Name: Systemische bakterielle Infektion und Immunabwehr Phänotypen in Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Lernen Sie die Methode zur bakteriellen Infektion von Drosophila melanogaster mittels Nano-Injektor und deren Immunantwort-Quantifizierung. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung angeborener Immunität.

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Wir möchten dem gesamten Lazzaro-Labor und insbesondere Susan Rottschaefer für ihre Hilfe bei der Überprüfung und dem Testen dieser Protokolle danken. Dies ist ein Produkt ihrer geballten Expertise. Die Arbeit im Lazzaro-Labor wird durch die Zuschüsse R01 AI083932 und R01 AI064950 der US National Institutes of Health unterstützt.

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Keiner der Autoren hat konkurrierende oder widersprüchliche Interessen.

Das hier beschriebene Verfahren ergibt strenge und hohe Qualität Infektion von Drosophila melanogaster. Die dargestellten Beispiele in erster Linie auf eine Infektion mit Providencia rettgeri und E. konzentriert coli, aber das Protokoll ist sehr anpassungsfähig und kann zu Infektionen mit verschiedenen Bakterien über einen Bereich von Wirts Aufzucht und Wartungsbedingungen angewendet werden. Die Einzelheiten einer optimalen Versuchsansatz wird auf dem Bakterium zur Infektion verwendet, dem Genotyp des Wirts, und der allgemeinen experimentellen Bedingungen abhängen. Es wird dringend Pilotversuch keine neuen Versuchsbedingungen vor Einleitung ehrgeiziger Projekte empfohlen. Ein guter Ausgangspunkt ist es, drei Infektion Dosen über einen 100-fachen Bereich zu testen. Hoch virulenten Erreger sind oft am besten bei sehr niedrigen infektiösen Dosen eingebracht, in der Größenordnung von 10 bis 100 Bakterienzellen pro fly. Moderater Erreger können bei höheren Dosen von etwa 1.000 Bakterien pro fl injiziert werdeny, und nicht-Pathogene in Dosen bis zu 10.000 Bakterien pro Fliege injiziert werden. Es ist oft hilfreich, die besonderen Kinetik neuartiger Infektionen durch Verfolgen Keimmenge sorgt Mortalität und Aktivität des Immunsystems über einen Längenzeitreihe zu definieren. Weil Messung Keimmenge und Wirts Genexpression sind destruktiv Assays ist es notwendig, verschiedene entfernt zu Beginn des Experiments für jeden Zeitpunkt, der zu messen ist, zu infizieren. Bei der Entscheidung über Nadelstich oder Mikrokapillare-basierte Einspritz verwenden, ist es wichtig zu beachten, gibt es Vorteile und Grenzen zu jedem Ansatz. Kapillarinjektion führt ein Flüssigkeitsvolumen in die Fliege, die beide geringfügig erhöht Turgor und führt Salze oder andere Moleküle, die suspendiert sind, oder in dem Träger gelöst. Kapillarinjektion erfordert auch den Zugang zu einer Einspritzeinrichtung oder Kauf der erforderlichen Ausrüstung. Septic Nadelstich erfordert keine spezielle Ausrüstung und stelltvernachlässigbar Medien in die Fliege und ist typischerweise effizienter zu infizieren eine große Anzahl von Fliegen. Allerdings haben pinprick Infektionen erlauben die genaue Kontrolle über die Infektionsdosis, die mit Kapillarinjektion erreicht werden kann. Das vorliegende Protokoll das sich auf einer Einspritzvorrichtung, die mechanisch reguliert Injektionsvolumen, es gibt aber auch Einspritzsysteme Basis diskreter Impulse von Druckluft. 20,21 Dies sind in der Regel teurer ist als die Vorrichtung, die hier gekennzeichnet und erfordern eine Kalibrierung des Luftimpulses zu jedem Nadel, um eine konsistente Injektionsvolumina zu gewährleisten. Es gibt beträchtliche Debatte aber nur sehr wenig Daten darüber, wie Fliegen werden systemisch infizierten mit Bakterien in der Wildnis. Einige Forscher postulieren, daß die Mehrzahl der natürlichen Infektionen auftritt, wenn Drosophila einnehmen pathogene Bakterien und die Bakterien werden anschließend in der Lage, den Darm zu entkommen, um eine systemische Infektion zu etablieren. Es gibt jedoch sehr few Bakterien bekannt, dass in der Lage, den Darm von D. überqueren melanogaster, und diejenigen, die diese Fähigkeit zu tun sind sehr tödlich Fliegen 22,23. Eine alternative Theorie ist, dass regelmäßig fliegt aufrecht kutikulären Verletzungen durch Flucht aus dem gescheiterten Raubversuchen oder Angriffen durch ektoparasitären Milben. Diese Hypothese wird durch die häufige Sammlung von Wild D. unterstützt melanogaster Lager Melanisierung sichtbare Flecken weisen auf geheilten Wunden (unveröffentlichte Beobachtungen) sind. Milben wurde gezeigt, dass bakterielle Infektionen in Drosophila 24 übertragen und Wunden durch Milben links sekundär durch Bakterien bei der Honigbiene 25 infiziert werden. Die Häufigkeit in der Natur von milben angetrieben oder anderweitig opportunistische Infektion von D. melanogaster durch Kutikula Verletzungen ist nicht bekannt. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht Einführung der Bakterien direkt in die Hämolymphe durch quantitative Injektion, die keine Epithelbarrieren oder Verhaltens immu umgehtschaft. Verfahren zum Zuführen von pathogenen Bakterien zu D. melanogaster in Vodovar et al. 22 und Nehme et al. 23 beschrieben worden. Viele entomopathogenen Bakterien darstellen wenig oder gar keine Gefährdung der menschlichen Gesundheit, so dass die Forscher mit ihnen bequem arbeiten. Außerdem haben nur sehr wenige Bakterien die Fähigkeit, auf Drosophila Kontakt ohne experimentelle Intervention zu infizieren, so das Risiko einer &quot;Epidemie&quot; Ausbreitung der bakteriellen Infektion durch eine Labor über kontaminierte Flächen oder entkam Fliegen ist in der Regel sehr gering. Dennoch ist es ratsam, um sicherzustellen, dass angemessene Eindämmungsmaßnahmen vorhanden sind, um infizierte Fliegen Flucht zu verhindern und für die Rückeroberung jede entgangen Fliegen. Das Labor sollte in einem biologischen Sicherheitsniveau im Einklang mit, dass der Erreger verwendet ausgestattet werden, und Standard-Best Practices in der Mikrobiologie sollte eingesetzt werden. Die experimentelle infectihier beschriebene Verfahren ermöglicht Infektionen von Drosophila melanogaster mit jeder Dosis von jedem beliebigen Bakterium. Tretener Infektion festgestellt wurde, ist es einfach, die Kinetik der bakterielle Proliferation oder Luft mißt, die Wirts-Sterblichkeit zu verfolgen und die Induktion von dem Immunsystem des Wirts zu testen. Infizierten Fliegen können leicht auf andere phänotypischen Assays, einschließlich Tests der physiologischen Funktionen, die Form oder durch die Infektion förmigen, zu unterziehen. Die beschriebenen Verfahren sind kostengünstig, erfordern relativ wenig spezialisierte Ausrüstung, und sind leicht zu erlernen, so dass sie zugänglich für die Verwendung in verschiedenen Projekten in einer Breite von Forschung und Lehre Labors.

Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist einer der führenden Modellorganismen zur Untersuchung der Funktion und Evolution der Immunabwehr. Drosophila sind billig und leicht nach hinten, sind sehr offen für experimentelle Manipulation und werden von einer umfangreichen wissenschaftlichen Gemeinschaft, die ein breites entwickelt hat, gesichert Reihe von Forschungswerkzeuge. Viele Aspekte der angeborenen Immunität zwischen Insekten und Säugetieren 1,2 konserviert, einschließlich Signaltransduktion von Toll-like Rezeptoren und NF-kB-Familie Transkriptionsfaktoren, JAK / STAT-Signalisierung und JNK-Weg vermittelten Reaktionen. Die Funktion dieser Gene und Signalwege können in D. abgefragt werden melanogaster mit Mutationen oder RNAi Niederschläge, Zunahme oder Abnahme Weg Aktivitäten. 3 - 6 Zusätzlich Drosophila kann verwendet werden, um die physiologischen Folgen der Infektion und Krankheit zu untersuchen, auch im Rahmen der Evolutionstheorie Lebensgeschichte werden 7.- 9. Allen diesen Untersuchungen ist jedoch abhängig von der Fähigkeit, zuverlässig zu infizieren Versuchslinie unter definierten Behandlungsbedingungen. Das hier beschriebene Verfahren stellt einen methodischen Rahmen für die Bereitstellung von robusten und wiederholbare bakterielle Infektionen zu Drosophila melanogaster und anschließend Messen Infektion Schwere und die Quantifizierung der Immunantwort des Wirts. Drosophila können natürlich und experimentell durch eine große Vielzahl von Parasiten und Krankheitserreger, wie Bakterien, Pilze, Viren, Nematoden und Parasitenwespen infiziert werden. Das aktuelle Protokoll wird auf die Bereitstellung von systemischen bakteriellen Infektion konzentriert. Viele verschiedene Bakterien verwendet werden, um Fliegen zu infizieren, und die Wahl des Experimentators sollte über die genauen wissenschaftlichen Fragen auf der Grundlage aufgefordert werden. Zum Beispiel können menschliche klinische Isolate verwendet, um bakterielle Virulenzmechanismen 10 zu untersuchen, oder ökologisch relevanten Isolate liebsten mit seind für evolutionäre Studie. 11 Einige Bakterien sind Krankheitserreger der zuständigen D. melanogaster, wuchernden bei Infektion und verursacht Host Krankheit oder Tod. Andere Bakterien werden effektiv durch das Immunsystem des Wirts verwaltet und innerhalb von wenigen Tagen vollständig. In dieser Demonstration werden Providencia rettgeri als proliferative Krankheitserreger, der Host Sterblichkeit verursachen und bleibt in lebenden Hosts. Escherichia coli wird als nicht-pathogen, die vom Immunsystem des Wirtes freigegeben wird, verwendet werden, verwendet werden. Infektion wird durch die Einführung von Bakterien direkt in die Körperhöhle des Fliegen hergestellt werden. Dieser Ansatz umgeht Epithelbarrieren und Schutzverhalten, so dass Untersuchung der systemischen Infektion unabhängig von der natürlichen Form der Übertragung. Es gibt grundsätzlich zwei Methoden zur Festlegung experimentell systemische Infektion. In der ersten, eine nanoinjector und zog Glaskapillare Nadeln verwendet werden, um eine genaue Anzahl von injizierenBakterien in der Fliege. Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass sie einen großen dynamischen Bereich der Infektionsdosis und der quantitativ höchst reproduzierbar. Der zweite Ansatz ist, um eine Infektion mit einem septischen Nadelstich zu liefern. Dieser Ansatz hat den Vorteil, dass eine schnelle und keine spezielle Ausrüstung erforderlich ist. Sobald die Infektion festgestellt werden, wird es möglich, die systemische Belastung Erreger, Wirt Mortalität und induzierbare Aktivität des Immunsystems zu messen. Natürlich könnte eine beliebige Anzahl von zusätzlichen Phänotypen denkbar in infizierten D. mess melanogaster, auch nach der Infektion Fruchtbarkeit 12, Lernfähigkeit 13, 14 Stoffwechsellage oder praktisch jede andere Eigenschaft, die man sich vorstellen kann.

<table><tbody><tr><td>Incubator</td><td>Powers Scientific, Inc</td><td>DROS52SD</td><td></td></tr><tr><td>Paintbrush</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 Flypads</td><td>FlyStuff</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Airgas</td><td>CD FG50</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila-Aufzuchtmischung&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 oz Flaschen mit quadratischem Boden, Polypropylen</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td></td></tr><tr><td>Nosterile Extra Große Wattebällchen</td><td>Marke Fisher Marke</td><td>22-456-882</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Fläschchen Polystyrol</td><td>VWR international</td><td>89092-720</td><td></td></tr><tr><td>Nosterile große Wattebällchen</td><td>Fisher brand</td><td>22-456-883</td><td></td></tr><tr><td>2 L Trinkflasche</td><td>VWR international</td><td>89000-370</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen mit klarem Deckel, erhöhter Grat; 100 x 15 mm;</td><td>VWR international</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar, Miller</td><td>Difco</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Impföse</td><td>VWR</td><td>international 80094-488</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Clasic Pipetten in verschiedenen Größen 0,1 &micro; L bis 2 &Mikro; L, 2 &MICRO; l bis 20 &micro; L, 20 &MICRO; l bis 200 &micro; L, 100 &MICRO; l bis 1.000 &micro; l</td><td>Rainin</td><td>PR-2 PR-20 PR-200 PR-1000</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenspitzen (verschiedene Größen)</td><td>VWR international</td><td>30128-376 53503-810 16466-008</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bouillon Base, Miller</td><td>Difco</td><td>241420</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Kulturröhrchen Borosilikatglas</td><td>VWR international</td><td>47729-576</td><td></td></tr><tr><td>S-500 Orbital Schüttler</td><td>VWR international</td><td>14005-830</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>VWR international</td><td>37001-300</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4 10X</td><td>Invitrogen</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000 Spektralphotometer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>Semimikrovolumen-Küvetten</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9955</td><td></td></tr><tr><td>Vertikaler Kapillarabzieher</td><td>Kopfnadel Pipettenabzieher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,5'' Ersatzglaskapillaren für Nanojet II</td><td>Drummond Sientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond Sientific Company</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Spritze</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl, Weiß, hell</td><td>Macron Feinchemikalien</td><td>6358-10</td><td></td></tr><tr><td>Minuteinstifte</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml&nbsp; Mikrozentrifugenröhrchen; Siegel Rite</td><td>USA Scientific Inc.</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Motorisierter Stößel; Talboys Laborrührer</td><td>Troemner</td><td>103</td><td></td></tr><tr><td>Talboys Hochdurchsatz-Homogenisator</td><td>OPS Diagnostics</td><td>930145</td><td></td></tr><tr><td>5/32'' Mahlkugeln</td><td>OPS Diagnostics</td><td>GBSS 156-5000-01</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>Scientific indurstries inc.</td><td>G560</td><td></td></tr><tr><td>Mehrkanalpipette (10 &mu; l - 300 &mu; l)</td><td>Sartorius</td><td>730360</td><td></td></tr><tr><td>WASP2 Whitley Automated Spiral Plater</td><td>Microbiology International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ProtoCOL automatisierter Koloniezähler / Plattenzähler / Plattenleser&nbsp;</td><td>Microbiology International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>qPCR-Röhrchen; Low-Profile 0,2 ml 8-Röhrchen-Streifen</td><td>Bio-Rad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td>qPCR-Kappen; Optische flache 8-Kappen-Streifen</td><td>Bio-Rad</td><td>TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNase-freie DNase</td><td>Promega</td><td>m610a</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Reverse Transkriptase</td><td>Promega</td><td>m170b</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1240</td><td></td></tr><tr><td>Oligo-dT</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; SsoAdvanced SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5260</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Echtzeit-PCR-Nachweissystem</td><td>Bio-Rad</td><td>185-5200</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Ribonuklease-Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2115</td><td></td></tr></tbody></table>

systemische bakterielle infektion und immunabwehr phänotypen in<em&gt; drosophila melanogaster</em

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist einer der führenden Modellorganismen zur Untersuchung der Funktion und Evolution der Immunabwehr. Viele Aspekte der angeborenen Immunität zwischen Insekten und Säugetieren konserviert, und da Drosophila leicht genetisch und experimentell manipuliert werden, stark für die Untersuchung der Funktion des Immunsystems und die physiologischen Folgen der Krankheit sind. Das hier gezeigte Verfahren ermöglicht Infektion von Fliegen durch die Einführung von Bakterien direkt in die Körperhöhle, unter Umgehung Epithelbarrieren und passive Formen der Verteidigung und damit Fokussierung auf systemische Infektion. Das Verfahren umfasst Protokolle für die Messrate der Wirts Mortalität, systemische Keimmenge und der Grad der Induktion von dem Immunsystem des Wirts. Diese Infektion Verfahren ist preiswert, robust und quantitativ reproduzierbar und kann in Studien der funktionellen Genetik, evolutionäre Lebensgeschichte und Physiologie verwendet werden.

Dieser Teil zeigt Ergebnisse, die nach der bakteriellen Infektion von Drosophila melanogaster, erhalten werden kann. Figur 1 zeigt, dass die Infektionsdosis variiert mit der optischen Dichte der bakteriellen Suspension zur Injektion verwendet werden, und dass das gelieferte zuverlässig durch Homogenisieren und Plattieren abschätzen Dosis fliegt unmittelbar nach der Injektion . Wie in Figur 2 dargestellt ist, kann verschiedene Erreger verschiedenen Ebenen der Host Mortalität (2A) und Host-Sterblichkeit führen kann dosisabhängig (2B) ist. Wichtig ist, ermöglicht dieses Protokoll für verschiedene Typen von Infektionen erreicht werden: Providencia rettgeri kann eine chronische subletaler Infektion, für 20 Tage oder länger (3A) besteht verursachen. Aber auch andere Bakterien wie Escerichia coli wird meist durch den Host-fly innerhalb von sechs Stunden nach der Infektion (3B) gelöscht werden. Induktion der Immun system kann durch RNA-Isolierung und anschließende qRT-PCR von antibakteriellen Peptid-Transkripte (4A und B) geschätzt werden. Analog, jedoch weniger quantitativ, Fliegen, die GFP unter der Kontrolle des antimikrobiellen Peptids Genpromotoren verwendet werden, um die Induktion des Immunsystems (4C) zu visualisieren. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig1.jpg" /> . Abbildung 1: Bestimmung Infektionsdosis Fliegen wurden mit 50 nl von Bakteriensuspensionen, die einen Bereich von optischen Dichten (0,0001 bis 0,05) injiziert. Die Fliegen wurden sofort homogenisiert und ausplattiert, um die Zahl der Bakterien durch die Injektion eingeführt zu bestimmen. Initial bakterielle Belastung korreliert stark mit Anfangs-OD injiziert (r 2 = 0,96) <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig2.jpg" /> <strong&gt; Abbildung 2:. Überleben nach der Injektion mit bakterieller Pathogene Fünf bis sieben Tage alte Männer wurden mit 50 nl entweder bakteriellen Suspension oder sterile Medien eingespritzt und für das Überleben überwacht. (A) Wildtyp-Fliegen wurden mit etwa 5.000 Bakterien aus einer von drei verschiedenen Spezies injiziert. Die Rate des Host Mortalität hängt stark von den für die Infektion verwendeten Bakterienspezies. 50, 500 und 5.000 Bakterien pro fly - (B) Wildtyp-Fliegen wurden mit drei verschiedenen Dosen von Enterococcous faecalis injiziert. Fliegen sterben schneller, wenn mit höheren infektiösen Dosen (C) infiziert Ein Immunsystem Mutanten und ihre Wildtyp-isogenen Steuerleitung wurden mit etwa 500 Burkholderia cepacia injiziert. Eine paarweise Log-Rank-Vergleich zeigt, dass die Wildtyp-fly die Infektion deutlich besser als der Mutante (χ 2 = 59.02, df = 1, p &lt;0,0001) überlebt. Abb. 3: bakterielle Belastung nach der Injektion Fliegen wurden mit etwa (A) 5000 P. injiziert rettgeri (B) 3400 E. coli. Bakterielle Belastung wurde unmittelbar nach der Injektion und bei verschiedenen nachfolgenden Zeitpunkte bestimmt. Jeder Datenpunkt stellt die bakterielle Belastung einer einzigen Fliege. E. coli schnell von Hosts in Frage gestellt, während P. gelöscht rettgeri bleibt für den Rest des Hosts Leben ,. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig4.jpg" /> Abbildung 4: Induktion von Immun Gene Expression nach der Injektion. (A) Die Fliegen wurden mit 50 nl injiziert P. rettgeri oder sterilem PBS entweder in den Bauch oder Brustkorb, oder wurden aus CO links unmanipulated beiseite <sub&gt; 2 Anästhesie. Sechs Stunden nach der Infektion wurden die Fliegen für die RNA-Isolierung und Expression des Diptericin Ein Gen wurde mit qRT-PCR bestimmt gesammelt. (A) Expressionsniveaus werden als das Verhältnis der Diptericin graphisch dargestellt, um ein Transkript rp49 Transkript und skaliert, dass die CO 2 Steuerung als eine Expressionsniveau 1. Die Balken stellen den Mittelwert und Standardfehler von Verhältnissen von jeder Bedingung definiert (n = 4). (B) Die Expressionsniveaus werden als 2 ΔΔCT mit der durchschnittlichen C T-Wert von CO 2 aesthesia Kontrollfliegen als Standard nicht-induzierten Zustand gebraucht grafisch dargestellt. Die Balken stellen den Mittelwert und Standardfehler der ΔΔC T von jedem Zustand (n = 4). Zwar gibt es keinen Unterschied in der Niederschrift Induktion aufgrund der Injektionsstelle, Vergleich der Platten A und B zeigt, wie die ΔΔC T Methode kann potenziell zu überschätzen Induktionsniveaus. (C) Fliegt, die GFP unter der Kontrolle des Promotors Diptericin A wurden mit 50 nl injiziert P. rettgeri (OD = 0,1) und dann abgebildet wird 7 Tage später. Die GFP-Panel zeigt die Expression von GFP in der Bauchfettkörper der infizierten Fliegen, was die Aktivierung des Diptericin Ein Promotor in bakteriell infizierten Fliegen, aber nicht medien injizierten Kontrollen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Gen </td><td> Vorwärts </td><td> Rückwärts </td></tr><tr><td> rp49 (auch genannt rpL32) </td><td> 5&#39;AGGCCCAAGATCGTGAAGAA 3&#39; </td><td> 5&#39;GACGCACTCTGTTGTCGATACC 3&#39; </td></tr><tr><td> Diptericin A </td><td> 5&#39;GCGGCGATGGTTTTGG 3&#39; </td><td> 5&#39;CGCTGGTCCACACCTTCTG 3&#39; </td></tr><tr><td> Drosomycin </td><td> 5 &#39;CTGCCTGTCCGGAAGATACAA 3 &#39; </td><td> 5&#39;TCCCTCCTCCTTGCACACA 3&#39; </td></tr><tr><td> Defensin </td><td> 5&#39;GAGGATCATGTCCTGGTGCAT 3&#39; </td><td> 5&#39;TCGCTTCTGGCGGCTATG 3&#39; </td></tr><tr><td> Attacin A </td><td> 5&#39;CGTTTGGATCTGACCAAGG 3&#39; </td><td> 5&#39;AAAGTTCCGCCAGGTGTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Metchnikowan </td><td> 5&#39;AACTTAATCTTGGAGCGATTTTTCTG 3&#39; </td><td> 5&#39;ACGGCCTCGTATCGAAAATG 3&#39; </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Primer für qRT-PCR.

Drosophila melanogaster ist ein hervorragender Modellorganismus für die Untersuchung des angeborenen Immunsystems und der physiologischen Folgen von Infektionen und Krankheiten. Dieses Protokoll beschreibt, wie robuste und quantitativ wiederholbare bakterielle Infektionen an D. melanogaster verabreicht werden können und wie der Schweregrad der Infektion anschließend gemessen und die Immunantwort des Wirts quantifiziert werden kann.

Systemische bakterielle Infektion und Immunabwehr Phänotypen in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, robuste und wiederholbare bakterielle Infektionen an Drosophila, Melanogaster, abzugeben und anschließend den Schweregrad der Infektion zu messen und die Immunantwort des Wirts zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem die bakterielle Infektion zunächst mit einem Nanoinjektor in die Fliegen eingebracht wird. Die Postmortalität kann nach der Infektion im Laufe der Zeit verfolgt werden, und die systemische Bakterienlast kann jederzeit durch Homogenisierung infizierter Fliegen und Messung der Anzahl der vorhandenen Bakterien bestimmt werden.Die Immunabwehr des Wirts kann auch durch Messung des Expressionsniveaus von antibakteriellen Peptidgenen quantifiziert werden, was letztendlich die Quantifizierung und Charakterisierung der bakteriellen Infektion bedeutet. Bei Drosophila kann Melanogaster verwendet werden, um zu testen, wie genetische und umweltbedingte Faktoren die Immunkompetenz der Fliege verändern. Diese Methode kann verwendet werden, um Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Insektenimmunität zu beantworten, z. B. wie genetische und Umweltfaktoren des Wirts die Immunfähigkeit beeinflussen oder wie sich unterschiedliche Bakterien in ihrer Infektion unterscheiden. Obwohl wir diese Methode verwenden, um die Immunabwehr von Drosophila melanogaster gegen bakterielle Infektionen zu messen, kann sie auch auf andere Insekten angewendet werden und andere Arten von Krankheitserregern wie Viren oder Pilze nutzen.Ein häufiges Problem, das Menschen erleben, wenn sie diese Methode zum ersten Mal erlernen, ist, dass sie Fliegen zu viele Verletzungen zufügen können, was zu einer übermäßig hohen Sterblichkeit führen kann, selbst bei Kontrollen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, um zu lernen, wie man eine Infektion mit minimalem Schaden für die Fliege durchführt. Da unsere Wirtsspezies oph melanogaster so klein ist, muss die Infektion unter dem Mikroskop erfolgen, was die anfängliche Komplexität der Technik noch erhöht.Wir glauben jedoch, dass eine kleine Demonstration der Technik sie auch für Wissenschaftler zugänglich machen wird, die nur begrenzte Erfahrung mit Fliegen haben. Um das Experiment zu beginnen, wählen Sie eine einzelne Kolonie aus einer zuvor vorbereiteten Masterplatte aus und beimpfen Sie einen Kolben mit sterilem Medium. Züchten Sie die Bakterien über Nacht bei 37 Grad Celsius in die stationäre Phase.Sobald die Kultur die stationäre Phase erreicht hat, pelletieren Sie die Zellen aus 600 Mikrolitern der Kultur in einer Tischzentrifuge drei Minuten lang mit 5.000 Mal. G, dann wirf die Rena und die Resus ab. Suspendieren Sie die Bakterien in 1000 Mikrolitern steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS.Als nächstes verdünnen Sie die resuspendierten Zellen in sterilem PBS, um die gewünschte Absorption von 600 Nanometern zu erreichen, und verwenden Sie diese Suspension, um die Fliegenlügen zu infizieren. Bereiten Sie eine Glasnadel vor, indem Sie an einer geliehenen Silikatglaskapillare ziehen und mit einer Pinzette die Spitze der Nadel abbrechen, um eine Öffnung mit einem Durchmesser von 50 Mikrometern zu erhalten. Platzieren Sie als nächstes den O-Ring an der Decke und den weißen Abstandshalter mit dem großen Grübchen nach außen auf dem Metallkolben des Injektors.Füllen Sie die Glasnadel mit Mineralöl mit einer Spritze mit einer 30-Gauge-Nadel. Führen Sie dann die gefüllte Glasnadel durch die Spannzange und platzieren Sie den größeren O-Ring einen Millimeter vom stumpfen Ende der Nadel entfernt um die Basis. Schieben Sie die Nadel auf den Metallkolben und schrauben Sie die Spannzange vorsichtig auf, bis sie fest sitzt.Entfernen Sie das Mineralöl aus dem Injektor, wobei ein kleines Volumen Öl in der Nadel verbleibt, um als Barriere zwischen dem Injektor und der Bakteriensuspension zu wirken. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen im Mineralöl, in der Bakteriensuspension oder zwischen den beiden Flüssigkeiten befinden. Stellen Sie dann den Injektor auf das gewünschte Volumen für die Injektion ein.Führen Sie die Spitze der Kapillarnadel vorsichtig in ein Röhrchen mit sterilem PBS ein und drücken Sie die Fülltaste am Injektor, um die Injektornadel zu füllen und Wundkontrollen zu erzeugen. Injizieren Sie anästhesierte Fliegen mit sterilem PBS in den vorderen Bauch auf der ventralen Seitenfläche, legen Sie die injizierten Fliegen in frische Fläschchen mit neuen Medien und legen Sie die Fläschchen auf die Seite, um zu verhindern, dass die Fliegen an der Nahrung haften bleiben, bevor sie sich von ihrer Narkose erholen. Werfen Sie anschließend das restliche sterile Medium aus dem Injektor aus und füllen Sie dieselbe Nadel erneut mit der Bakteriensuspension.Wiederholen Sie den Vorgang und injizieren Sie die Bakteriensuspension in die Fliegen. Alternativ kann die Infektion durch einen septischen Nadelstich übertragen werden. Um den Infektionsstift vorzubereiten, schmelzen Sie das Ende einer 200-Mikroliter-Mikropipettenspitze und führen Sie einen 0,15 Millimeter Insekten-Mnuchin-Stift in den geschmolzenen Kunststoff ein.Lassen Sie den Kunststoff erstarren, so dass der Stift mit 0,5 Zentimetern Stift, der aus dem Kunststoff herausragt, an Ort und Stelle gehalten wird, betäuben Sie die Fliegen mit Kohlendioxid und stechen Sie die Fliegen mit der Nadel in die sternale Pleuraplatte des Brustkorbs, wobei Sie die Befestigungsstellen der Flügel und der Beine vermeiden. Entfernen Sie die Fliegen mit einer weichen Pinzette vom Minutia-Stift. Achten Sie darauf, die Nadel zwischen dem Einstechen jeder Fliege in die Bakteriensuspension zu tauchen.Legen Sie die gestochenen Fliegen in ein frisches Fläschchen mit neuem Fliegenmedium und legen Sie das Fläschchen auf die Seite, bis sich alle Fliegen von der Narkose erholt haben. Legen Sie eine Teilmenge der infizierten Fliegen in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Geben Sie 250 Mikroliter PBS in jedes Röhrchen und verwenden Sie einen Stößel, um die Fliegen zu homogenisieren.Anschließend wird das Homogenat mit einem Spiralplattenteller auf ein LB-Belüftungssystem aufgetragen. Alternativ kann das Homogenat durch serielle Verdünnung plattiert werden. Übertragen Sie jedes Fliegenhomogenat in die erste Reihe einer 96.Füllen Sie jede Vertiefung der verbleibenden Reihen mit einer Mehrkanalpipette mit 90 Mikrolitern PBS. Entnehmen Sie 10 Mikroliter aus der ersten Reihe mit Fliegenhomogenat und geben Sie das Homogenat in die zweite Reihe. Spritzen Sie es mindestens 10 Mal auf und ab, um das Homogenat gründlich zu vermischen.Nehmen Sie dann 10 Mikroliter des Homogenats und übertragen Sie es in die nächste Reihe. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit den verbleibenden Reihen, beginnend mit der unteren Reihe. Verwenden Sie die Mehrkanalpipette, um 10 Mikroliter aus jeder Vertiefung zu entnehmen und auf einer LB-Platte abzugeben.Stellen Sie sicher, dass die Proben als diskrete Spots ausgegeben werden, die sich nicht berühren. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Vertiefungen aus jeder Reihe beprobt wurden, und geben Sie sie in absteigender Reihenfolge der Verdünnung auf die LB-Platte. Unabhängig davon, welche Beschichtungsmethode verwendet wird, achten Sie darauf, dass die Platten nicht überwachsen, damit die Kolonien klein und diskret bleiben.Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator. Sobald die experimentellen Bakterien sichtbare Kolonien gebildet haben, aber vor den Kolonien der Drosophila, wird die Darmmikrobiota etwa 24 Stunden später für Spiralplatten sichtbar. Zählen Sie die wachsenden Kolonien mit einem automatischen Koloniezähler, der die Bakterienlast pro Milliliter Homogenat basierend auf der Anzahl und Position der Kolonien auf der Platte schätzen kann.Bei Spotplatten werden die Kolonien für jede Fliege manuell gezählt, je nachdem, welche Verdünnung 30 bis 300 Kolonien enthält, und die Anzahl der Bakterien pro Milliliter des ursprünglichen Homogenats berechnet. Den Fliegen wurden 50 Nanoliter Bakteriensuspensionen injiziert, die einen Bereich von optischen Dichten abdeckten, und die sofort homogenisierte und plattierte Infektionsdosis variierte mit der optischen Dichte der für die Injektion verwendeten Bakteriensuspension. Die anfängliche bakterielle Belastung korreliert stark mit der anfänglich injizierten OD.Dieses Protokoll ermöglicht die Beobachtung verschiedener Arten von Infektionen. Die Fliegen wurden mit Providencia rei infiziert, die eine chronische subletale Infektion verursachen kann, die 20 Tage oder länger anhält. Fliegen, die mit Coli infiziert sind, beseitigen die Infektion innerhalb von sechs Stunden. Nach der Infektion.Die Induktion des Immunsystems kann analog durch RNA-Isolierung und anschließende Q rtpcr R des antibakteriellen Peptidtranskripts abgeschätzt werden, weniger quantitativ jedoch bei Fliegen, die GFP unter der Kontrolle des antimikrobiellen Peptids exprimieren. Genpromotoren können verwendet werden, um die Induktion des Immunsystems zu visualisieren: Einmal gemeistert. Diese Technik kann die Infektion von Hunderten von Fliegen pro Stunde ermöglichen.Es ist denkbar, dass eine beliebige Anzahl von Phänotypen bei den Fliegen gemessen werden kann, nachdem sie infiziert wurden, einschließlich der Fähigkeit zum Lernen von Mitleid, des Stoffwechselstatus oder praktisch jedes andere Merkmal, das man sich vorstellen kann. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie robuste und wiederholbare bakterielle Infektionen an Drosophila und Melanogaster abgeben und wie Sie anschließend den Schweregrad der Infektion messen und die Immunantwort des Wirts quantifizieren können. Vergessen Sie nicht, dass bestimmte Bakterien Risiken für die menschliche Gesundheit darstellen können.Stellen Sie sicher, dass die richtigen Biosicherheitsverfahren befolgt werden und dass angemessene Eindämmungsmaßnahmen getroffen werden, um zu verhindern, dass infizierte Fliegen entkommen. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Eine Einführung in die parasitischen Wespen<em&gt; Drosophila</em&gt; Und die antiparasitäre Immune Response

Um eine Verbindung zwischen der Immunantwort und Verhalten zu verstehen, beschreiben wir eine Methode, um Bewegungs-Verhalten zu...

Quantitative Messung der Immunantwort und Sleep in<em&gt; Drosophila</em

Dieses Video zeigt die Nanoinjektion von Bakteriensuspension in die Körperhöhle der Fliege, was zu einer bakteriellen Vermehrung und Infektion führt. Die Immunantwort der Fliege beseitigt einige Bakterien, während andere der Immunclearion entgehen und im Wirt überleben und eine Infektion verursachen.

Infizieren von Fliegen mit Bakteriensuspension unter Verwendung eines Nanoinjektors

Dieses Video zeigt eine Technik, um Drosophila zu infizieren, indem ein pathogenes Bakterium direkt in ihre Körperhöhle eingeführt wird. Diese Methode umgeht Epithelbarrieren und andere passive Abwehrmechanismen und ermöglicht die Induktion einer systemischen Infektion. Nach der Infektion wird die resultierende Immunantwort durch Überwachung der Fliegensterblichkeit und Durchführung nachgeschalteter Assays bewertet.

Eine septische Nadelstichtechnik, um systemische bakterielle Infektionen bei Fliegen einzuführen

In diesem Video demonstrieren wir eine Technik zur Messung der bakteriellen Belastung von E. coli nach der Injektion von E. coli in den Thorax von Drosophila melanogaster.

Messung der bakteriellen Belastung von E. coli in Drosophila melanogaster nach einer E. coli-Infektion

Verfahren zur Aufzucht von Drosophila melanogaster unter axenic und gnotobiotischer Bedingungen vorgestellt. Fly Embryonen werden in Natriumhypochlorit, aseptisch in sterile Ernährung dechorionated und aufgezogen in geschlossenen Behältern. Impfen Ernährung und Embryonen mit Bakterien führt zu gnotobiotischer Verbänden und bakterielle Präsenz wird durch Plattierung Ganzkörper- Drosophila Homogenate bestätigt.

Aufzucht der Fruit Fly<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Unter Axenic und gnotobiotische Bedingungen

Diese Methode zeigt, wie Erreger Invasion in Insektenzellen mit dreidimensionalen (3D) Modellen zu visualisieren. Hemocytes von Drosophila Larven infiziert wurden mit viralen oder bakteriellen Erregern, Ex Vivo oder in Vivo. Infizierte Hemocytes wurden dann fixiert und für die Bildgebung mit einem confocal Mikroskop und anschließende zelluläre 3D-Rekonstruktion befleckt.

Extraktion von Hemocytes aus Drosophila Melanogaster Larven für mikrobielle Infektionen und Analyse

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Oral verfügbar zu machen und die Fruchtfliege Drosophila MelanogasteR mit bakteriellen Krankheitserregern zu infizieren und die Anzahl der infektiöse Bakterien Schuppen nach Darm-Infektion zu messen. Wir beschreiben weiter die Wirkung des Immunsystems Mutanten auf Fliege Überleben nach oraler bakterieller Infektion.

Mündliche bakterielle Infektion und Shedding in Drosophila melanogaster

Dieses Protokoll beschreibt einen in-vivo Phagozytose Assay in Erwachsenen Drosophila Melanogaster , Phagozyten Anerkennung und Räumung von mikrobiellen Infektionen zu quantifizieren.

Beurteilung der zellulären Immunantwort der Fruchtfliege Drosophila Melanogaster, mit einem In-Vivo-Phagozytose-Assay

Dieses Protokoll beschreibt einen In-vivo-Test der Phagozytose zur Beurteilung und Quantifizierung der Fähigkeit junger und alter Drosophila melanogaster Hämozyten an Phagozytosebakterien..

Beurteilung der altersspezifischen phagozytischen Fähigkeit von adulten Drosophila melanogaster Hämozyten mit einem In Vivo Phagozytose-Assay

Drosophila melanogaster erwachsene Fliegen wurden ausgiebig als Modellorganismen verwendet, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die antimikrobiellen angeborenen Immunantworten des Wirts und mikrobiellen Infektionsstrategien zugrunde liegen. Um das Larvenstadium von D. melanogaster als zusätzliches oder alternatives Modellsystem zu fördern, wird eine Larveninjektionstechnik beschrieben.

Drosophila melanogaster Larven-Injektionsprotokoll

Lernen Sie die Methode zur bakteriellen Infektion von Drosophila melanogaster mittels Nano-Injektor und deren Immunantwort-Quantifizierung. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung angeborener Immunität.

Systemische bakterielle Infektion und Immunabwehr Phänotypen in

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