Visualisierung

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, einen reproduzierbaren Protokollablauf zur Bildung von ESMO-kardialen Mikroläsionen im Herzen infizierter Mäuse zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem Mäuse mit ESMO infiziert werden und eine Bakteriämie ausbilden, wodurch die Bakterien Zugang zum kardialen Gefäßsystem erhalten, in den Myokardgewebe eindringen und mikroskopische Läsionen bilden können. Anschließend werden die Herzen entweder in Paraffin eingebettet und konventionell gefärbt oder in OCT-Compound fixiert, um immunfluoreszenzfarbliche Färbungen durchzuführen.

Die Auswertung der gefärbten Schnitte kann zufällig im Myokard verteilte mikroscopische Herdesläsionen, Kollagenablagerungen und genesende Myokardschnitte sowie Pneumokokkenkapseln innerhalb der kardialen Mikroläsionen zeigen, was das Verfahren veranschaulicht. Ist Armand Brown ein Doktorand in meinem Labor? Obwohl diese Methode Einblicke in die kardialen Schädigungen durch S. pneumoniae während einer invasiven Pneumokokkeninfektion bei Mäusen ermöglichen kann.

Sie kann auch auf Herzproben aus anderen Systemen wie nichtmenschlichen Primaten oder Menschen angewendet werden. Beginnen Sie damit, den ESMO-Serotyp-Vier-Stamm Tiger vier in Todd-Hewitt-Brühe auf eine optische Dichte von 0,5 bei 620 Nanometern anzuziehen. Wenn die korrekte Dichte erreicht ist, pelletieren Sie die Kultur bei 3.500 ×g für 10 Minuten.

Entfernen Sie anschließend den Überstand mithilfe einer Vakuumleitung und resuspendieren Sie die Bakterien in steriler PBS-Pufferlösung mit einer Konzentration von 10.000 koloniebildenden Einheiten pro Milliliter. Betäuben Sie nun 10 bis 12 Wochen alte Valve C-Mäuse und überprüfen Sie den betäubten Zustand durch leichtes Zupinzen der Zehen mit einer stumpfen Pinzette. Laden Sie eine Lotusspritze mit der bakteriellen Suspension und befestigen Sie eine Nadel mit einer Größe von 27 bis 30 Gauge. Halten Sie eine betäubte Maus mit einer Hand am Nackenfell fest und injizieren Sie mit der anderen Hand 100 Mikroliter der Suspension intraperitoneal. Stellen Sie jede Maus danach zurück in ihren Käfig.

Die Mäuse erwachen gewöhnlich 30 bis 40 Sekunden nach der Injektion. Die korrekte Dosierung von S. pneumoniae ist entscheidend, da die Mäuse sich sonst von der Infektion erholen oder zu schnell an einer invasiven Pneumokokkenerkrankung erkranken, sodass keine Läsionen entstehen können. Da jeder Bakterienstamm unterschiedliche Virulenzgrade aufweist, kann es erforderlich sein, durch Versuch und Irrtum die richtige Dosis zu ermitteln.

Lassen Sie die Infektion mindestens 24 Stunden bis zu einem frühen Stadium oder 30 Stunden für ein fortgeschrittenes Infektionsstadium fortschreiten. Danach euthanasieren Sie jede infizierte Maus. Nehmen Sie zunächst eine Blutprobe, desinfizieren Sie die Schwanzspitze mit einem Alkoholtupfer und schneiden Sie einen zwei bis drei Millimeter langen Abschnitt ab.

Entnehmen Sie zwei Mikroliter Blut von der Schnittstelle. Verdünnen Sie das Blut seriell zehnfach in PBS, das Natriumheparin mit einer Einheit pro Milliliter enthält. Impfen Sie fünf Verdünnungsstufen auf Triptisch-Soja-Blutagarplatten aus und inkubieren Sie diese über Nacht.

Am nächsten Tag Koloniezahlen bestimmen. Fahren Sie mit der Entnahme des Herzens wie im nächsten Abschnitt beschrieben fort. Alternativ 30 Stunden nach der Infektion.

Versuchen Sie, die Maus zu retten, indem Sie Ampicillin in 100 Mikroliter Kochsalzlösung intraperitoneal verabreichen. Setzen Sie die Gabe von Ampicillin alle 12 Stunden über einen Zeitraum von 36 Stunden fort und entnehmen Sie die Herzen zu den gewünschten Zeitpunkten. Entnehmen Sie zuerst das Herz.

Fixieren Sie die euthanasierte Maus in Rückenlage auf einer chirurgischen Unterlage, besprühen Sie die Brust mit 70 % Ethanol und tupfen Sie sie trocken. Öffnen Sie mit chirurgischen Scheren und einer Pinzette die Brusthöhle. Entfernen Sie den Rippenkorb und durchtrennen Sie das Zwerchfell, um Herz und Lungen freizulegen.

Danach schneiden Sie die mit dem Herzen verbundenen Blutgefäße durch und entfernen das Herz vorsichtig mit einer Pinzette, ohne es zuquetschen. Spülen Sie das Herz mit PBS ab und legen Sie es in eine Gewebeprobe-Kassette für die koronare Schnittführung. Anschließend überführen Sie die Kassetten in eine 10 %ige gepufferte Formalinlösung und senden sie am folgenden Tag zur Paraffineinbettung.

In frühen Stadien können Herzläsionen anhand ihrer veränderten Farbgebung und in einigen Fällen durch das Vorhandensein von Immunzellen identifiziert werden. Bei fortgeschrittenen Läsionen fehlen Immunzellen, und es finden sich stattdessen große, VA-ähnliche Läsionen.

Unter Verwendung eines fünf Mikrometer dicken Herzabschnitts auf positiv geladenen Objektträgern die Schnitte zuerst einfrieren, dann auftauen und an der Luft trocknen lassen. Die Objektträger 10 Minuten lang bei 25 Grad Celsius in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixieren. Anschließend das Fixativ durch drei Waschungen mit PBS entfernen, wobei jede Waschung fünf Minuten dauert.

Permeabilisieren Sie das Gewebe anschließend mit 0,2 % Triton X-100 in PBS für 15 Minuten. Entfernen Sie das Detergens durch drei weitere Waschungen mit reinem PBS. Blockieren Sie das Gewebe danach für eine Stunde mit 10 % Kokumserum in PBS, nachdem es mit PBS gespült wurde; bedecken Sie den Schnittabschnitt zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit Antiserum.

Behandeln Sie die Negativkontrollen mit naivem Kaninchenserum. Da Herzmuskelgewebe die XI-Immunfluoreszenzfärbung leicht aufnimmt und dadurch hohe Hintergrundsignale entstehen können, muss die Konzentration und die Inkubationszeit für verschiedene Antikörpertypen wahrscheinlich optimiert werden. Zwei Stunden später waschen Sie das Antiserum mit PBS ab. Ersetzen Sie dann die Lösung durch einen sekundären Antikörper und lassen Sie die Objektträger 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Geben Sie anschließend DPI in einer Konzentration von fünf Milligramm pro Milliliter zu und waschen Sie die Objektträger erneut mit PBS.

Schließlich die Objektträger eindeckeln, aufbewahren und mit konfokaler Mikroskopie aufnehmen. Beginnen Sie damit, das Paraffin zu entfernen und die Gewebeschnitte zu hydratisieren. Verwenden Sie Xylolwäschen, gefolgt von einer abgestuften Reihe von Alkoholwäschen.

Anschließend die Schnitte fünf Minuten lang in 0,2 % Phosphomolybdänsäure baden, gefolgt von einer fünfminütigen Spülung mit Wasser; danach zwei Stunden lang mit 0,1 % Siriusrot und Pikrinsäure anfärben. Danach die Schnitte drei Minuten lang mit 0,01 normaler Salzsäure waschen und eine Minute lang mit 70 %igem Ethanol spülen. Nun die Schnitte durch Umkehrung der alkoholischen Gradientenbäder dehydratisieren, gefolgt von Xylolwäschen, und die Präparate mittels Lichtmikroskopie eindecken und auswerten.

Mäuse entwickelten eine invasive Pneumokokkenerkrankung nach einer Infektion mit dem Tiger. Vier Stämme zeigten mikroskopisch kleine Herde im Herzen, die in den Ventrikeln beobachtet wurden, und eine Zunahme der Größe und Anzahl der Läsionen wurde zwischen 24 und 30 Stunden nach der Infektion festgestellt, um zu überprüfen, ob tatsächlich S. pneumoniae in den Läsionen vorhanden waren. Schnitte wurden auf das von Tiger vier produzierte kapselbildende Polysaccharid des Serotyps vier gefärbt.

Dies bestätigte das Vorhandensein dicht gepackter und kompakter Aggregate innerhalb der Mikroläsionsstellen. Die Piro-Serienrot-Färbung wurde an Herzpräparaten von Mäusen durchgeführt, die mit Ampicillin behandelt worden waren, sowie an nicht infizierten Kontrollen. Bei den Behandlungen.

Es zeigte sich eine deutliche Zunahme des Vorkommens und der Intensität der Färbung mit Bändern, die von Stellen auszugehen scheinen, an denen sich früher Läsionen in den Ventrikeln befanden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, Mäuse mit ausreichender Menge an S. pneumoniae zu infizieren, um der Infektion genügend Zeit – mindestens 28 bis 30 Stunden – für die Entwicklung einer Bakteriämie und von mikroskopischen Herdläsionen im Herzen zu geben.