Erweiterte Genetische Analyse der Einzelmenschen Biopartikeln von Simplified Mikromanipulation von Forensic 'Touch DNA' Evidence Recovered

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einzelne oder agglomerierte Zellen, die als mutmaßliche Biopartikel bezeichnet werden, aus forensischen Berührungs-DNA-Beweisen zu gewinnen und ein DNA-Profil des Spenders zu erhalten. Bei der Begehung eines Gewaltverbrechens wird eine kleine Anzahl von Zellen von einer Person auf eine andere Person übertragen, z. B. wenn ein Angreifer das Handgelenk eines Opfers packt. Um die geringe Anzahl von Zellen zu gewinnen, verwenden Sie zunächst einen Gelfilm mit geringer Adhäsion, der an einem Objektträger befestigt ist, um die Kontaktfläche zu beproben.

Der zweite Schritt besteht darin, die übertragenen Biopartikel zu färben, um sie unter dem Mikroskop besser betrachten zu können. Isolieren Sie anschließend die Biopartikel durch Mikromanipulation aus dem Gelfilm. Sammeln Sie den wasserlöslichen Klebstoff an der Spitze einer Wolframnadel und verwenden Sie ihn, um Biopartikel von Interesse von der Oberfläche des Gelfilms zu entfernen.

Der letzte Schritt besteht darin, die einzeln gesammelten Biopartikel vorsichtig in eine PCR-Amplifikationsmischung am Boden der A-PCR-Sammlung zu überführen, um schließlich verbesserte DNA-Typisierungsmethoden zu verwenden, um ein DNA-Profil des Spenders von DNA-Spuren zu erhalten. Okay, in meinem Labor konzentrieren wir uns auf die genetische Analyse der kleinen Anzahl von Zellen, die während der Begehung eines Gewaltverbrechens gegen eine Person zwischen einer Person und einer anderen Person oder zwischen einer Person und einem Objekt übertragen werden. Herkömmliche Methoden scheitern oft daran, das DNA-Profil von einer so kleinen Anzahl von Zellen wiederherzustellen.

Hier haben wir eine vereinfachte Methode für die physikalische Rückgewinnung und genetische Analyse einer so kleinen Anzahl von Zellen entwickelt, entweder einzelner Zellen oder Agglomerate von Zellen, die in jedes forensische Labor eingebaut werden können. Katie Fairish, eine Doktorandin in meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Um diesen Vorgang zu beginnen, bereiten Sie den Gelfilm vor, der zum Sammeln von Biopartikeln verwendet wird.

Schneiden Sie den Gelfilm auf die gewünschte Größe zu, die für den Glasobjektträger geeignet ist, der als fester Träger verwendet wird. Verwenden Sie beispielsweise für einen Glasobjektträger von drei Zoll x 1 Zoll die Gelfilmgröße von zwei Zoll x 0,75 Zoll. Entfernen Sie die weiße Unterlage von der Gelfolie und befestigen Sie die Gelfolie mit festem Druck auf dem Objektträger, um eine vollständige Befestigung zu gewährleisten.

Beachten Sie, dass es eine durchsichtige obere Schutzschicht gibt, die nicht entfernt werden sollte, damit Druck auf das Stück Gelfilm ausgeübt werden kann, ohne die Gelfilmoberfläche zu verunreinigen. Vorbereitete Gelfilm-Objektträger mit der angebrachten Schutzschicht können bis zur Verwendung bei Raumtemperatur gelagert werden. Wenn Sie bereit sind, den Gelfilm zu verwenden, verwenden Sie eine sterile Pinzette, um die durchsichtige obere Schutzschicht zu entfernen. Bringen Sie die Gelfilmoberfläche in direkten Kontakt mit einem gewünschten berührten Objekt oder einer gewünschten Oberfläche.

Zum Beispiel menschliche Haut aus dem Handgelenk. Üben Sie einen geringen Druck aus, um eine effiziente Übertragung der Biopartikel auf den Gelfilm zu gewährleisten. Üben Sie nicht zu viel Druck aus, da der Objektträger brechen könnte. Mehrere Proben vom selben Objekt oder die Oberfläche können auf demselben Stück Gelfolie gesammelt werden. Auf die gleiche Weise können Biopartikel von Gegenständen und Kleidungsstücken wie einem Hemdkragen gesammelt werden.

Um die Übertragung von Biopartikeln auf den Gelfilm zu bestätigen, untersuchen Sie den Objektträger an einem Stereomikroskop mit Trans- oder Epi-Beleuchtung. Eine Vergrößerung von ca. 20x eignet sich am besten für die Betrachtung größerer Bereiche des Gelfilms, während eine Vergrößerung von ca. 200x am besten für die Betrachtung einzelner Biopartikel geeignet ist. Lagern Sie den Objektträger der Gelfilmprobe bei Raumtemperatur in einer abgedeckten Objektträgerbox.

Bis zur Färbung und/oder Biopartikelsammlung können Biopartikel gefärbt werden, um die Visualisierung zu erleichtern. Um dies zu erreichen, legen Sie zunächst den wie zuvor gezeigt vorbereiteten Objektträger auf ein Objektträger-Färbegestell über einem Waschbecken. Decken Sie mit einer Einweg-Transferpipette die gesamte Oberfläche des Gelfilms mit Trianblau-Fleck ab und inkubieren Sie ihn ein bis zwei Minuten lang bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie überschüssigen Fleck, indem Sie den Schieber kippen, damit der Fleck bei Bedarf in die Spüle abfließen kann. Der Objektträger kann durch sanftes Fluten mit sterilem Wasser unter Verwendung einer Einweg-Transferpipette gespült werden. Nachdem der Objektträger getrocknet wurde, betrachten Sie ihn mit einem Stereomikroskop, um eine korrekte Färbung zu gewährleisten.

Der gebeizte Objektträger kann bei Raumtemperatur in einer abgedeckten Objektträgerbox gelagert werden. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die entsprechende Anzahl von 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen in ein Gestell legen und die Röhrchen entsprechend beschriften. Bereiten Sie ein geeignetes Volumen der STR-Amplifikationsmischung für die gewünschte Anzahl von Proben vor.

Vortex und Master gut mischen und kurz in einem Mini-Zentrifugen-PI-Pfad zentrifugieren. 3,5 Mikroliter Amplifikation. In jede 0,2-Milliliter-Röhrchenkappe jede Tube locker mischen.

Lege ein Stück doppelseitiges Klebeband direkt auf einen Glasblock. Dies wird verwendet, um das 0,2-Milliliter-Röhrchen während der Probenentnahme an Ort und Stelle zu halten. Legen Sie ein weiteres Stück doppelseitiges Klebeband auf einen sauberen Objektträger aus Glas.

Legen Sie dann ein Stück wasserlösliches Wellenschulterband auf das doppelseitige Klebeband. Sichern Sie das Klebeband in Position, indem Sie Druck über die gesamte Länge des Bandes ausüben. Die schützende obere weiße Schicht kann dann entfernt werden.

Legen Sie dann das erste 0,2-Milliliter-Röhrchen auf das doppelseitige Klebeband auf dem Glasblock. Legen Sie dieses Röhrchen beiseite, bis die Probe entnommen ist. Legen Sie das wasserlösliche Wave Soldier Tape Slide unter das Mikroskop, während Sie es mit geringer Vergrößerung betrachten.

Kratzen Sie mit der Spitze einer Zungenständernadel vorsichtig über die Oberfläche des Klebebandes, um die kleine Menge Klebstoff am Ende der Nadel aufzufangen. Die Größe der Klebekugel hängt von der Anzahl der Biopartikel ab, die sorgfältig gesammelt werden sollen. Entferne die Zungen.

Stellen Sie die Nadel mit Klebstoff unter dem Mikroskop auf, ohne die Nadelspitze zu stören. Lege die Nadel bei Bedarf in ein Gitter. Der kritischste Aspekt des Verfahrens ist das Sammeln und Übertragen der Biopartikel

Um den Erfolg zu gewährleisten, müssen die Techniken so lange geübt werden, bis der Analytiker sie beherrscht. Legen Sie eine zuvor vorbereitete Gelfilmprobe mit einem Glasblock auf den Mikroskoptisch, um den Objektträger zu stützen. Passen Sie den Fokus und die Vergrößerung an, bis die Biopartikel leicht zu sehen sind.

Identifizieren Sie die Biopartikel, die gesammelt werden. Nehmen Sie die Wolframnadel mit der Klebekugel heraus und platzieren Sie die Nadel über der Gelfilmoberfläche, auf der sich die interessierenden Biopartikel befinden. Drücken Sie die Spitze der Nadel nach unten, so dass sie mit dem Biopartikel in Kontakt kommt.

Heben Sie die Nadel an, um sicherzustellen, dass die Biopartikel aufgefangen wurden. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die gewünschte Anzahl an Biopartikeln gesammelt wurde. Legen Sie ein vorbereitetes 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen auf den Mikroskoptisch.

Stellen Sie die Vergrößerung so ein, dass der Boden der Röhre mit der Verstärkungsmischung scharf ist. Führen Sie die Wolframnadel beim Betrachten durch das Mikroskop vorsichtig in das 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen ein, bis sich die Spitze der Nadel in der Amplifikationsmischung befindet. Halten Sie die Nadel in die Amplifikationsmischung, bis sich der Klebstoff aufgelöst hat und die Freisetzung von Biopartikeln in die Lösung beobachtet wird.

Entfernen Sie die Nadel. Stellen Sie das 0,2-Milliliter-Röhrchen aufrecht und verschließen Sie es locker. Reinigen Sie die Wolframnadel mit einem angefeuchteten Alkoholtuch und wiederholen Sie diesen Entnahmevorgang für weitere Proben.

Um das erweiterte Amplifikationsprotokoll für die autosomale STR-Profilierung der gesammelten Biopartikel zu starten, geben Sie 1,5 Mikroliter Lysepuffer in jedes 0,2-Milliliter-Röhrchen mit der Amplifikationsmischung, und die Biopartikel verschließen die Deckel der Röhrchen fest. Legen Sie die Proben in den Thermocycler und amplifizieren Sie die Proben unter den im Protokolltext beschriebenen Zyklusbedingungen, wenn die Amplifikation abgeschlossen ist. Lagern Sie die Amplifikationsprodukte bei vier Grad Celsius, bis sie für den Nachweis durch Kapillarelektrophorese bereit sind.

Es werden keine repräsentativen Bilder einzelner Biopartikel in einer Hemdkragenprobe gezeigt. Die gesammelten Biopartikel werden eingekreist. Rote Kreise zeigen an, dass ein Profil wiederhergestellt wurde.

Die prozentuale Allel-Wiederfindung ist enthalten. Schwarze Kreise zeigen an, dass ein Profil nicht wiederhergestellt wurde. In ähnlicher Weise zeigen diese Bilder verklumpte Biopartikel in einer Hemdkragenprobe, die hier gezeigt wird, ist das STR-Profil, das aus einer der einzelnen Biopartikelproben aus dem Hemdkragen erhalten wurde.

Die Genauigkeit wurde durch den Vergleich mit einem Referenzprofil bestimmt. Allelzahlen werden unterhalb jedes Peaks an jedem Locus bezeichnet. Die x-Achse stellt die Fragmentgröße und die y-Achse die Signalintensität dar.

Dieses Profil ist von hoher Qualität mit einigermaßen ausgewogenen Peakhöhen zwischen den Locus und ohne allelische Aussetzer. Das nächste Profil ist ein vollständiges STR-Profil, das aus einer der verklumpten Biopartikelproben aus dem Hemdkragen gewonnen wurde. Schließlich zeigt diese Abbildung ein Beispiel für eine erfolglose DNA-Profilerstellung eines einzelnen Biopartikels mit einer 3%-Allel-Rückgewinnung.

Diese Methode soll die Wiederherstellung von DNA-Profilen aus einer einzigen Quelle von Angreifern in Fällen körperlicher Gewalt fördern. Es ist uns nicht entgangen, dass diese Methode auch einige der Probleme beseitigt, die mit der Interpretation und Entfaltung gemischter DNA-Profile verbunden sind.