Systemische bakterielle Infektion und Immunabwehr Phänotypen in

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, robuste und wiederholbare bakterielle Infektionen an Drosophila, Melanogaster, abzugeben und anschließend den Schweregrad der Infektion zu messen und die Immunantwort des Wirts zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem die bakterielle Infektion zunächst mit einem Nanoinjektor in die Fliegen eingebracht wird. Die Postmortalität kann nach der Infektion im Laufe der Zeit verfolgt werden, und die systemische Bakterienlast kann jederzeit durch Homogenisierung infizierter Fliegen und Messung der Anzahl der vorhandenen Bakterien bestimmt werden.

Die Immunabwehr des Wirts kann auch durch Messung des Expressionsniveaus von antibakteriellen Peptidgenen quantifiziert werden, was letztendlich die Quantifizierung und Charakterisierung der bakteriellen Infektion bedeutet. Bei Drosophila kann Melanogaster verwendet werden, um zu testen, wie genetische und umweltbedingte Faktoren die Immunkompetenz der Fliege verändern. Diese Methode kann verwendet werden, um Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Insektenimmunität zu beantworten, z. B. wie genetische und Umweltfaktoren des Wirts die Immunfähigkeit beeinflussen oder wie sich unterschiedliche Bakterien in ihrer Infektion unterscheiden. Obwohl wir diese Methode verwenden, um die Immunabwehr von Drosophila melanogaster gegen bakterielle Infektionen zu messen, kann sie auch auf andere Insekten angewendet werden und andere Arten von Krankheitserregern wie Viren oder Pilze nutzen.

Ein häufiges Problem, das Menschen erleben, wenn sie diese Methode zum ersten Mal erlernen, ist, dass sie Fliegen zu viele Verletzungen zufügen können, was zu einer übermäßig hohen Sterblichkeit führen kann, selbst bei Kontrollen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, um zu lernen, wie man eine Infektion mit minimalem Schaden für die Fliege durchführt. Da unsere Wirtsspezies oph melanogaster so klein ist, muss die Infektion unter dem Mikroskop erfolgen, was die anfängliche Komplexität der Technik noch erhöht.

Wir glauben jedoch, dass eine kleine Demonstration der Technik sie auch für Wissenschaftler zugänglich machen wird, die nur begrenzte Erfahrung mit Fliegen haben. Um das Experiment zu beginnen, wählen Sie eine einzelne Kolonie aus einer zuvor vorbereiteten Masterplatte aus und beimpfen Sie einen Kolben mit sterilem Medium. Züchten Sie die Bakterien über Nacht bei 37 Grad Celsius in die stationäre Phase.

Sobald die Kultur die stationäre Phase erreicht hat, pelletieren Sie die Zellen aus 600 Mikrolitern der Kultur in einer Tischzentrifuge drei Minuten lang mit 5.000 Mal. G, dann wirf die Rena und die Resus ab. Suspendieren Sie die Bakterien in 1000 Mikrolitern steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS.

Als nächstes verdünnen Sie die resuspendierten Zellen in sterilem PBS, um die gewünschte Absorption von 600 Nanometern zu erreichen, und verwenden Sie diese Suspension, um die Fliegenlügen zu infizieren. Bereiten Sie eine Glasnadel vor, indem Sie an einer geliehenen Silikatglaskapillare ziehen und mit einer Pinzette die Spitze der Nadel abbrechen, um eine Öffnung mit einem Durchmesser von 50 Mikrometern zu erhalten. Platzieren Sie als nächstes den O-Ring an der Decke und den weißen Abstandshalter mit dem großen Grübchen nach außen auf dem Metallkolben des Injektors.

Füllen Sie die Glasnadel mit Mineralöl mit einer Spritze mit einer 30-Gauge-Nadel. Führen Sie dann die gefüllte Glasnadel durch die Spannzange und platzieren Sie den größeren O-Ring einen Millimeter vom stumpfen Ende der Nadel entfernt um die Basis. Schieben Sie die Nadel auf den Metallkolben und schrauben Sie die Spannzange vorsichtig auf, bis sie fest sitzt.

Entfernen Sie das Mineralöl aus dem Injektor, wobei ein kleines Volumen Öl in der Nadel verbleibt, um als Barriere zwischen dem Injektor und der Bakteriensuspension zu wirken. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen im Mineralöl, in der Bakteriensuspension oder zwischen den beiden Flüssigkeiten befinden. Stellen Sie dann den Injektor auf das gewünschte Volumen für die Injektion ein.

Führen Sie die Spitze der Kapillarnadel vorsichtig in ein Röhrchen mit sterilem PBS ein und drücken Sie die Fülltaste am Injektor, um die Injektornadel zu füllen und Wundkontrollen zu erzeugen. Injizieren Sie anästhesierte Fliegen mit sterilem PBS in den vorderen Bauch auf der ventralen Seitenfläche, legen Sie die injizierten Fliegen in frische Fläschchen mit neuen Medien und legen Sie die Fläschchen auf die Seite, um zu verhindern, dass die Fliegen an der Nahrung haften bleiben, bevor sie sich von ihrer Narkose erholen. Werfen Sie anschließend das restliche sterile Medium aus dem Injektor aus und füllen Sie dieselbe Nadel erneut mit der Bakteriensuspension.

Wiederholen Sie den Vorgang und injizieren Sie die Bakteriensuspension in die Fliegen. Alternativ kann die Infektion durch einen septischen Nadelstich übertragen werden. Um den Infektionsstift vorzubereiten, schmelzen Sie das Ende einer 200-Mikroliter-Mikropipettenspitze und führen Sie einen 0,15 Millimeter Insekten-Mnuchin-Stift in den geschmolzenen Kunststoff ein.

Lassen Sie den Kunststoff erstarren, so dass der Stift mit 0,5 Zentimetern Stift, der aus dem Kunststoff herausragt, an Ort und Stelle gehalten wird, betäuben Sie die Fliegen mit Kohlendioxid und stechen Sie die Fliegen mit der Nadel in die sternale Pleuraplatte des Brustkorbs, wobei Sie die Befestigungsstellen der Flügel und der Beine vermeiden. Entfernen Sie die Fliegen mit einer weichen Pinzette vom Minutia-Stift. Achten Sie darauf, die Nadel zwischen dem Einstechen jeder Fliege in die Bakteriensuspension zu tauchen.

Legen Sie die gestochenen Fliegen in ein frisches Fläschchen mit neuem Fliegenmedium und legen Sie das Fläschchen auf die Seite, bis sich alle Fliegen von der Narkose erholt haben. Legen Sie eine Teilmenge der infizierten Fliegen in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Geben Sie 250 Mikroliter PBS in jedes Röhrchen und verwenden Sie einen Stößel, um die Fliegen zu homogenisieren.

Anschließend wird das Homogenat mit einem Spiralplattenteller auf ein LB-Belüftungssystem aufgetragen. Alternativ kann das Homogenat durch serielle Verdünnung plattiert werden. Übertragen Sie jedes Fliegenhomogenat in die erste Reihe einer 96.

Füllen Sie jede Vertiefung der verbleibenden Reihen mit einer Mehrkanalpipette mit 90 Mikrolitern PBS. Entnehmen Sie 10 Mikroliter aus der ersten Reihe mit Fliegenhomogenat und geben Sie das Homogenat in die zweite Reihe. Spritzen Sie es mindestens 10 Mal auf und ab, um das Homogenat gründlich zu vermischen.

Nehmen Sie dann 10 Mikroliter des Homogenats und übertragen Sie es in die nächste Reihe. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit den verbleibenden Reihen, beginnend mit der unteren Reihe. Verwenden Sie die Mehrkanalpipette, um 10 Mikroliter aus jeder Vertiefung zu entnehmen und auf einer LB-Platte abzugeben.

Stellen Sie sicher, dass die Proben als diskrete Spots ausgegeben werden, die sich nicht berühren. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Vertiefungen aus jeder Reihe beprobt wurden, und geben Sie sie in absteigender Reihenfolge der Verdünnung auf die LB-Platte. Unabhängig davon, welche Beschichtungsmethode verwendet wird, achten Sie darauf, dass die Platten nicht überwachsen, damit die Kolonien klein und diskret bleiben.

Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator. Sobald die experimentellen Bakterien sichtbare Kolonien gebildet haben, aber vor den Kolonien der Drosophila, wird die Darmmikrobiota etwa 24 Stunden später für Spiralplatten sichtbar. Zählen Sie die wachsenden Kolonien mit einem automatischen Koloniezähler, der die Bakterienlast pro Milliliter Homogenat basierend auf der Anzahl und Position der Kolonien auf der Platte schätzen kann.

Bei Spotplatten werden die Kolonien für jede Fliege manuell gezählt, je nachdem, welche Verdünnung 30 bis 300 Kolonien enthält, und die Anzahl der Bakterien pro Milliliter des ursprünglichen Homogenats berechnet. Den Fliegen wurden 50 Nanoliter Bakteriensuspensionen injiziert, die einen Bereich von optischen Dichten abdeckten, und die sofort homogenisierte und plattierte Infektionsdosis variierte mit der optischen Dichte der für die Injektion verwendeten Bakteriensuspension. Die anfängliche bakterielle Belastung korreliert stark mit der anfänglich injizierten OD.

Dieses Protokoll ermöglicht die Beobachtung verschiedener Arten von Infektionen. Die Fliegen wurden mit Providencia rei infiziert, die eine chronische subletale Infektion verursachen kann, die 20 Tage oder länger anhält. Fliegen, die mit Coli infiziert sind, beseitigen die Infektion innerhalb von sechs Stunden. Nach der Infektion.

Die Induktion des Immunsystems kann analog durch RNA-Isolierung und anschließende Q rtpcr R des antibakteriellen Peptidtranskripts abgeschätzt werden, weniger quantitativ jedoch bei Fliegen, die GFP unter der Kontrolle des antimikrobiellen Peptids exprimieren. Genpromotoren können verwendet werden, um die Induktion des Immunsystems zu visualisieren: Einmal gemeistert. Diese Technik kann die Infektion von Hunderten von Fliegen pro Stunde ermöglichen.

Es ist denkbar, dass eine beliebige Anzahl von Phänotypen bei den Fliegen gemessen werden kann, nachdem sie infiziert wurden, einschließlich der Fähigkeit zum Lernen von Mitleid, des Stoffwechselstatus oder praktisch jedes andere Merkmal, das man sich vorstellen kann. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie robuste und wiederholbare bakterielle Infektionen an Drosophila und Melanogaster abgeben und wie Sie anschließend den Schweregrad der Infektion messen und die Immunantwort des Wirts quantifizieren können. Vergessen Sie nicht, dass bestimmte Bakterien Risiken für die menschliche Gesundheit darstellen können.

Stellen Sie sicher, dass die richtigen Biosicherheitsverfahren befolgt werden und dass angemessene Eindämmungsmaßnahmen getroffen werden, um zu verhindern, dass infizierte Fliegen entkommen. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.