Getrocknete Blutflecken - Vorbereitung und Verarbeitung für den Einsatz in Immunoassays und Molekulare Techniken

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein standardisiertes Protokoll für die Aufbereitung und Verarbeitung von getrockneten Blutflecken bereitzustellen, die anschließend in Immunoassays und in molekularen Techniken verwendet werden können. Dazu wird zunächst Kapillarblut entnommen und auf eine Filterkarte übertragen. Der zweite Schritt besteht darin, Blutflecken über Nacht zu trocknen und sechs Millimeter große Stanzungen aus den Kreisen der Filterkarte zu gewinnen.

Anschließend wird das getrocknete Blut aus den Stempeln durch Eintauchen in Puffer auf einem Schüttler für mindestens vier Stunden erreicht. Die hämolytischen EITs werden dann durch Zentrifugation von Ablagerungen befreit. Der letzte Schritt besteht darin, die freigegebenen EITs auf serologische und molekulare Marker für Infektionen mit den Hepatitis B-, Hepatitis C- und humanen Immundefizienzviren mit kommerziell erhältlichen Immunoassays und molekularen Techniken zu analysieren.

Die Idee, Plots zu verwenden, die auf einer Filterkarte aus Zellular gesammelt wurden, entstand vor einem Jahrhundert. Dennoch haben Menschen, die diese Methode zum ersten Mal anwenden, auch heute noch oft Schwierigkeiten, da die gesamte präanalytische Phase, die die Aufbereitung und Verarbeitung von getrockneten Blutflecken für ihre abschließende Analyse umfasst, nicht für fast alle Anwendungen der Trockenblutfleckenuntersuchung standardisiert ist. Vor diesem Hintergrund schlagen wir ein umfassendes, standardisiertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Aufbereitung und Verarbeitung von getrockneten Blutflecken vor, das anschließend in Immunassays und molekularen Techniken verwendet werden soll.

visuelle Demonstration dieser Methode scheint von entscheidender Bedeutung zu sein, da mehrere Schritte wie die Entnahme von Kapillarblut erforderlich sind. Das ist richtig. Die Übertragung auf die Filterkarten oder die Vorbereitung geeigneter Schläge aus der Menge sind nicht leicht zu erlernen, und folglich werden Personen, die die Technik zum ersten Mal anwenden, zweifellos von der visuellen Darstellung profitieren.

Nicos Finger wird von einem Techniker aus unserem Labor Kapillarblut entnommen, um das Verfahren der Verarbeitung zu demonstrieren. Die gewonnenen Blutflecken werden von Techniker ko, der bereits seit vielen Jahren in unserem Labor für molekularbiologische Diagnostik arbeitet, zur Hautpunktion geführt. Ziehen Sie zuerst ein Paar Einweg-Latex-Gummihandschuhe an.

Vor der Hautpunktion sollte der Patient seine Hände wärmen. Der Finger wird stark massiert, um den Blutfluss zur oberen Einstichstelle zu bereichern. Reinigen Sie dann die Haut der Palmer-Seite der Spitze, die distale Phalanx des dritten oder vierten Fingers der nicht schreibenden Hand mit einem geeigneten Desinfektionsmittel, punktieren Sie die Haut mit einer Einweg-Sicherheitslanzette.

Die Finger sollten in einer solchen Position gehalten werden, dass die Schwerkraft die Ansammlung von Blut an der Fingerkuppe erleichtert. Wischen Sie den ersten Tropfen Blut mit einem Mullkissen ab, da es überschüssige Gewebeflüssigkeiten enthalten kann. Nachdem Sie den Finger erneut massiert haben, um die Durchblutung an der Einstichstelle zu erhöhen, übertragen Sie den folgenden Tropfen auf einen der Kreise einer Filterkarte, ohne die Oberfläche direkt mit der Fingerspitze zu berühren.

Lassen Sie den nächsten großen Tropfen Kapillarblut an der Fingerkuppe bilden und sammeln Sie ihn im nächsten Kreis. Setzen Sie diesen Vorgang fort, bis alle notwendigen Kreise gefüllt sind oder der Blutfluss während der Entnahme stoppt. Lassen Sie das Blut nur durch Kapillarkräfte in die Textur des Filters einweichen.

Drücken oder melken Sie den Finger nicht übermäßig, wenn der Blutfluss nicht ausreicht, um alle erforderlichen Kreise der Filterkarte zu füllen. Wenn der Blutfluss stoppt, legen Sie einen Verband auf die Fingerkuppe, führen Sie eine zweite Hautpunktion an einem anderen Finger durch, wenn für die Untersuchung mehr Blut benötigt wird, um die Blutflecken zu trocknen, legen Sie die Filterkarten auf ein sauberes Papiertuch in eine Biohazard-Sicherheitswerkbank und lassen Sie sie trocknen, am besten über Nacht bei Raumtemperatur. In Ermangelung einer externen Wärmequelle haben die Blutflecken nach Abschluss des Trocknungsprozesses eine gleichmäßig dunkelbraune Farbe und es sind keine roten Bereiche mehr für die Lagerung sichtbar.

Legen Sie die Filterpapierkarte in einen gasundurchlässigen Reißverschlussbeutel mit einem bis zwei Trockenmittelbeuteln, um die Proben vor Feuchtigkeit zu schützen. Füllen Sie diesen Beutel so schnell wie möglich in einen Gefrierschrank mit einer Temperatur von minus 20 Grad Celsius oder darunter. Stehen unter Feldbedingungen keine Gefrierschränke zur Verfügung, ist eine Lagerung bei minus vier Grad Celsius oder sogar bei Umgebungstemperatur bis zu 14 Tage möglich.

Stanzen Sie einen Punkt mit einem Sechs-Millimeter-Gerät für den einmaligen Gebrauch aus jedem blutgetränkten Kreis der Filterkarte Grad 9 0 3 aus, alle getrockneten Blutflecken von einem einzelnen Patienten in eine Vertiefung der 12. Füllen Sie die Vertiefung mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 0,05 % Tween 20 und 0,08 % Natriumazid enthält. Wiederholen Sie diese Schritte, um eine zweite Serie von EITs von getrockneten Blutflecken zu erhalten, um molekulare Analysen durchzuführen.

Legen Sie dann die Zellkulturplatte auf einen Laborschüttler und lassen Sie die getrockneten Blutflecken mindestens vier Stunden oder am besten über Nacht sanft eluieren. Am nächsten Tag sind die Flecken fast blutfrei und es haben sich hämolytische Überstände gebildet. Übertragen Sie diese EITs in Mikrozentrifugenröhrchen und unterziehen Sie sie dann zwei Minuten lang bei 10.500 G einer Zentrifugation, um sie freizugeben.

Die Überstände von Ablagerungen, die sich während der Ellucian-Zentrifugen-EITs gebildet haben, können nun für die beabsichtigten Analysen verwendet werden. Die erste Serie von EIT wird für die serologische Untersuchung in Becher übertragen. Die zweite Serie wird für die PCR-Analyse in Mikroröhrchen überführt.

Untersuchen Sie die EITs auf Marker für Hepatitis-B-Viren, Hepatitis-C-Viren und HIV-Infektionen mit kommerziell erhältlichen Assays und befolgen Sie die Anweisungen des jeweiligen Herstellers sorgfältig. Abschließend werden die Ergebnisse der serologischen Untersuchung auf dem vollautomatischen Analysegerät auf dem Bildschirm des Systems angezeigt. Die Wirksamkeit des für die Vorbereitung und Verarbeitung von getrockneten Blutflecken vorgeschlagenen Protokolls wurde zunächst durch die Analyse von 1.762 gekoppelten Serum-Trockenblutfleckenpaaren in Bezug auf die Bestimmung des Oberflächenantigens des Hepatitis-B-Virus bewertet.

Das Assay-Protokoll wurde modifiziert, da mit einem Cutoff-Wert von 0,05 internationalen Einheiten pro Milliliter 56,2 % der EITs im Vergleich zu den Ergebnissen von Sarah reaktiv waren. Dies entsprach einer Falsch-Positiv-Rate von 14,7 % bei Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigen-Tests. Die Analyse der Daten ergab, dass eine Erhöhung des Schwellenwerts auf 0,15 internationale Einheiten pro Milliliter zu einer idealen Trennung von positiven Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigenen von negativen Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigenen führen würde, wenn Serum-Trockenblutfleckenpaare auf das Vorhandensein von Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigen untersucht werden. Es wurden nur zwei Diskrepanzen festgestellt.

Die beiden falsch negativen Sarah stammten von Patienten, die eine antivirale Behandlung erhielten. Die qualitative Bestimmung von H-B-V-D-N-A mittels real-time PCR aus Vollblut-EITs ergab eine Sensitivität von 93%Somit wurden sieben Proben mit niedrigen Serum-H-B-V-D-N-A-Konzentrationen nicht nachgewiesen. Es wurden nur vier falsch negative Anti-HCV-Ergebnisse aus EITs aus getrockneten Blutflecken bestimmt.

Die jeweiligen C wurden sehr wahrscheinlich von Patienten entnommen, deren Infektionen längst abgeklungen waren. Die analytische Sensitivität von 100 % für H-C-V-R-N-A-Bestimmungen aus EITs aus getrockneten Blutflecken wies auf die hervorragende Sensitivität des isothermen Transkriptions-vermittelten Amplifikationsansatzes hin, der für die H-C-V-R-N-A-Amplifikation verwendet wurde. Der Nachweis von Anti-HIV-Antikörpern in getrockneten Blutflecken mit einem vollautomatischen System führte ebenfalls zu einer analytischen Sensitivität von 100%Dieses Video zeigt, dass es heutzutage möglich ist, serologische und molekulare Marker von Hepatitis B-, Hepatitis C- und HIV-Infektionen in allen engen Blutflecken zuverlässig nachzuweisen, selbst wenn ein vergleichsweise hohes Elutionsvolumen verwendet wird und Modifikationen der für Serum- oder Plasmauntersuchungen etablierten Essayprotokolle erforderlich sind. nicht wesentlich verändert.

Die mitgeteilten Ergebnisse bestätigten jedoch auch die inhärenten Grenzen der Technik der getrockneten Blutflecken. In einigen Fällen. Das skizzierte Protokoll wurde auch unter Feldbedingungen an 534 aktiven Drogenkonsumenten in den deutschen Städten Berlin und Essen während der Pilotphase der Studie Medikamente und chronische Infektionskrankheiten getestet.

Die erzielten Ergebnisse führten zu einer geringfügigen Modifikation des Testalgorithmus für die Hauptphase der Wirkstoffstudie in sechs weiteren deutschen Großstädten.