Name: Neuronale Aktivitätsausbreitung in einem ungefalteten Hippocampus Vorbereitung mit einem durchdringenden Mikroelektroden-Array (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Lernen Sie die Präparation eines ungefalteten Hippocampus zur neuronalen Aufzeichnung mit einem durchdringenden Mikroelektroden-Array. Diese Methode ermöglicht simultane Aufnahmen der Aktivitätsausbreitung in transversaler und longitudinaler Richtung.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Grant 1R01NS060757-01 der National Institutes of Health (National Institute of Neurological Disorders and Stroke) und durch den E.L. Lindseth Stiftungslehrstuhl für Dominique M. Durand. Wir danken dem Labor von Dr. Andrew M. Rollins für die Hilfe bei der OCT-Bildgebung.

HINWEIS: Tierversuchsprotokolle wurden überprüft und von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der Universität zugelassen. CD1-Mäusen beiderlei Geschlechts im Alter von P10 bis P20 sind in dieser Studie verwendet. 1. Lösungen für Chirurgie und Experimental-Aufnahme <ol><li> Bereiten normalen künstlichen Cerebrospinalflüssigkeit (aCSF) enthaltenden Puffer (mM): NaCl 124, KCl 3,75, KH 2 PO 4 1,25, MgSO 4 2, NaHCO 3 26, Dextrose 10 und CaCl 2 2. Verwenden dieses normalen aCSF zur Gewebewiederherstellung nach der Sektion, als auch für Waschsystem zu Beginn des Experiments. </li><li> Bereiten Saccharose aCSF, die während des Hippocampus Dissektion verwendet wird und enthält (mM): Saccharose 220, KCl 2,95, NaH 2 PO 4 1,3, MgSO 4 2, NaHCO 3 26, Dextrose 10 und CaCl 2 2. Um epileptiforme Aktivität in intakten Hippocampus Gewebeaufbereitung induzieren, fügen Sie 4-Aminopyridin (4-AP) in den Normal aCSF andie Konzentration von 100 uM. </li></ol> 2. Chirurgische Verfahren für die Intact Hippocampus Vorbereitung <ol><li> Tropfen Isofluran (1 ml) in die Kammer an der Unterseite der Exsikkator Glas (No.1 in bestimmten Werkstoffen und Ausrüstung) und mit einem normalen Papiertuch, um die Oberfläche der Bodenstufe abdecken so das Tier nicht in Kontakt kommen die Flüssigkeit. Legen Sie dann die CD1-Maus in den Topf und den Deckel schließen. Halten Sie das Tier in dem geschlossenen Gefäß für etwa 1 min bis 2 min. Bei Atemfrequenz etwa einem pro Sekunde, entfernen Sie die Maus aus dem Glas. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf dem OP-Bühne und enthaupten mit einer geeigneten Schere. Unmittelbar nach der Enthauptung, legen Sie den Kopf in den eiskalten (3-4 ° C), sauerstoff Saccharose aCSF für etwa 30 sec. </li><li> Verwenden einer feinen Schere (No.5 in bestimmten Werkstoffen und Ausrüstung), um die Haut auf der Oberseite des Schädels zu entfernen und die Schädel entlang der Mittellinie des Kopfes als auch an den beiden Enden in der Nähe der Tempo geschnittenral Lappen. Verwenden einer Pinzette (No. 6 in bestimmten Werkstoffen und Ausrüstung), um den Schnitt Schädel zu jeder Seite des Kopfes, um das Gehirn ausgesetzt schälen. </li><li> Legen Sie eine Mikro-Labor Spatel (No. 8 in bestimmten Werkstoffen und Ausrüstung) in den Spalt zwischen den Scheitellappen des Gehirns und des Schädels, um sorgfältig schälen das Gehirn von der Unterseite des Schädels und dann legen Sie es auf eine vorbereitete eiskaltem (3 -4 ° C) Operationstisch mit feuchtem Filterpapier (Nr.2 in spezifischen Materialien und Geräte) abgedeckt. Entfernen des Cerebellum mit eisgekühltem Klinge und trennen die beiden Hemisphären durch Schneiden der Mittellinie des Gehirns. Legen Sie dann die beiden Hemisphären getrennt in ein Becherglas mit dem eiskalten Saccharose aCSF mit 95% O 2/5% CO 2 sprudelte gefüllt. </li><li> Nehmen Sie die Hälfte der Hemisphäre und auf den eiskalten Filterpapier Bühne. Zeigen regelmäßigen Küchenpapier oder Filterpapier, um das Gehirn, um die zusätzliche Lösung zu saugen. Verwenden Sie zwei feuerpolierte Glaspipette-Tools (No. 10 in Materialien undAusrüstung), den Kortex vom Rest des zentralen Teils des Gehirns zu trennen. </li><li> Nach der Hippocampus aus dem Inneren der Hirnrinde freigelegt und auf dem eiskalten Bühne zu bringen, indem Sie zwei oder drei Tropfen eiskalten Saccharose aCSF auf das Gewebe und entfernen Sie zusätzliche Lösung rund um den Hippocampus. Schneiden Sie die Verbindungen mit dem Kortex an zwei Enden des Hippocampus. Dann sezieren den Hippocampus aus dem Gehirn mit den feuerpolierten Glaswerkzeuge und den verbleibenden Teil des Gehirns zu entfernen. </li><li> Trennen Sie die gesamte Hippocampus mit seinen alveus Seite nach oben und Sulcus hippocampi nach unten. Drop schnell zwei oder drei Tropfen eiskaltem Saccharose aCSF auf das Gewebe wieder und entfernen Sie die zusätzliche Lösung um das Gewebe mit einem Stück Küchenpapier. Verwenden Sie eine feuerpolierte Glas Werkzeug drehen Sie den ganzen Hippocampus, den Sulcus (1B, C) ​​aussetzen. </li><li> Unter einem normalen Lichtmikroskop, legen Sie eine maßgeschneiderte Glas Nadel (No. 11 in bestimmten MateriALS und Equipment) in ein Ende des Sulcus und schneiden die Faserverbindungen von Gyrus dentatus (DG), um Subiculum oder der CA1-Feld, entlang der Richtung des Sulcus (Abbildung 1C). Tragen Sie eine eiskalte Klinge, um die Scheidewand und zeitliche Enden des Hippocampus bei Bedarf trimmen. Legen Sie eine maßgeschneiderte Metalldrahtschleife (No. 12 in bestimmten Werkstoffen und Ausrüstung) in den Ausschnitt Sulcus und ziehen Sie über die GD von dem Gewebe, während die Subiculum / CA1 Ende des Hippocampus halten durch eine feuerpolierte Glaswerkzeug (1D) . </li><li> Nach der Entfaltung Verfahren vor, fügen Sie noch zwei oder drei Tropfen des eiskalten Saccharose aCSF auf das Gewebe und entfernen Sie die zusätzliche Lösung um das Gewebe. Dann schneiden Sie die ungefaltet Hippocampus mit der eiskalte Klinge an den Rändern (1E) und legen Sie die Vorbereitung mit einem Spatel in die Rückgewinnungskammer mit normaler aCSF gefüllt und bei Raumtemperatur mit 95% O 2/5% CO 2 sprudelte (ca. 25 ° C). Stehen Lassendie entfaltete Hippocampus Gewebe ca. 1 Stunde, bevor Sie sie in den Aufnahmeraum zu erholen. </li><li> Fahren Sie auf der anderen Gehirnhälfte und es verwenden, um durch die Schritte 2,5-2,9 gehen. In der Regel dauert etwa 1 bis 2 min, das gesamte Verfahren zu beenden, um eine einzelne Hippocampus entfalten &amp; Drop eiskalten Saccharose aCSF kontinuierlich, um das Gewebe mit Sauerstoff angereichert und mit Feuchtigkeit versorgt. </li></ol> 3. Experimentelle System-Setup- <ol><li> Kleben Sie ein individuell gefertigter PMEA auf einem Pin-Grid-Array (PGA) Paket und nutzen Mikrodrahtbonden, jede Unterlage aus einer Mikroelektrode auf das Kissen der auf der Verpackung (3B) einen Stift zu verbinden. Legen Sie dann das Paket in die Buchse an einem maßgeschneiderten Leiterplatte 13. </li><li> Individuell verbinden jeden Mikro seiner Filter mit Bandpassgrenzfrequenz von 1 Hz bis 4 kHz und Verstärker mit Verstärkung von 100 auf der maßgeschneiderte Leiterplatte 13. Digitalisieren des Analogausgangssignal von der Platine durch einen A / D CONVerting System und Erfassen und Speichern der Daten auf einem Computer. </li><li> Kleben Sie eine maßgeschneiderte Kunststoffaufnahmekammer um das Array mit Ein- und Auslaufschlauch für das Lösungsstrom (4A). Verwenden Sie mindestens zwei Flaschen, verschiedene Lösungen im System zu belassen, und kommen und den Ausgangsschlauch der Flaschen Kontrolle durch eine Tri-Ventil. Verbinden Sie den Ausgang des Tri-Ventil an ein Schlauchsystem mit einer IV Tropfkammer, die Führung wird die Lösung in den Aufnahmeraum. </li><li> Zwischen dem tri-Ventil und dem Einlass der Aufzeichnungskammer, fügen eine elektrische Heizung, die Lösung auf einer kontrollierten Temperatur (35 ° C), bevor die Lösung auf das Aufzeichnungskammer geführt zu erhitzen. Befestigen Sie den Ausgang der Aufnahmekammer an eine Vakuumröhre, die Lösung in eine Vakuumröhre verbunden Kolben sammeln. Sie bereiten keine Lösung in jedem Experiment in dieser Studie. </li></ol> 4. Platzieren des Unfolded Hippocampus auf die PMEA die neuronale Aktivität aufzuzeichnen </p&gt; <ol><li> Um die Versuchsanordnung vorzubereiten, füllen Sie eine Flasche mit normaler aCSF und eine Flasche mit 4-AP aCSF. In beiden Flaschen, Blase 95% O 2/5% CO 2 von Beginn eines jeden Versuchs. Verwenden Sie ein Tri-Ventilstecker zu steuern, welche Lösung bei einem Experiment ausgewählt werden. Anschließen eines Vakuumrohres am Auslaß der Kammer, um die Lösung in einen Staubbehälter zu pumpen. Erhitzen Sie die Pipeline vor der Zustellung in den Aufnahmeraum und halten Sie die Lösung bei einer kontrollierten Temperaturniveau (35 ° C). </li><li> Wenn der Einlass und Auslass des Aufnahmekammer geschlossen sind, verwenden Sie eine maßgeschneiderte Glaspipette Pipette, um in den Aufnahmeraum zu übertragen und setzen Sie den ausgeklappten Hippocampus. Unter dem Mikroskop positionieren entfaltet Hippocampus mit einem normalen kleinen Pinsel, während das Gewebe in der Lösung schweben. Stellen Sie den aufgeklappten Hippocampus mit seinen alveus Seite nach unten, CA3 Bereich wegweisend und CA1 Feld in Richtung der Forscher. </li&gt; <li> Sorgfältig abzusaugen, die Lösung in der Kammer mit einer Vakuumpipette von der Kante des Aufzeichnungskammer, die Lösungspegel zu reduzieren, bis die Kammer wird getrocknet und das Gewebe wird auf die Anordnung gesenkt. Dann setzt vorsichtig eine maßgeschneiderte Gewebeanker (Bild 4) (No. 14 in bestimmten Werkstoffen und Ausrüstung) auf der Oberseite des Gewebes, um die entfaltete Hippocampus auf die Anordnung zu halten. Geben Sie einige Tropfen der Lösung in die Aufnahmekammer, um sie wieder zu füllen, und nach und nach öffnen Sie den Eingang und Ausgang zum Durchflussmenge auf etwa zwei Tropfen pro Sekunde in der IV Tropfkammer einzustellen. </li><li> Inkubieren Sie die Gewebe in der Aufnahme Kammer mit normaler aCSF für ca. 1 min zu erholen, dann schalten Sie die Lösung Versorgung 4-AP aufgelöst aCSF und stellen Sie die Durchflussrate korrekt. Inkubieren des Gewebes in 4-AP aufgelöst aCSF für etwa 5 bis 10 Minuten und dann konnte der Forscher die Software zu starten, um das Signal aufnehmen, wenn spontane Aktivität angezeigt. </li></ol> 5. Entfernen derGewebe aus dem PMEA Nach einem Experiment <ol><li> Steuern Sie die Gewebeanker durch einen Mikromanipulator und allmählich heben Sie das Gewebe aus der Aufnahmekammer. Fahren Sie sowohl Ein- und Ausgang, um den Fluss in der Aufnahmekammer zu stoppen. Die Aufnahmekammer sollte voll mit Lösung sein oder ein paar Tropfen der Lösung, um die Kammer zu füllen, wenn die Aufnahme Kammer nicht voll ist. </li><li> Mit einem kleinen Pinsel, um jede Ecke des Gewebes zu heben. Wenn das Gewebe nicht in der Lösung schweben, dann verwenden die Vakuumröhre in die Kammer sorgfältig mit dem Gewebe immer noch auf der Anordnung sitzt trocknen. Öffnen Sie dann vorsichtig den Einlass schrittweise füllen Sie die Kammer und fahren Sie den Einlass, um den Fluss zu stoppen, wenn der Aufnahmeraum ist voll. Übernehmen Sie die kleinen Pinsel, um jede Ecke des Gewebes wieder zu heben. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5.2 bis zum Gewebe wird aus dem Feld gelöst und schwebend in der Lösung. Wenn das Gewebe in der Lösung schwimmen, dann mit der Vakuumröhre, um das Gewebe entfernt saugen. Offene ter in der Einlassstrom und öffnen Sie den Unterdruck in der Steckdose. Waschen Sie das System mit destilliertem Wasser und trocknen Sie es heraus. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Entwicklung des ungefalteten Hippocampus Zubereitung, wobei die Längs- und Querachse des Hippocampus in Kombination mit einem durchdringenden Mikroelektrodenanordnung erhalten, stellt ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Anatomie Verbindungen oder neuronale Ausbreitung im Hippocampus 7 zu untersuchen. Diese sich entfaltenden Verfahren ist auch für das Studium Hippocampus in erwachsenen Mäusen. Jüngste Studien mit diesem Präparat zeigten, daß das 4-AP-induzierte epileptiforme Aktivität kann mit einer diag...

Das Verständnis der neuronalen Leitungs oder eine Ausbreitung einer neuronalen Signale ist für die Bestimmung des Mechanismus der neuronalen Kommunikation sowohl in der normalen Funktion und pathologischen Zuständen im Gehirn 1-3. Der Hippocampus ist eine der am besten untersuchten Strukturen im Gehirn, da sie wesentliche Rolle spielt in verschiedenen Gehirnfunktionen wie Speicher und räumliche Verfolgung und ist in mehreren pathologischen Veränderungen, die dramatisch beeinflussen Verhalten sowie 1,6 beteiligt. Zwar weist der Hippocampus eine komplexe Organisation, können die verschiedenen Elemente der Struktur leicht identifiziert und im Schnittpräparat 4-6 aufgerufen werden. In der Querrichtung des Hippocampus wird die neuronale Aktivität bekannt, durch das tri-synaptischen Weg, Gyrus dentatus (DG), CA3, CA1 andsubiculum 4,5 aufweisen ausbreiten. Es wird angenommen, dass die synaptische Übertragung und axonalen Leitungs spielen eine wichtige Rolle für die Kommunikatiauf in dieser Querschluss 4,6. Jedoch Ausbreitungs neuronalen Signals findet in sowohl Quer- als auch Längsrichtungen 4,6. Dies impliziert, dass der Hippocampus nicht vollständig durch Verwendung Schnittpräparate, die die Beobachtung zu einer bestimmten Ausbreitungsrichtung 4 begrenzen sucht werden. Die Längs Scheibe wurde entwickelt, um die axonalen Bahnen entlang der Längsachse 5 zu untersuchen. Forscher haben Verhalten spezifischen gamma und theta Schwingungen vorwiegend entlang der Quer- und Längsachsen jeweils 6 beobachtet. Diese Verhaltensweisen wurden getrennt untersucht, aber gleichzeitigen Zugriff auf beide Richtungen ist von entscheidender Bedeutung, um dieses Verhalten zu verstehen. Auch bei der Entwicklung des intakten Hippocampus Herstellung ist es schwierig, die Ausbreitung über den gesamten Gewebes infolge gefalteten Struktur des Hippocampus 4 überwachen. Die entfaltete Hippocampus bietet Zugriff auf die verpackt Neuronenin einer Form einer flachen Zellschicht 7,8 zweidimensional. Durch Entfalten des Gyrus dentatus (DG) (Abbildung 1), der Hippocampus nimmt eine abgeflachte Form mit einer rechteckigen Konfiguration, in welcher sowohl Quer- und Längsverbindungen intakt mit der pyramidalen Zellschicht in einer zweidimensionalen Platte, die sowohl CA3 und CA1 angeordnet zu bleiben, wobei ein Flachstück Nervengewebe, die verwendet werden können, um neuronale Ausbreitungs untersuchen (Figur 2) 8. Neuronale Aktivität kann dann mit einzelnen Glaspipetten Mikroelektrodenarrays, Stimulationselektroden sowie spannungsempfindlichen Farbstoffen (VSD) 3,7,8 überwacht werden. Zusätzlich können genetisch kodierte Spannungsanzeige aus transgenen Mäusen verwendet, um die Ausbreitungsmuster 9 verfolgen. Die flache Konfiguration des ungefalteten hippocampalen Netzwerk für optische Aufzeichnungsverfahren, sondern auch für eine Mikroelektrodenanordnung geeignet. Most der im Handel erhältlichen Arrays werden mit ebenen oder flachen Elektroden hergestellt und kann die neuronale Aktivität in beiden Gewebeschnitten und kultivierten Neuronen 10-12 aufzeichnen. Das Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR) verringert sich jedoch, wenn die Signale von einem intakten Gewebe erhalten werden, da das Soma der Neuronen befinden tiefer in das Gewebe. Mikroelektrodenanordnungen mit hohen Aspektverhältnissen erforderlich sind, um das SNR zu verbessern. Zu diesem Zweck ist eine durchdringende Mikroelektroden-Anordnung (PMEA) in unserem Labor entwickelt worden sind, und bietet die Möglichkeit, direkt in die Gewebeprobe durch Einführen 64 Spitzen mit einem Durchmesser von 20 &amp; mgr; m und einer Höhe von 200 um in der aufgeklappten Hippocampus 7,13 . Das Mikroelektrodenanordnung eine höhere SNR im Vergleich zu der spannungsempfindlichen Farbstoff-Bildgebung und die SNR bleibt während eines Experiments 7,13 stabil. Die Kombination des ungefalteten hippocampalen Präparat und PMEA bietet einen neuen Weg zu investierenIgate das neuronale Ausbreitung über einer zweidimensionalen Ebene. Experimente mit dieser Technik bereits erbrachte wichtige Ergebnisse über die Mechanismen der neuronalen Signalausbreitung im Hippocampus, wobei die neuronale Aktivität kann unabhängig von synaptischen oder elektrischen Synapsen 7 verbreiten.

<table><tbody><tr><td>Exsikkatorglas</td><td>LABRECYCLERS Inc.</td><td>5410</td><td>Legen Sie normale Papiertücher für die Tieranästhesie auf den Boden des Glases.&nbsp;</td></tr><tr><td>Eine Klinge und ein speziell angefertigter Operationstisch zur Entfaltung des Hippocampus</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Eine Petrischale wird kopfüber (in der Mitte) in das Eis gelegt und mit einem nassen Filterpapier darauf gelegt.</td></tr><tr><td>Maßgeschneiderte Geweberückgewinnungskammer</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Kunststoffröhrchen wurden mit Kunststoffgewebe am Boden verklebt und mit 95% O2/ 5% CO2 im aCSF blasig gemacht.</td></tr><tr><td>Geradliniger Betrieb&nbsp; Schere</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17336B&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Medco Instruments Nr.:81995&nbsp;</td><td>Diese Schere wird verwendet für&nbsp; &nbsp; Enthaupte die Mäuse.</td></tr><tr><td>Integra Miltex Goldman-Fox&nbsp; Schere</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-517&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; MILTEX INC&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Nr.:5-SC-320</td><td>Diese Schere wird verwendet, um den Schädel der Mäuse zu schneiden.&nbsp;</td></tr><tr><td>Miltex Hysterektomie-Zange</td><td>Claflin Medizinisches Gerät</td><td>CESS-722033-00001</td><td>Diese Pinzette wird verwendet, um den geschnittenen Schädel zu schälen, um das Gehirn freizulegen</td></tr><tr><td>Mikrospatel</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td>Dieser Mikrospatel wird verwendet, um das gesamte Gehirn einer Halbkugel in die Recorering-Kammer zu übertragen.</td></tr><tr><td>Frey Scientific Edelstahl Semi-Mikrospachtel</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td>Dieser Semi-Mikrospatel wird verwendet, um den entfalteten Hippocampus in die Glukose-aCSF in der Erholungskammer zu übertragen.</td></tr><tr><td>kleiner Pinsel</td><td>Lowe's</td><td>tem #:&nbsp; 105657&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Modell #:&nbsp; 90219</td><td>Der mit der kleinsten Größe in einer normalen Pinselpackung</td></tr><tr><td>Feuerpoliertes Glas Hilfswerkzeug</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Dieses Werkzeug wurde feuerpoliert und aus den üblichen Pasteur-Glaspipetten hergestellt.</td></tr><tr><td>Sonderanfertigung Glasnadel</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Dieses Werkzeug wurde feuerpoliert und aus den üblichen Pasteur-Glaspipetten hergestellt.</td></tr><tr><td>Maßgeschneidertes Glaswerkzeug mit einer Metalldrahtschlaufe</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Dieses Werkzeug wurde feuerpoliert und aus den regulären Pasteur-Glaspipetten mit einer neu geformten Metalldrahtschlaufe hergestellt.</td></tr><tr><td>Maßgeschneiderte Pipette für Glaslösung</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Dieses Werkzeug wurde aus den üblichen Pasteur-Glaspipetten hergestellt, wobei die Spitzen abgeschnitten und ein Gummikopf mit dem abgeschnittenen Ende befestigt wurde.</td></tr><tr><td>Maßgeschneiderter Gewebeanker</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Nylonfasergeflecht wurde auf einen isolierten Kupferdrahtring geklebt. Der Gewebeanker wurde von einem Mikromanipulator gehalten.</td></tr><tr><td>Kundenspezifisches Mikroelektroden-Array</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Weitere Einzelheiten zum Array finden Sie unter&nbsp; Kibler, et al., 2011.&nbsp;</td></tr><tr><td>Maßgeschneiderte Filter- und Verstärkerschaltungen für das Array</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Weitere Details zum Array finden Sie unter&nbsp; Kibler, et al., 2011.&nbsp;</td></tr><tr><td>Datenerfassungsprozessor 3400a</td><td>Microstar Laboratories</td><td>N/A</td><td>Hierbei handelt es sich um ein komplettes Datenerfassungssystem mit A/D-Wandler.</td></tr></tbody></table>

neuronale aktivitätsausbreitung in einem ungefalteten hippocampus vorbereitung mit einem durchdringenden mikroelektroden-array

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines neuen in vitro Flach Hippocampus Zubereitung in Kombination mit einer mikrobearbeiteten Array auf neuronale Aktivität Karte im Hippocampus. Die Querschnittpräparat Hippocampus ist die häufigste Gewebeaufbereitung zu Hippocampus Elektrophysiologie zu studieren. Eine Längshippocampusschnitt wurde um Längsverbindungen im Hippocampus untersuchen entwickelt. Die intakten Hippocampus der Maus kann auch in vitro aufrechterhalten werden, weil seine Dicke gestattet ausreichende Sauerstoffdiffusion. Allerdings sind diese drei Zubereitungen, bieten direkten Zugriff auf neuronale Ausbreitung da ein Teil des Gewebes ist nicht vorhanden oder gefaltet. Die abgewickelte intakten Hippocampus bietet sowohl Quer- und Längsverbindungen in einer flachen Konfiguration für den direkten Zugang zu dem Gewebe, das volle Ausmaß der Signalausbreitung im Hippocampus in vitro analysiert. Um die neuronale Aktivität von t wirksam zu überwachener Zellschicht, eine maßgeschneiderte dringenden Mikroelektrodenarrays (PMEA) wurde hergestellt und in die entfaltete Hippocampus angewendet. Die PMEA mit 64 Elektroden von 200 um in der Höhe könnte neuronale Aktivität tief in Hippokampus der Maus aufzeichnen. Die einzigartige Kombination von einem ungefalteten hippocampalen Präparat und PMEA stellt ein neues in vitro-Werkzeug, um die Geschwindigkeit und die Richtung der Ausbreitung der Nervenaktivität in der zweidimensionalen CA1-CA3 Hippocampus Regionen mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis zu untersuchen.

Die in den Figuren hier dargestellten Daten wurden im entfalteten Hippocampus Zubereitung mit 4-AP (100 uM) aCSF während der Inkubation des Gewebes in der Aufzeichnungskammer gegeben bei RT (25 ° C) aufgezeichnet. Normalerweise Aktivität beginnt innerhalb von 5 Minuten, aber in einigen Hippocampus-Gewebe von den älteren Tieren kann es länger dauern. Die mit der PMEA beobachtet 4-AP-induzierte neuronale Aktivität ist die gleiche wie zuvor berichtet 14,15. Da die Elektroden haben eine Höhe von 200 &amp; mgr; m,...

Wir haben einen in vitro ungefalteten Hippocampus die CA1-CA3 Anordnung von Neuronen bewahrt entwickelt. In Kombination mit der durchdringenden Mikroelektrodenanordnung kann die neuronale Aktivität in sowohl der Längs- und Querrichtungen überwacht werden. Diese Methode bietet Vorteile gegenüber hippocampalen Schnittpräparaten, wie die Ausbreitung im gesamten Hippocampus gleichzeitig aufgenommen werden.

Neuronale Aktivitätsausbreitung in einem ungefalteten Hippocampus Vorbereitung mit einem durchdringenden Mikroelektroden-Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Prozess der Entfaltung des Nagetier-Hippocampus einzuführen und die flache Gewebepräparation auf das durchdringende Mikroelektrodenarray zu legen. Für die Aufnahme. Dies wird erreicht, indem zunächst der Hippocampus einer Maus von der Hälfte ihres Gehirns isoliert wird.Der zweite Schritt besteht darin, die gekrümmte Struktur des Hippocampus mit speziell angefertigten Werkzeugen zu entfalten. Als nächstes wird der entfaltete Hippocampus in die Aufnahmekammer überführt und auf das Aufnahmearray gelegt. Der letzte Schritt besteht darin, den entfalteten Hippocampus nach dem Experiment aus dem Array zu entfernen.Letztendlich wird die individuelle Normalisierungs-Mapping-Methode in der Datenanalyse verwendet, um die Ausbreitung der neuronalen Aktivität zu zeigen, die von dem durchdringenden Mikroelektrodenarray aufgezeichnet wird. Nun, der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, die neuronale Aktivität in zwei Richtungen, quer und längs, aufzuzeichnen. Um die tatsächliche Ausbreitung der neuronalen Aktivität zu sehen, benötigt man einen intakten Hippocampus, rollt die Dellengläser ab und legt sich flach in eine Aufnahmekammer, und die Ausbreitung findet dann sowohl in Quer- als auch in Längsrichtung statt.Und wir waren dann in der Lage, die Geschwindigkeit der Vermehrung des Gewebes herauszufinden. Wir waren von der Aktivität in zwei Richtungen, und wir waren in der Lage, die Ausbreitungsmechanismen zu untersuchen, insbesondere die nicht-synaptischen Mechanismen. Wir konnten sehen, wie sich die Aktivität mit dieser synaptischen Übertragung mit diesen Gap Junctions ausbreitet, und aufgrund der Geschwindigkeit wissen wir, dass es sich nicht um eine Diffusion handelt.Jetzt versuchen wir, die tatsächlichen Mechanismen dieser Ausbreitung herauszuarbeiten. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, aufgrund der schwierigen Verfahren zur Entfaltung des Hippocampus Schwierigkeiten haben und das flache Gewebepräparat auf dieses durchdringende Mikroelektrodenarray legen, ohne das Gewebe oder das Array zu beschädigen. Um diesen Vorgang zu starten, legen Sie den Mauskopf in eiskalte, sauerstoffhaltige Saccharose.Ein Liquor verwendet eine feine Schere, um die Haut des Schädels zu entfernen. Als nächstes schneidest du den Schädel entlang der Mittellinie und die beiden Enden in der Nähe des Schläfenlappens. Schälen Sie dann den abgeschnittenen Schädel zu den Seiten des Kopfes hin.Um das Gehirn freizulegen, entfernen Sie das Gehirn vorsichtig mit dem Spatel aus dem Schädel. Legen Sie danach das Gehirn auf eine eiskalte chirurgische Bühne, die mit nassem Filterpapier bedeckt ist. Entfernen Sie das Kleinhirn mit einer eisgekühlten Klinge.Trennen Sie anschließend die beiden Hemisphären, indem Sie die Mittellinie des Gehirns durchtrennen. Dann die beiden getrennten Halbkugeln in ein mit eiskalter Saccharose gefülltes Becherglas geben. Ein Liquor sprudelte mit 95% Sauerstoff, 5% Kohlendioxid.Übertragen Sie eine Halbkugel auf die eiskalte Bühne, die mit Filterpapier bedeckt ist. Legen Sie normale Papiertücher oder Filterpapiere um das Gehirn, um die zusätzliche Lösung aufzunehmen. Verwenden Sie anschließend zwei feuerpolierte Glaspipetten, um den Kortex vom zentralen Teil des Gehirns zu trennen, um den Hippocampus freizulegen.Tragen Sie anschließend zwei bis drei Tropfen eiskaltes Suse A CSF auf das Gewebe auf und entfernen Sie die überschüssige Lösung. Schneiden Sie die Verbindungen mit dem Kortex an den beiden Enden des Hippocampus ab. Dann sezieren Sie den Hippocampus mit den feuerpolierten Glaswerkzeugen aus dem Gehirn.Trennen Sie anschließend den gesamten Hippocampus mit der äussersten Seite nach oben und dem Sulcus hippocampus nach unten. Tragen Sie schnell wieder zwei bis drei Tropfen eiskaltes Liquor auf das Gewebe auf und entfernen Sie die überschüssige Lösung um das Gewebe herum. Drehen Sie dann mit dem feuerpolierten Glaswerkzeug den gesamten Hippocampus um. Um den Sulcus freizulegen, beschneide mit einer eiskalten Klinge die septalen und temporalen Enden des Hippocampus.Führen Sie bei Bedarf eine speziell angefertigte Glasnadel in den Sulcus ein und schneiden Sie die Faserbahn von DG auf ca. drei ab. Ziehe dann mit einer Metalldrahtschlaufe den DG über und falte den Hippocampus auseinander. Der gesamte Operationsprozess dauert in der Regel etwa zwei Minuten.Tragen Sie weitere zwei bis drei Tropfen eiskalte Saccharose A CSF auf das Taschentuch auf und entfernen Sie die überschüssige Lösung um das Gewebe herum. Schneide dann die Ränder des entfalteten Hippocampus mit einer eiskalten Klinge ab. Bringen Sie das Präparat eine Stunde lang bei Raumtemperatur in die mit normalem A-Liquor gefüllte und mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid gefüllte Kammer, bevor Sie es in die Aufnahmekammer überführen.Füllen Sie bei diesem Verfahren eine Flasche mit normalem A-Liquor und eine weitere Flasche mit vier AP-A-Liquorblasen. Die Lösungen mit 95% Sauerstoff, 5% Kohlendioxid von Beginn der Experimente. Verwenden Sie einen Dreiecksverbinder, um zu steuern, welche Lösung während eines Experiments ausgewählt wird.Schließen Sie als Nächstes eine Vakuumröhre an den Auslass der Kammer an. Um die Lösung in einen Staubbehälter zu entfernen, erhitzen Sie die Rohrleitung, bevor Sie die Lösung in die Aufnahmekammer geben, und halten Sie sie auf einer kontrollierten Temperatur von 35 Grad Celsius. Nachdem Sie den Ein- und Auslass der Aufnahmekammer geschlossen haben, verwenden Sie eine speziell angefertigte Glaspipettenpipette, um den entfalteten Hippocampus in die Aufnahmekammer zu übertragen.Positionieren Sie unter dem Mikroskop den entfalteten Hippocampus mit der alviafarbenen Seite nach unten, ca. drei Bereiche, die wegzeigen, und ca. einem Feld, das in Richtung des Forschers zeigt, und saugen Sie die Lösung in der Kammer vorsichtig mit einer Vakuumpipette vom Rand der Aufnahmekammer ab, bis die Kammer getrocknet ist und das Gewebe auf dem Array liegt. Platzieren Sie dann vorsichtig einen speziell angefertigten Gewebeanker auf dem Gewebe, um den entfalteten Hippocampus auf dem Array zu halten. Füllen Sie die Aufnahmekammer mit ein paar Tropfen Lösung.Öffnen Sie nach und nach den Einlass und Auslass, um die Durchflussmenge in der Infusionsauslösekammer auf etwa zwei Tropfen pro Sekunde einzustellen. Inkubieren Sie das Gewebe in der Aufnahmekammer mit normalem A-Liquor für etwa eine Minute. Wechseln Sie dann die Lösungen.Auf vier AP gelöste A CSF auftragen und die Durchflussrate richtig einstellen. Inkubieren Sie das Gewebe vor der Aufzeichnung etwa fünf bis 10 Minuten lang in vier AP-gelösten A-Liquor. Um das Gewebe aus der PMEA zu entfernen, steuern Sie den Gewebeanker mit einem Mikromanipulator und heben Sie den Anker nach und nach aus der Aufnahmekammer an.Schließen Sie sowohl den Einlass als auch den Auslass, um den Durchfluss zu stoppen. Verwenden Sie in der Aufnahmekammer einen kleinen Pinsel, um die Ecke des Gewebes anzuheben. Wenn das Gewebe nicht in der Lösung schwimmt, verwenden Sie die Vakuumröhre, um die Kammer vorsichtig zu trocknen, während das Gewebe noch auf dem Array sitzt.Öffnen Sie dann vorsichtig den Einlass, um die Kammer nach und nach wieder zu füllen, und schließen Sie den Einlass, um den Durchfluss zu stoppen. Wenn die Aufnahmekammer voll ist, heben Sie mit dem kleinen Pinsel die Ecke des Taschentuchs an. Wieder. Wenn das Gewebe in der Lösung schwimmt, saugen Sie das Gewebe mit der Vakuumröhre ab.Öffnen Sie den Durchfluss am Einlass und das Vakuum am Auslass. Waschen Sie das System mit destilliertem Wasser und trocknen Sie es aus. Dies ist ein Beispiel für die spontane Aktivität, die durch 100 Mikromolare vier AP A CSF induziert wird, die von einer der Mikroelektroden im basalen dendritischen Bereich mit einem Signal-Rausch-Verhältnis von 34,9 Dezibel aufgezeichnet wurden.Und hier sind die vergrößerten Aktivitäten im roten Rechteck. Dies sind die Rohdaten einer anderen Mikroelektrode, die sich näher an den Spaltöffnungen befindet und ein Signal-Rausch-Verhältnis von 27,2 Dezibel aufweist. Hier ist ein weiteres Beispiel für eine Aufnahme, die von einer Elektrode erhalten wurde, die innerhalb der somatischen Schicht positioniert ist.In diesem Beispiel beträgt das Signal-Rausch-Verhältnis 18,53 Dezibel, und hier ist das von einer Mikroelektrode aufgezeichnete Grundrauschen. Die Basislinie hat in der Regel einen Spitze-zu-Spitze-Wert von 150 bis 200 Mikrovolt, und die Impedanz einer einzelnen Elektrode beträgt etwa ein bis zwei Megaohm. Dieses Video zeigt die neuronale Ausbreitung, die mit dem Array aufgezeichnet und dann mit der individuellen Normalisierungsmethode verarbeitet wurde.Bei der Datenanalyse dauert die gesamte Ausbreitung über das gesamte Gewebe nach diesem Verfahren etwa 100 Millisekunden. Andere Methoden wie Neuroimaging im entfalteten Hippocampus in Vitu können ebenfalls durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Bewegung von Neuroherden zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Hippocampus an Ort und Stelle, die Vorbereitung des flachen Gewebes auf das Mikro-Vorlesungsarray, entfalten können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

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Multi-Elektroden-Array Recordings neuronaler Lawinen in organotypischen Kulturen

Die Herstellung von akuten Hirnschnitten aus isolierten hippocampi, sowie die gleichzeitige elektrophysiologischen Ableitungen von Astrozyten und Neuronen...

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Dieses Video zeigt das Verfahren zum Einrichten einer Aufzeichnungskammer mit einem penetrierenden Mikroelektrodenarray (PMEA), um neuronale Signale von einem entfalteten Hippocampus zu erfassen. Diese Methode ermöglicht es uns, die Geschwindigkeit und Richtung der Ausbreitung der neuronalen Aktivität innerhalb des entfalteten Hippocampus in vitro zu untersuchen.

Aufzeichnung der neuronalen Aktivität von entfaltetem Hippocampusgewebe mit Hilfe eines durchdringenden Mikroelektrodenarrays

Dieses Protokoll beinhaltet die Verwendung eines Mikroelektrodenarrays (MEA), um die elektrische Aktivität in einem Gehirnschnitt aufzuzeichnen, der einem anfallsauslösenden Medikament ausgesetzt war. Das Verfahren umfasst die Positionierung des Gehirnschnitts in einer MEA-Aufnahmekammer, die Anwendung elektrischer Stimulation zur Induktion künstlicher Anfälle und die Analyse der resultierenden Signale.

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Dieses Video zeigt das Verfahren zum Einrichten eines Gehirnschnitts in einer Tauchkammer, um synaptische Aktivität aufzuzeichnen. Der Prozess umfasst die Befestigung der Scheibe auf Linsenpapier, die Aufrechterhaltung eines kontinuierlichen Flusses von künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF), um die Lebensfähigkeit der Neuronen zu gewährleisten, und die genaue Positionierung der Stimulations- und Aufzeichnungselektroden relativ zu einer bestimmten Gehirnregion. Dieser Aufbau ermöglicht...

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Dieser Videoartikel beschreibt experimentelle Verfahren zur Untersuchung der Langzeitplastizität und ihrer assoziativen Prozesse wie synaptisches Tagging, Capture und Cross-Tagging in den CA1-Pyramidenneuronen unter Verwendung von akuten Hippocampusschnitten von Nagetieren.

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Neuronale Aktivitätsausbreitung in einem ungefalteten Hippocampus Vorbereitung mit einem durchdringenden Mikroelektroden-Array

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