Primärtumor und MEF Zellisolation zu Lungenmetastasen Studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Tumorgenese von Brustkrebs bei Mäusen zu untersuchen. Zunächst wird die Gewinnung von Primärzellen aus Maus-Brusttumoren demonstriert. Anschließend wird die Vorgehensweise zur Entnahme der Mauslunge zur Visualisierung von Lungenmetastasen beschrieben.

Schließlich wird die Herstellung von embryonalen Mausfibroblasten aus Mausembryonen gezeigt, da mit diesen Methoden transgene Mäuse für das polyoma middle T-Antigen des Maus-Mammatumormavirus untersucht werden können, um die Tumorentstehung bei Brustkrebs zu erforschen. Obwohl diese Methode Einblicke in die Brustkrebserkrankung ermöglicht, kann sie auch zur Untersuchung anderer solider Tumore angewendet werden. Die visuelle Darstellung dieser Methode ist entscheidend, da es wichtig ist, während der Tumorisolationschritte ausschließlich Tumorgewebe und kein anderes Gewebe zu isolieren. Beginnen Sie damit, mit einer Schere die Haut von der Harnröhrenöffnung bis zum Hals einer transgenen Maus für das polyoma middle T-Antigen des Maus-Mammatumormavirus zu öffnen.

Fixieren Sie dann die Haut und isolieren Sie den Brusttumor. Spülen Sie den Tumor in situ mit kaltem PBS und legen Sie den Tumor in eine sterile 10 cm große Zellkulturplatte. Überführen Sie anschließend die Platte in eine sterile Lamellenflusswerkbank und zerkleinern Sie den Tumor mit einem sterilen Rasiermesser und einer Schere in Stücke von je einem Kubikmillimeter.

Die Gewebestücke mit Kollagenase auf einem Schüttler bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach zwei Stunden die resultierende Tumorgewebssuspension abzentrifugieren. Den Pellet dreimal mehrmals mit PBS Resus waschen und nach der letzten Wäsche den Pellet für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius in zwei Milliliter Trypsin-EDTA suspendieren, dabei schütteln.

Anschließend die Zellen noch dreimal waschen und in normalem Wachstumsmedium resuspendieren. Zum Schluss die Zellen auf einer 10 cm großen Zellkulturschale inkubieren und das Medium in den folgenden drei Tagen täglich wechseln, bis die gewünschte Zellanzahl erreicht ist. Vor der Entnahme der Lunge entfernen Sie die Leber und das Zwerchfell und lockern Sie die Rippen.

Öffnen Sie dann den oberen Teil der Trachea in der Nähe der Vena jugularis und verwenden Sie einen Katheter, um das geeignete Mittel durch die Trachea zu injizieren, um die Lungen zu füllen. Entfernen Sie anschließend die Lungen. Falls Z-Fix verwendet wird, einbetten das Gewebe in Paraffin. Falls Indiantusche verwendet wird, deteinieren Sie das Gewebe fünf Minuten lang in der ecf-Lösung; das normale Lungengewebe erscheint dann schwarz, während die Tumorknoten weiß erscheinen. Klassifizieren Sie alle sichtbaren Tumorknoten an sekundären Lokalisationen mit einem Durchmesser größer oder gleich 0,5 Millimetern als Metastasen, um murine embryonale Fibroblasten zu erzeugen.

Öffnen Sie zunächst die Haut einer trächtigen Maus von der Harnröhrenmündung bis zum Hals, wie gerade gezeigt, wobei darauf zu achten ist, die Embryonen nicht zu stören. Entfernen Sie danach die Gebärmutterhörner und spülen Sie diese in steriler PBS-Lösung ab. Trennen Sie anschließend vorsichtig die Embryonen einzeln von der Plazenta.

Legen Sie jedes Embryo in eine 10 cm große Kulturschale, die kaltes PBS enthält. Nachdem Sie Kopf, Leber und Darm entfernt haben, spülen Sie den verbleibenden Teil des Embryos in einem Fach einer 12-Fach-Gewebekulturplatte, die PBS enthält, und schneiden den Körper in Stücke von je einem Kubikmillimeter. Überführen Sie in ein anderes Fach, das fünf Milliliter Trypsin-EDTA enthält, und inkubieren Sie das Gewebe bei 37 Grad Celsius.

Nach fünf Minuten ein Milliliter FBS hinzufügen, um die Verdauung zu inaktivieren. Anschließend die resultierende Zellsuspension zentrifugieren und das Pellet in einem Milliliter warmem DMEM resuspendieren. Zum Schluss die Zellen in eine 10 cm große Kulturschale überführen, die 10 Milliliter DMEM mit Antibiotika enthält, und die Zellen kultivieren, bis die gewünschte Zellzahl erreicht ist.

Der Tumorstadium, zu dem das Versuchstier geopfert wird, hängt von der jeweiligen Studie und den I-A-C-U-C-Richtlinien ab. Beispielsweise wurde diese 100 Tage alte FVB-Maus mit dem Maus-Mammatumorvirus-Polyoma-Middle-T-Antigen drei Monate nach der Tumorisolierung, wie gerade gezeigt, wegen eines Mausbrusttumors getötet. Primäre Tumorzellen wurden gewonnen.

Da viele Gene die Metastasierung von Brustkrebs in die Lunge beeinflussen, wurden auch die Lungen wie gerade gezeigt, um den metastatischen Prozess zu untersuchen, entnommen. Anschließend wurden die Lungen mit Z-Fix inflatiert und mit Tusche gefärbt, um die Tumorknoten sichtbar zu machen. Hier sind embryonale Fibroblasten der Maus gezeigt, die aus Embryonen der FVB-Mauslinie isoliert wurden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man primäre Maus-Tumorzellen und embryonale Maus-Fibroblasten isoliert sowie die Mauslunge entnimmt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit ISO-Fluor eine äußerst gefährliche Prozedur sein kann, bei der besondere Vorsichtsmaßnahmen erforderlich sind, beispielsweise die Arbeit im chemischen Abzug, die stets beachtet werden muss, während Sie dieses Verfahren durchführen.