbung mit Bändern, die von Stellen auszugehen scheinen, an denen sich früher Läsionen in den Ventrikeln befanden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, Mäuse mit ausreichender Menge an S. pneumoniae zu infizieren, um der Infektion genügend Zeit – mindestens 28 bis 30 Stunden – für die Entwicklung einer Bakteriämie und von mikroskopischen Herdläsionen im Herzen zu geben.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Quelle: Brown, A. O., et al. Visualisierung von Streptococcus pneumoniae in kardialen Mikroläsionen und anschließende kardiale Remodellierung. J. Vis. Exp. (2015).Dieses Video demonstriert die mikroskopische Visualisierung bakterieller Mikroläsionen im Herzgewebe der Maus. Das Herz einer mit Streptococcus pneumoniae infizierten Maus wird entnommen, gewaschen und fixiert, bevor es verarbeitet wird, um koronale Schnitte zu erhalten. Diese Schnitte werden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt und...

Mikroskopische Visualisierung bakterieller Mikroläsionen im Herzgewebe von Mausen

Quelle: Brown, A. O., und Orihuela, C. J. Visualisierung von Streptococcus pneumoniae in kardialen Mikroläsionen und anschließende kardiale Remodellierung. J. Vis. Exp. (2015)Das Video demonstriert die Immunfärbung chemisch fixierter kardialer Mausschnitte, um pathogene Bakterien zu visualisieren, die in infektionsinduzierten Mikroläsionen lokalisiert sind. Der Prozess umfasst Gewebewäsche, Membranpermeabilisierung, Blockieren unspezifischer Stellen, Antikörpermarkierung, nukleare Gegenfärbung...

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