Neuronale Aktivitätsausbreitung in einem ungefalteten Hippocampus Vorbereitung mit einem durchdringenden Mikroelektroden-Array

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Prozess der Entfaltung des Nagetier-Hippocampus einzuführen und die flache Gewebepräparation auf das durchdringende Mikroelektrodenarray zu legen. Für die Aufnahme. Dies wird erreicht, indem zunächst der Hippocampus einer Maus von der Hälfte ihres Gehirns isoliert wird.

Der zweite Schritt besteht darin, die gekrümmte Struktur des Hippocampus mit speziell angefertigten Werkzeugen zu entfalten. Als nächstes wird der entfaltete Hippocampus in die Aufnahmekammer überführt und auf das Aufnahmearray gelegt. Der letzte Schritt besteht darin, den entfalteten Hippocampus nach dem Experiment aus dem Array zu entfernen.

Letztendlich wird die individuelle Normalisierungs-Mapping-Methode in der Datenanalyse verwendet, um die Ausbreitung der neuronalen Aktivität zu zeigen, die von dem durchdringenden Mikroelektrodenarray aufgezeichnet wird. Nun, der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, die neuronale Aktivität in zwei Richtungen, quer und längs, aufzuzeichnen. Um die tatsächliche Ausbreitung der neuronalen Aktivität zu sehen, benötigt man einen intakten Hippocampus, rollt die Dellengläser ab und legt sich flach in eine Aufnahmekammer, und die Ausbreitung findet dann sowohl in Quer- als auch in Längsrichtung statt.

Und wir waren dann in der Lage, die Geschwindigkeit der Vermehrung des Gewebes herauszufinden. Wir waren von der Aktivität in zwei Richtungen, und wir waren in der Lage, die Ausbreitungsmechanismen zu untersuchen, insbesondere die nicht-synaptischen Mechanismen. Wir konnten sehen, wie sich die Aktivität mit dieser synaptischen Übertragung mit diesen Gap Junctions ausbreitet, und aufgrund der Geschwindigkeit wissen wir, dass es sich nicht um eine Diffusion handelt.

Jetzt versuchen wir, die tatsächlichen Mechanismen dieser Ausbreitung herauszuarbeiten. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, aufgrund der schwierigen Verfahren zur Entfaltung des Hippocampus Schwierigkeiten haben und das flache Gewebepräparat auf dieses durchdringende Mikroelektrodenarray legen, ohne das Gewebe oder das Array zu beschädigen. Um diesen Vorgang zu starten, legen Sie den Mauskopf in eiskalte, sauerstoffhaltige Saccharose.

Ein Liquor verwendet eine feine Schere, um die Haut des Schädels zu entfernen. Als nächstes schneidest du den Schädel entlang der Mittellinie und die beiden Enden in der Nähe des Schläfenlappens. Schälen Sie dann den abgeschnittenen Schädel zu den Seiten des Kopfes hin.

Um das Gehirn freizulegen, entfernen Sie das Gehirn vorsichtig mit dem Spatel aus dem Schädel. Legen Sie danach das Gehirn auf eine eiskalte chirurgische Bühne, die mit nassem Filterpapier bedeckt ist. Entfernen Sie das Kleinhirn mit einer eisgekühlten Klinge.

Trennen Sie anschließend die beiden Hemisphären, indem Sie die Mittellinie des Gehirns durchtrennen. Dann die beiden getrennten Halbkugeln in ein mit eiskalter Saccharose gefülltes Becherglas geben. Ein Liquor sprudelte mit 95% Sauerstoff, 5% Kohlendioxid.

Übertragen Sie eine Halbkugel auf die eiskalte Bühne, die mit Filterpapier bedeckt ist. Legen Sie normale Papiertücher oder Filterpapiere um das Gehirn, um die zusätzliche Lösung aufzunehmen. Verwenden Sie anschließend zwei feuerpolierte Glaspipetten, um den Kortex vom zentralen Teil des Gehirns zu trennen, um den Hippocampus freizulegen.

Tragen Sie anschließend zwei bis drei Tropfen eiskaltes Suse A CSF auf das Gewebe auf und entfernen Sie die überschüssige Lösung. Schneiden Sie die Verbindungen mit dem Kortex an den beiden Enden des Hippocampus ab. Dann sezieren Sie den Hippocampus mit den feuerpolierten Glaswerkzeugen aus dem Gehirn.

Trennen Sie anschließend den gesamten Hippocampus mit der äussersten Seite nach oben und dem Sulcus hippocampus nach unten. Tragen Sie schnell wieder zwei bis drei Tropfen eiskaltes Liquor auf das Gewebe auf und entfernen Sie die überschüssige Lösung um das Gewebe herum. Drehen Sie dann mit dem feuerpolierten Glaswerkzeug den gesamten Hippocampus um. Um den Sulcus freizulegen, beschneide mit einer eiskalten Klinge die septalen und temporalen Enden des Hippocampus.

Führen Sie bei Bedarf eine speziell angefertigte Glasnadel in den Sulcus ein und schneiden Sie die Faserbahn von DG auf ca. drei ab. Ziehe dann mit einer Metalldrahtschlaufe den DG über und falte den Hippocampus auseinander. Der gesamte Operationsprozess dauert in der Regel etwa zwei Minuten.

Tragen Sie weitere zwei bis drei Tropfen eiskalte Saccharose A CSF auf das Taschentuch auf und entfernen Sie die überschüssige Lösung um das Gewebe herum. Schneide dann die Ränder des entfalteten Hippocampus mit einer eiskalten Klinge ab. Bringen Sie das Präparat eine Stunde lang bei Raumtemperatur in die mit normalem A-Liquor gefüllte und mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid gefüllte Kammer, bevor Sie es in die Aufnahmekammer überführen.

Füllen Sie bei diesem Verfahren eine Flasche mit normalem A-Liquor und eine weitere Flasche mit vier AP-A-Liquorblasen. Die Lösungen mit 95% Sauerstoff, 5% Kohlendioxid von Beginn der Experimente. Verwenden Sie einen Dreiecksverbinder, um zu steuern, welche Lösung während eines Experiments ausgewählt wird.

Schließen Sie als Nächstes eine Vakuumröhre an den Auslass der Kammer an. Um die Lösung in einen Staubbehälter zu entfernen, erhitzen Sie die Rohrleitung, bevor Sie die Lösung in die Aufnahmekammer geben, und halten Sie sie auf einer kontrollierten Temperatur von 35 Grad Celsius. Nachdem Sie den Ein- und Auslass der Aufnahmekammer geschlossen haben, verwenden Sie eine speziell angefertigte Glaspipettenpipette, um den entfalteten Hippocampus in die Aufnahmekammer zu übertragen.

Positionieren Sie unter dem Mikroskop den entfalteten Hippocampus mit der alviafarbenen Seite nach unten, ca. drei Bereiche, die wegzeigen, und ca. einem Feld, das in Richtung des Forschers zeigt, und saugen Sie die Lösung in der Kammer vorsichtig mit einer Vakuumpipette vom Rand der Aufnahmekammer ab, bis die Kammer getrocknet ist und das Gewebe auf dem Array liegt. Platzieren Sie dann vorsichtig einen speziell angefertigten Gewebeanker auf dem Gewebe, um den entfalteten Hippocampus auf dem Array zu halten. Füllen Sie die Aufnahmekammer mit ein paar Tropfen Lösung.

Öffnen Sie nach und nach den Einlass und Auslass, um die Durchflussmenge in der Infusionsauslösekammer auf etwa zwei Tropfen pro Sekunde einzustellen. Inkubieren Sie das Gewebe in der Aufnahmekammer mit normalem A-Liquor für etwa eine Minute. Wechseln Sie dann die Lösungen.

Auf vier AP gelöste A CSF auftragen und die Durchflussrate richtig einstellen. Inkubieren Sie das Gewebe vor der Aufzeichnung etwa fünf bis 10 Minuten lang in vier AP-gelösten A-Liquor. Um das Gewebe aus der PMEA zu entfernen, steuern Sie den Gewebeanker mit einem Mikromanipulator und heben Sie den Anker nach und nach aus der Aufnahmekammer an.

Schließen Sie sowohl den Einlass als auch den Auslass, um den Durchfluss zu stoppen. Verwenden Sie in der Aufnahmekammer einen kleinen Pinsel, um die Ecke des Gewebes anzuheben. Wenn das Gewebe nicht in der Lösung schwimmt, verwenden Sie die Vakuumröhre, um die Kammer vorsichtig zu trocknen, während das Gewebe noch auf dem Array sitzt.

Öffnen Sie dann vorsichtig den Einlass, um die Kammer nach und nach wieder zu füllen, und schließen Sie den Einlass, um den Durchfluss zu stoppen. Wenn die Aufnahmekammer voll ist, heben Sie mit dem kleinen Pinsel die Ecke des Taschentuchs an. Wieder. Wenn das Gewebe in der Lösung schwimmt, saugen Sie das Gewebe mit der Vakuumröhre ab.

Öffnen Sie den Durchfluss am Einlass und das Vakuum am Auslass. Waschen Sie das System mit destilliertem Wasser und trocknen Sie es aus. Dies ist ein Beispiel für die spontane Aktivität, die durch 100 Mikromolare vier AP A CSF induziert wird, die von einer der Mikroelektroden im basalen dendritischen Bereich mit einem Signal-Rausch-Verhältnis von 34,9 Dezibel aufgezeichnet wurden.

Und hier sind die vergrößerten Aktivitäten im roten Rechteck. Dies sind die Rohdaten einer anderen Mikroelektrode, die sich näher an den Spaltöffnungen befindet und ein Signal-Rausch-Verhältnis von 27,2 Dezibel aufweist. Hier ist ein weiteres Beispiel für eine Aufnahme, die von einer Elektrode erhalten wurde, die innerhalb der somatischen Schicht positioniert ist.

In diesem Beispiel beträgt das Signal-Rausch-Verhältnis 18,53 Dezibel, und hier ist das von einer Mikroelektrode aufgezeichnete Grundrauschen. Die Basislinie hat in der Regel einen Spitze-zu-Spitze-Wert von 150 bis 200 Mikrovolt, und die Impedanz einer einzelnen Elektrode beträgt etwa ein bis zwei Megaohm. Dieses Video zeigt die neuronale Ausbreitung, die mit dem Array aufgezeichnet und dann mit der individuellen Normalisierungsmethode verarbeitet wurde.

Bei der Datenanalyse dauert die gesamte Ausbreitung über das gesamte Gewebe nach diesem Verfahren etwa 100 Millisekunden. Andere Methoden wie Neuroimaging im entfalteten Hippocampus in Vitu können ebenfalls durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Bewegung von Neuroherden zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Hippocampus an Ort und Stelle, die Vorbereitung des flachen Gewebes auf das Mikro-Vorlesungsarray, entfalten können.