Primärtumor und MEF Zellisolation zu Lungenmetastasen Studieren

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Entstehung von Brusttumoren zu untersuchen. Mit dieser Technik werden Brusttumoren der Maus entfernt und Primärzellen aus Tumoren präpariert. Ein Lungenextraktionsprotokoll zur Untersuchung von Lungenmetastasen ist enthalten. Darüber hinaus ist ein weiteres Protokoll zur Analyse embryonaler Fibroblasten der Maus aus dem Mausembryo enthalten.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Agenesie von Brustkrebstumoren bei Mäusen zu untersuchen. Zunächst wird die Präparation von Primärzellen aus Brusttumoren der Maus demonstriert. Als nächstes wird vorgestellt, wie die Mauslunge zur Visualisierung von Lungenmetastasen extrahiert wird.

Schließlich wird die Präparation von embryonalen Fibroblasten der Maus aus Mausembryonen gezeigt, da diese Methoden zeigen, dass Mäuse, die transgenes für das Maus-Mammatumorvirus-Polyoma-Mittel-T-Antigen verwendet werden können, zur Untersuchung der Brustkrebstumoragenesie verwendet werden können. Diese Methode kann zwar Aufschluss über Brustkrebs geben, aber auch bei der Untersuchung anderer solider Tumoren eingesetzt werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da es wichtig ist, während der Schritte der Tumorillation nur Tumore und anderes Gewebe zu isolieren. Beginnen Sie mit einer Schere, um die Haut von der Harnröhrenöffnung bis zum Hals einer Maus zu öffnen Brusttumorvirus Polyom mittleres T-Antigen transgene Maus.

Dann die Haut festnageln und den Brusttumor isolieren. Waschen Sie den Tumor in situ mit kaltem PBS und legen Sie den Tumor in eine sterile 10 Zentimeter große Gewebekulturplatte. Übertragen Sie als Nächstes die Platte in eine sterile Laminar-Flow-Haube und hacken Sie den Tumor mit einer sterilen Rasierklinge und einer Schere in ein Kubikmillimeter große Stücke.

Inkubieren Sie die Stücke mit Kollagenase auf einer Wippe bei 37 Grad Celsius. Nach zwei Stunden schleudern Sie die resultierende Tumorgewebesuspension herunter. Waschen Sie das Pellet noch dreimal in PBS Resus und suspendieren Sie das Pellet nach dem letzten Waschen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius in EDTA mit Mutation

Waschen Sie dann die Zellen noch dreimal und resuspendieren Sie sie in normalem Wachstumsmedium. Zum Schluss inkubieren Sie die Zellen auf einer 10 Zentimeter großen Gewebekulturschale und wechseln Sie das Medium in den nächsten drei Tagen täglich, bis die gewünschte Zellzahl erreicht ist. Entfernen Sie vor der Extraktion der Lunge die Leber und das Zwerchfell und entfernen Sie die Rippen.

Öffnen Sie dann den oberen Teil der Luftröhre in der Nähe der Halsvene und injizieren Sie mit einem Katheter das entsprechende Mittel durch die Luftröhre, um die Lunge zu füllen, entfernen Sie die Lunge und betten Sie dann bei Verwendung von Z fix das Gewebe in Paraffin ein. Wenn Sie die Gewebe-Inec-Lösung mit Tusche fünf Minuten lang zurückhalten, erscheint das normale Lungengewebe schwarz, während die Tumorknötchen erscheinen. White klassifiziert alle Tumorknoten, die an sekundären Stellen mit einem Durchmesser von mehr als oder gleich 0,5 Millimetern sichtbar gemacht werden, als Metastasen, um embryonale Fibroblasten der Maus zu erzeugen.

Öffnen Sie zunächst die Haut einer trächtigen Maus von der Harnröhrenöffnung bis zum Hals, wie gerade gezeigt, und achten Sie darauf, die Embryonen nicht zu stören. Entfernen Sie anschließend die Gebärmutterhörner und spülen Sie sie in sterilem PBS aus. Trennen Sie dann die Embryonen vorsichtig von der Plazenta und einen nach dem anderen.

Legen Sie jeden Embryo in eine 10 Zentimeter große Kulturschale mit eiskaltem PBS. Nach der Entnahme des Kopfes, der Leber und des Darms spülen Sie den restlichen Teil des Embryos in eine Vertiefung einer 12-Well-Gewebekulturplatte, die PBS enthält, und schneiden Sie den Körper in einen Kubikmillimeter große Stücke. Übertragen Sie es in eine andere Vertiefung mit fünf Millilitern EDTA und inkubieren Sie das Gewebe bei 37 Grad Celsius.

Fügen Sie nach fünf Minuten einen Milliliter FBS hinzu, um die Verdauung zu inaktivieren. Schleudern Sie dann die resultierende Zellsuspension herunter und suspendieren Sie das Pellet erneut. In einem Milliliter warmem DMEM geben Sie schließlich die Zellen in eine 10 Zentimeter große Kulturschale, die 10 Milliliter DMEM enthält, die mit Antibiotika ergänzt sind, und kultivieren die Zellen, bis die gewünschte Zellzahl erreicht ist.

Das Tumorprogressionsstadium, in dem das Tier getötet werden soll, hängt von der jeweiligen Studie und den I-A-C-U-C-Richtlinien ab. Zum Beispiel wurde diese 100 Tage alte FVB-Maus mit dem Maus-Mammatumorvirus Polyoma Middle T Antigen drei Monate nach der Isolierung eines Tumors getötet, wie gerade die Mausbrust demonstriert wurde. Es wurden primäre Tumorzellen gewonnen.

Da viele Gene die Metastasierung von Brustkrebs in die Lunge vermitteln, wurde auch die Lunge extrahiert, wie gerade gezeigt, um den Metastasierungsprozess zu untersuchen. Die Lungen wurden dann mit Z-Fix aufgeblasen und mit Tusche gefärbt, um die Tumorknötchen sichtbar zu machen. Hier sind embryonale Fibroblasten der Maus zu sehen, die aus Mausembryonen des FVB-Stammes isoliert wurden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie wissen, wie man primäre Maustumorzellen und embryonale Fibroblasten der Maus isoliert und die Lunge der Maus extrahiert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit ISO-Fluor extrem gefährlich sein kann, da Vorsichtsmaßnahmen, wie z. B. die Arbeit mit einer chemischen F-Haube, während Sie dieses Verfahren durchführen, immer angreifend sein sollten.