Name: Ableitung von Highly Purified Kardiomyozyten aus Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit Small Molecule modulierte Differenzierung und anschließende Glucose Starvation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Lernen Sie die Ableitung hochreiner Kardiomyozyten aus humanen iPS-Zellen durch Small-Molecule-modulierte Differenzierung und Glukose-Deprivation. Diese Methode ermöglicht präzise Modellierung kardiovaskulärer Erkrankungen.

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Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch das NIH/NHBI (U01 HL099776-5), den NIH Director's New Innovator Award (DP2 OD004411-2), das California Institute of Regenerative Medicine (RB3-05129), die American Heart Association (14GRNT18630016) und den Endowed Faculty Scholar Award der Lucile Packard Foundation for Children und des Child Health Research Institute in Stanford (an SMW). Wir danken auch für die finanzielle Unterstützung durch das American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000 und das National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).

HINWEIS: Lieferanteninformationen für alle in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien ist in Tabelle 1 aufgeführt und Materialliste. Alle Lösungen und Geräte in Kontakt mit Zellen, müssen steril sein, und aseptisches Verfahren entsprechend verwendet werden. Führen alle Kultur Inkubationen in einer befeuchteten 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator, sofern nicht anders angegeben. In diesem Protokoll werden alle Unterscheidungen in 6-Well-Platten durchgeführt, bei dem die hiPSCs ausgesät. Nach Differenzierung und Reinigung können Zellen dissoziiert und zur späteren Verwendung erneut plattiert werden. 1. Mittelvorbereitung <ol><li> Für die E8 Medium, stellen eine Stammlösung für jedes Medium Komponente (NaHCO 3, L-Ascorbinsäure-2-phosphat, Natrium-Selenit, Transferrin, Insulin, FGF2, TGFB1) und die Lösungen bei -20 ° C lagern. Fügen Sie entsprechende Menge an Stammlösungen in die Flasche DMEM / F12 und filtern, um zu sterilisieren. Die Lösung Konzentration und Reaktionsansatz für die Aktienkomponenten und E8 Medium kann in Tabelle 1 zu finden. </li><li> Für die extrazelluläre Matrix-Lösung, auftauen Basalmembranmatrix (allgemein bei 10 mg / ml enthalten) bei 4 ° CO / N. Matrigel ist allgemein für pluripotente Stammzellkultur verwendet werden, weil die menschliche pluripotente Stammzellen können auch auf dieses Material unter Verwendung des alpha-6-beta-1 Integrin 9 haften. Einmal aufgetaut, machen 2,25 mg (250 ul) Aliquots auf Eis mit eiskaltem Pipettenspitzen und Schläuche und die Aliquots bei -80 ° C. <ol><li> Wenn Vorbeschichtung Platten mit ECMS, auftauen und aliquotieren die extrazelluläre Matrix-Lösung (ECMS) auf Eis. Mischen Sie das ECMS und eiskalten DMEM / F12-Medium in einem Verhältnis von 1: 200 auf Eis. Keep cool, um vorzeitige ECMS Erstarrung zu verhindern. </li></ol></li><li> Für die RPMI / B27 ohne Insulin Medium, 10 ml B27 Minus Insulin in 500 ml RPMI-Medium. </li><li> Für die RPMI / B27 (mit Insulin) Medium, 10 ml B27 Supplement (mit insulin) und 5 ml Pen-Strep-Antibiotikum in 500 ml RPMI-Medium. </li><li> Für den niedrigen Glucose-Medium, 10 ml B27 Supplement und 5 ml Pen-Strep Antibiotikum in 500 ml Glukose-freiem RPMI-Medien. </li><li> Das Einfrieren / Kryokonservierungsmedium mischen fötalem Rinderserum mit Dimethylsulfoxid (DMSO) in einem Verhältnis 9: 1. Das Einfriermedium kann bis zu 1 Monat bei 4 ° C gelagert werden. Hinweis: alle Medien sollten gefiltert und gespeichert werden in 4 ° C und innerhalb von 2 Wochen verwendet werden, wenn nicht anders angegeben. Alle Reagenz / Lösungsvolumina unter Verwendung eines einzigen gut in einer 6-Well-Platte bestimmt, sofern nicht anders angegeben. </li></ol> 2. Pre-Beschichtung 6-Well-Platten mit ECMS <ol><li> Make ECMS durch Mischen Basalmembranmatrix (zB Matrigel) mit eiskaltem DMEM / F12-Medium in einem Verhältnis von 1: 200, dann gelten 2 ml frisch hergestellter ECMS in jede Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen. Jedes der gut in einer 6-Well-Platte wird ca. 90 mg ECMS erhalten. </li><li> Inkubieren Sie die ECMS-beschichteten Platten für 1 h bei 37 ° C. Unmittelbar vor dem Beschichten Zellen, absaugen DMEM / F12-Lösung aus jeder Vertiefung. Die Platten werden dann bereit sind, Zellen zu empfangen. </li></ol> 3. Auftauen der Tiefkühl hiPSCs HINWEIS: Eng an diese Vorgehensweise, wie sie können, um eine optimale Kultivierung und Differenzierung von nachgeschalteten hiPSCs in hiPSC-CMs nach dem Frost / Tau-Zyklus führen. <ol><li> Tauwetter ein Fläschchen hiPSCs für jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Vorbereiten einer 15 ml konischen Röhrchen mit 9 ml kaltem E8 Medium mit ROCK-Inhibitor (10 &amp; mgr; M) für jedes Fläschchen. ROCK-Hemmer verbessert hiPSCs Überlebensrate nach Kryokonservierung 10. Die Durchstechflaschen im 37 ° C Wasserbad, um die Zellen, bis eine ca. 5 mm Durchmesser Eis Kristall überlassen auftauen. </li><li> Besprühen Sie die Außenseite der Fläschchen mit 70% Ethanol. Wischen Sie die Fläschchen mit Seidenpapier, bevor er sie an den sterilen laminaren Haube. </li><li> Übertragen Sie die Zellen, in die vorbereitete konischen Rohr. Spülen ter einmal mit 500 ul E8 Medium Fläschchen und übertragen Sie das Medium, das die aufgetauten Zellen auf den gleichen konischen Rohr. Zentrifuge bei RT für 4 min bei 200 x g. </li><li> Saugen Sie den Überstand nach der Zentrifugation und sanft Zellpellet mit 2 ml Medium mit E8 ROCK-Inhibitor (10 uM). Übertragen Sie die resuspendierten Zellen auf eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit ECMS vorbeschichtet. </li><li> Ersetzen Sie das Medium mit E8 Medium ohne ROCK-Hemmer nach 24 Stunden der Kultivierung. Die Zellen sollten bis zu diesem Zeitpunkt eingehalten haben. </li></ol> 4. Passagieren von hiPSCs <ol><li> Typischerweise Gang hiPSCs nach Erreichen 75% bis 80% Konfluenz in einer 6-Well-Platte. Saugen Sie das Kulturmedium. Waschen schnell Vertiefungen mit 1 ml sterilem, RT PBS. Absaugen PBS. <ol><li> Fügen Sie 500 ul 0,5 mM EDTA oder 1x Zellablösung Lösung (zB Accutase) und Inkubation für 1-7 min bei RT. Gegebener Zeit für EDTA Inkubation variiert mit der hiPSC Linie. Erwarten Sie, um zu sehen Curling o sehenr Verdickung Kolonien an den Rändern, da dieses anzeigt, daß EDTA oder Zellentfernungslösung bereit, entfernt werden. </li></ol></li><li> Saugen Sie das EDTA oder die Zellablösung Lösung. 1 ml der E8-Medium mit 10 &amp; mgr; ROCK-Hemmer ergänzt. Verdrängen hiPSC Kolonien in der auch durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren und Spritz Kolonien mit einem P1000 Pipette. Kolonien sollte in 5-10 Zellklumpen nach Abschluss gebrochen werden. </li><li> Übertragen Sie die Kolonien, die in 1 ml Medium mit E8 ROCK-Inhibitor in einen 15 ml konischen Röhrchen suspendiert sind. </li><li> Stören die große Zellklumpen in kleine Klumpen in der E8 Medium. Fügen Sie einen entsprechenden Volumen von E8 Medien mit Inhibitor der Zellsuspension, um die Zellen zu verdünnen. Das Medienvolumen, um die Verdünnung hinzuzufügen, hängt von der Zelldichte und die Zahl der Brunnen ausgesät werden. Im Idealfall sollte eine einzige, 80% konfluent auch von hiPSCs 01.12 verdünnt werden. <ol><li> Fügen Sie 11 ml Medium mit E8 ROCK-Hemmer zu den bestehenden 1 ml cell-Lösung in den oben erwähnten 15 ml konischen Röhrchen, um eine Verdünnung zu erhalten 01.12. </li></ol></li><li> Weitere verreiben die Zellklumpen in kleine Zellfragmente (etwa 50 bis 200 Zellen in jedem Fragment am besten). Vermeiden Sie zu Verreiben da dadurch das Überleben der Zelle. </li><li> Saugen Sie ECMS von den Pre-beschichteten Platten und 2 ml resuspendierten Zellen in jede Vertiefung. Etwa 100.000 Zellen pro Vertiefung einer 6-Well-Platte ist ideal. Ziel ist es, die Zellen gleichmäßig um den gut verzichten zu Clusterbildung von Zellen, die in der Mitte der Vertiefung zu vermeiden. </li><li> Nach 24 Stunden der Kultivierung, ersetzen Sie das Medium mit E8 Medium ohne ROCK-Hemmer. Ändern Sie das Kulturmedium alle 24 Stunden, bis die Zellen zu 80% konfluent. Dann werden die Zellen wieder bereit, Durchgang. Es dauert normalerweise 3-6 Tage zwischen den Kanälen zu 80% konfluent. </li></ol> 5. Einfrieren hiPSCs HINWEIS: Eng an diese Vorgehensweise, wie sie können, um eine optimale Kultivierung und Differenzierung von nachgeschalteten Hüfte führenSCs in hiPSC-CMs nach dem Frost / Tau-Zyklus. <ol><li> Beschriften Sie Kryoröhrchen mit der Zelllinie Name, Zelltyp, Durchgang Nummer und Einfrieren Tag. Als allgemeine Richtlinie, verwenden Sie eine Flasche für jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Vorbereiten einer 15 ml konischen Röhrchen mit 9 ml E8 Medium mit ROCK-Inhibitor (10 &amp; mgr; M) befüllt. Bereiten Gefriermedium mit 90% FBS und 10% DMSO, und halten Sie das Medium bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Saugen Sie das Kulturmedien, 500 ul 0,5 mM EDTA oder 1x Zellablösung Lösung und Inkubation für 2-7 min bei RT. Die Dauer der EDTA oder Zellentfernungslösung Belichtung variiert von Zelllinie zu Zelllinie. </li><li> Saugen Sie EDTA oder Zellablösung Lösung. 1 ml der E8 Medium. </li><li> Verdrängen hiPSC Kolonien in der gut durch Auf-und Abpipettieren und Spritz Kolonien mit einem P1000 Pipette. Kolonien sollten nicht in weniger als 100 Zellklumpen zerlegt werden. Übertragen Sie die suspendierten Zellen auf die vorbereitete konische Röhrchen mit E8. Zentrifuge bei RT für 4 min bei 200 x g. </li><li> Saugen Sie den Überstand und fügen Sie 500 ul kaltem Einfriermedium zu dem Pellet. Das Pellet pipettiert ein- bis zweimal. Das Überleben der Zellen ist, indem sie Zellen in großen Klumpen verbessert. </li><li> Übertragen Sie die resuspendierten Zellen in ein beschriftetes kryogenen Rohr. Bewegen sich schnell die Fläschchen in einen Gefrierbehälter, Isopropanol, die allmähliche Abkühlung ermöglicht. Das Behältnis mit Zellen bei -80 ° C für 24 Stunden, dann übertragen die Zellen in flüssigen Stickstoff für die langfristige Lagerung. </li></ol> 6. Herz Differenzierung von humanen iPS HINWEIS: Alle Medien sollten mindestens bei Raumtemperatur, wenn hinzugefügt. <ol><li> Nach Dissoziation mit EDTA oder 1x Zellablösung Lösung, Samen rund 100.000 menschlichen iPS-Zellen auf ECMS beschichtete 6-Well-Kulturplatten zur Differenzierung (dieselben Schritte wie Zell Passagieren Verfahren). Wenn die Zellen bis 85% Konfluenz, ändern Sie die mittel- bis RPMI / B27 ohne Insulin-Medium mit 6uM GSK3-beta-Hemmer CHIR99021 (CHIR) und halten für 48 Stunden. </li><li> Nach 48 Stunden, ersetzen Sie den CHIR haltigen Kulturmedium mit RPMI / B27 ohne Insulin Medium und in Ruhe zu lassen für 24 Stunden (bis zum Tag 3). </li><li> Am Tag 3, ändern Sie die Medien, um RPMI / B27 ohne Insulin mit 5 uM Wnt-Inhibitor IWR1 und halten für 48 Stunden (bis zum Tag 5). HINWEIS: Wnt Hemmung kann auch unter Verwendung anderer Verbindungen mit kleinen Molekülen versucht werden, wie in früheren Studien 11 beschrieben. IWR1 wurde über andere kleine Molekül Wnt Inhibitoren wegen der erhöhten Bereich, in dem es sich gezeigt hat, bei der Hemmung der Wnt signal 11 werden ausgewählt. </li><li> Am Tag 5, ändern Sie das Medium wieder in RPMI / B27 ohne Insulin Medium und lassen für 48 Stunden (bis zum Tag 7). </li><li> Am Tag 7, ersetzen Sie das Medium mit RPMI / B27 Medium (mit Insulin) und ersetzen Medium alle 3 Tage danach mit dem gleichen Medium. Spontane Schlagen Kardiomyozyten zunächst sichtbar bei ca. 8. Tag zu Tag10. </li></ol> 7. Reinigung von humanen Kardiomyozyten durch Glucose Starvation <ol><li> Am Tag 10 nach der Differenzierung, ändern Sie das Medium in jeder Vertiefung der Platte mit 6 Vertiefungen bis 2 ml niedrigen Glucose-Medium und Aufrechterhaltung der Zellen in diesem Medium für 3 Tage (bis zum Tag 13). </li><li> Am Tag 13, zurück Zellen RPMI / B27 Medium (mit Insulin). </li><li> Optional Ausstrich Kardiomyozyten vor der zweiten Runde der Glukose Hunger zu helfen, lösen nicht-Kardiomyozyten von der Kulturplatte, die ein einfacheres, Dissoziation von nicht-Kardiomyozyten während Glukose Hunger. <ol><li> Am Tag 13, absaugen Medium einmal mit PBS waschen und distanzieren die Zellen in einzelne Zellen unter Verwendung von 500 ul Zell Disassoziierung Enzyms für 5 min bei 37 ° C. Insbesondere wird nach 5 min der Enzymbehandlung, mit einem 1000 ul-Pipette Kardiomyozyten aus der 6-Well-Platte manuell dissoziieren durch wiederholtes Ziehen des Zell Disassoziierung Enzym und Sprühen gegen die cardiomyocyte Monolage. Bis zu 30 Pipettieren Wiederholungen erforderlich sein, um die Herzmuskelzellen in einzelne Zellen distanzieren werden. </li><li> Nachdem die Zellen dissoziiert und in Einzelzellform, sammeln sämtliche Zellen in einer 15 ml konischen Röhrchen mit 5 ml RPMI / B27 Medium mit Insulin gefüllt, um für 4 min bei 200 x g verdünnt das Zell Disassoziierung Enzym und zentrifugiert. Absaugen und den Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren der Zellen mit 2 ml RPMI / B27 Medium und der Platte auf einen neuen ECMS beschichteten 6-Well-Platte. Typischerweise höherer Konfluenz von Kardiomyozyten hilft bei der Zellüberleben bei Neubelegung. Ziel ist es, zwei Millionen Zellen pro neue 6-Well-Platte für optimale Überleben während Neubelegung Ausstrich. </li></ol></li><li> Am Tag 14, ändern Sie das Medium wieder in 2 ml niedrigen Glucose-Medium für eine zweite Glukoseentzug-Zyklus. Kultur die Zellen in diesem niedrigen Glukose Zustand für 3 Tage. Die meisten der nicht-Kardiomyozyten in diesem niedrigem Glucosekulturbedingungen sterben. </li><li> Am Tag 17, ändern Sie das Medium bis 2 ml RPMI / B27 Medium mit Insulin. Die verbleibenden Zellen werden hoch gereinigte Kardiomyozyten sein. Diese Kardiomyozyten zur Genexpressionsanalyse, Arzneimittel-Screening, metabolische Analyse und verschiedene andere Downstream-Assays verwendet werden. </li></ol>

<ol><li>Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiovascular+disease+modeling+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4 (6), 150(2013).</li>
<li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li>
<li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+optimization+of+activin%2Fnodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+for+coxsackievirus+B3-induced+myocarditis+and+antiviral+drug+screening+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform.</a> Circulation Research. 115 (6), 556-566 (2014).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li>
<li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (12), 127-137 (2013).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+self-renewal+of+human+pluripotent+stem+cells+on+human+recombinant+laminin-511%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 611-615 (2010).</li>
<li>Li, X., Meng, G., Krawetz, R., Liu, S., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ROCK+inhibitor+Y-27632+enhances+the+survival+rate+of+human+embryonic+stem+cells+following+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+And+Development%22%5BJournal%5D)">The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation.</a> Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%3A+the+matrix+sandwich+method%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method.</a> Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li>
<li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+de+novo+cardiomyocytes%3A+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Erhalten einer großen Menge von hochgereinigtem hiPSC abgeleitete Kardiomyozyten ist kritisch für die Grundherzforschung sowie klinische und translationale Anwendungen. Cardiac Differenzierungsprotokolle haben enorme Verbesserungen in den letzten Jahren, um Kleinmoleküle moduliert und Monolayer-basierte Methoden 5 unterzogen, den Übergang von Embryoidkörper-basierte Verfahren, die einen kardiogenen Wachstumsfaktoren 2, um Sandwichverfahren 12 Matrix und schließlich. Der vorstehend genann...

Primäre humane Kardiomyozyten sind aufgrund der Erfordernis invasiver Herzbiopsien, Schwierigkeiten bei der Dissoziation einzelner Zellen und wegen der schlechten langfristige Überleben der Zellen in Kultur schwierig zu erhalten. Angesichts dieses Mangels an primären humanen Kardiomyozyten, patientenspezifischen menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen (hiPSC-CM) Technologie als leistungsfähige Alternative Kardiomyozyten Quelle für die Grundlagenforschung als auch klinische und translationale Anwendungen wie Krankheit Modellierung und Droge angesehen Entdeckung ein. Frühe Bemühungen bei der Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu Herzmuskelzellen verwendet Differenzierungsprotokollen mit Embryoidkörper (EB), aber dieses Verfahren ist nicht effizient bei der Herstellung von Herzmuskelzellen, da oft weniger als 25% der Zellen in einem EB schlagen Kardiomyozyten 2,3. Vergleichsweise, eine Monobasis Differenzierungsprotokoll unter Verwendung der Zytokine Aktivin A und BMP4 angezeigt einen höheren Wirkungsgrad als EBs, aberDieses Protokoll ist immer noch relativ ineffizient und erfordert eine teure Wachstumsfaktoren und funktioniert nur in einer begrenzten Anzahl von menschlichen pluripotenten Stammzelllinien 4. Vor kurzem wurde eine hocheffiziente, hiPSC Monolayer-basierte Kardiomyozytendifferenzierung Protokoll durch Modulation Wnt / β-Catenin-Signalweg 5 entwickelt. Diese hiPSC-CMs auszudrücken Troponin T und Alpha Actinin, zwei sarkomerischen Proteine, die Standard-Marker von Herzmuskelzellen 6. Das Protokoll beschreibt hier ist eine Anpassung dieser niedermolekulare, Feeder zellfreie, Mono Differenzierung Verfahren 5,7. Wir sind in der Lage zu schlagen Kardiomyozyten aus hiPSCs nach 7-10 Tagen (Abbildung 1) zu erhalten. Jedoch nach einer Kardiomyozytendifferenzierung einer 50% schlagen Zellen, Immunfärbung zeigt einheitlich das Vorliegen einer Population von Nicht-Herzmuskelzellen, die negativ für Kardiomyozyten-spezifische Marker wie Herz-spezifisches Troponin T und alpha-Actinin sind. Um fueitere reinigen Kardiomyozyten und die Beseitigung nicht-Kardiomyozyten wurden heterogene differenzierten Zellpopulationen unterzogen, um Hunger, indem sie mit einem extrem niedrigen Glukosekulturmedium für mehrere Tage (Abbildung 2) Glukose. Diese Behandlung selektiv eliminiert nicht Kardiomyozyten aufgrund der Fähigkeit von Kardiomyozyten, aber nicht nicht-Kardiomyozyten, Lactat als Primärenergiequelle, um in einer niedrigen Glucoseumgebung 8 überleben metabolisieren. Nach diesem Reinigungsschritt wird eine 40% ige Zunahme im Verhältnis von Kardiomyozyten nicht Kardiomyozyten beobachtet (Figur 3, Figur 4) und der nachgeschalteten Genexpressionsanalyse, Krankheitsmodelle und Wirkstoff-Screening-Assays können diese Zellen verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>Matrigel (9-12 mg/ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-Medien</td><td>Invitrogen</td><td>11835055</td><td></td></tr><tr><td>Glukosefreie RPMI-Medien</td><td>Invitrogen</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>B27 Minus Insulin</td><td>Invitrogen</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement (mit Insulin)</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Streptokokken-Antibiotikum</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>BenchMark</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>ROCK-Inhibitor Y-27632</td><td>EMD Millipore</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Thermo Fisher</td><td>508306</td><td></td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Sigma</td><td>I0161</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Zellheber</td><td>Fisher</td><td>08-100-240</td><td></td></tr><tr><td>Kryofläschchen</td><td>Fisher (NUNC Röhrchen)</td><td>375418</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzym</td><td>Invitrogen</td><td>12563-011</td><td></td></tr></tbody></table>

ableitung von highly purified kardiomyozyten aus menschen induzierten pluripotenten stammzellen mit small molecule modulierte differenzierung und anschließende glucose starvation

Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen (hiPSC-CMs) sind zu einem wichtigen Zellquelle, um den Mangel an primären Kardiomyozyten für die Grundlagenforschung und translationale Anwendungen anzugehen. Um hiPSCs in Kardiomyozyten zu differenzieren, wurden verschiedene Protokolle wie Embryoidkörper (EB) -basierte Differenzierung und Wachstumsfaktor Induktion entwickelt. Jedoch sind diese Protokolle ineffizient und sehr variabel in ihrer Fähigkeit gereinigt Kardiomyozyten erzeugen. Kürzlich wurde ein kleines Molekül-basierte Protokoll Verwendung Modulation Wnt / β-Catenin-Signalisierung wurde dargestellt, um die Herzdifferenzierung mit hohem Wirkungsgrad zu fördern. Bei diesem Protokoll, größer als 50% -60% der differenzierten Zellen Troponin-positiven Kardiomyozyten wurden konsequent beobachtet. Um Kardiomyozyten Reinheit weiter zu erhöhen, wurden die differenzierten Zellen unterzogen, um Hunger Glukose gezielt beseitigen Nicht-Kardiomyozyten auf der Grundlage der Stoffwechselunterschieds zwischen Kardiomyozyten und nicht-Kardiomyozyten. Unter Verwendung dieses Selektionsstrategie, die wir durchgängig erhalten eine Erhöhung des Verhältnisses der Herzmuskelzellen nicht-Kardiomyozyten größer als 30% in einer Population differenzierter Zellen. Diese hochgereinigtes Kardiomyozyten sollte die Zuverlässigkeit der Ergebnisse von In-vitro-Krankheit Modellstudien und Wirkstoff-Screeningtests menschlichen iPS-basierten verbessern.

Die morphologischen Veränderungen während hiPSC Differenzierung. Die hiPSC in Feeder-freien Platten kultiviert wuchs als flache, zweidimensionale Kolonien. Bei Erreichen etwa 85% Konfluenz wurden hiPSCs mit 6 uM CHIR zur ​​Differenzierung (1A) behandelt. Erhebliche Mengen von Zelltod, eine normale und weit verbreitetes Phänomen, wurden nach 24 Stunden von CHIR Behandlung beobachtet. Nach zwei Tagen CHIR Behandlung die hiPSCs weiter in Richtung eines mesoderm...

Hier beschreiben wir ein robustes Protokoll für die Ableitung menschlicher Kardiomyozyten, das die modulierte kardiale Differenzierung kleiner Moleküle und die durch Glukoseentzug vermittelte Kardiomyozytenreinigung kombiniert und die Produktion von gereinigten Kardiomyozyten für die Zwecke der Modellierung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und des Wirkstoffscreenings ermöglicht.

Ableitung von Highly Purified Kardiomyozyten aus Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit Small Molecule modulierte Differenzierung und anschließende Glucose Starvation

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine gereinigte Population von aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten zu erzeugen. Zunächst werden humane induzierte pluripotente Stammzellen in einer Zellmonoschicht kultiviert, bis sie etwa zu 85 % konfluent sind. Anschließend wird eine kleine Molekülverbindung, die den Wnt-Signalweg aktiviert, hinzugefügt, und die Zellen werden zwei Tage lang inkubiert, um die Bildung von Mesoderm zu induzieren.Anschließend wird eine niedermolekulare Verbindung, die den Wnt-Signalweg hemmt, den Zellen zugesetzt, um die Differenzierung zum Herzmeseoderm zu steuern. Die Zellen werden danach weitere zwei Tage inkubiert. Am siebten Tag schlagen die differenzierten Kardiomyozyten; der heterogene differenzierte Zellpopulation wird dann in einem kulturmedium mit niedrigem Glucosespiegel inkubiert, um die Kardiomyozyten selektiv zu reinigen.Schließlich werden die Zellen unter einem Lichtmikroskop visuell überprüft und mittels Durchflusszytometrie analysiert, um die Erzeugung einer hochreinen Population von schlagenden Kardiomyozyten zu bestätigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Kardiomyozyte

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Kardioblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen kardialen Vorläuferzellen und funktionelle Kardiomyozyten für Herz-Kreislauf-Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

Pluripotenten Stammzellen, entweder embryonale oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen), eine wertvolle Quelle der menschlichen differenzierten Zellen, einschließlich Herzmuskelzellen. Hier werden wir auf die kardiale Induktion der iPS-Zellen zu konzentrieren, die zeigen, wie man sie benutzt, um funktionelle menschliche Herzmuskelzellen durch eine Embryoidkörpern-basiertes Protokoll zu erhalten.

Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Der Artikel beschreibt die detaillierte Methode zur menschlichen pluripotenten Stammzellen differenzieren zu Herzmuskelzellen wirksam durch selektives Modulieren des Wnt-Signalwegs, gefolgt von Durchflusszytometrie-Analyse von Referenzmarkierungen, um die Homogenität und Identität der Population abzuschätzen.

High Efficiency Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen zu Kardiomyozyten und Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie

Hier präsentieren wir ein robustes, schnelles und skalierbares Protokoll zur Differenzierung von Kardiomyozyten für humane pluripotente Stammzellen (hPSCs). Kardiomyozyten, die mit dieser groß angelegten Methode gewonnen werden, können eine ausreichende Zellzahl für ihren effektiven Einsatz bei der Modellierung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen beim Menschen, beim Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening und möglicherweise in klinischen Anwendungen liefern.

Die Großproduktion von Kardiomyozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen hochreproduzierbarer Kleinmolekül-basierte Differenzierung Protokoll

Die elektrophysiologische Charakterisierung von Kardiomyozyten, die aus menschlichen Pluripotenten Stammzellen (hPSC-CMs) stammen, ist entscheidend für die Modellierung von Herzkrankheiten und für die Bestimmung von Arzneimittelwirkungen. Dieses Protokoll liefert die notwendigen Informationen, um hPSC-CMs auf Multi-Elektroden-Arrays zu dissoziieren und zu plattieren, ihr Feldpotential zu messen und ein Verfahren zur Analyse von QT- und RR-Intervallen zu verwenden.

Elektrophysiologische Analyse von humanen Pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten Kardiomyozyten (hPSC-CMs) unter Verwendung von Multi-Elektroden-Arrays (MEAs)

Dieser Artikel enthält eine Reihe von Protokollen für die Entwicklung von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten (hiPSC-CM) Netzwerken, die auf Multiwell-MEA-Platten kultiviert werden, um die Zellmembran für Aktionspotenzialmessungen reversibel zu elektroporatieren. Hochdurchsatzaufzeichnungen werden von denselben Zellstandorten wiederholt über Tage hinweg abgerufen.

Human iPSC-Derived Cardiomyozyte Networks auf Multiwell Micro-Elektroden-Arrays für recurrent Action Potential Recordings

Hier beschreiben und validieren wir eine Methode, um konsequent robuste humaninduzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten zu erzeugen und ihre Funktion zu charakterisieren. Diese Techniken können bei der Entwicklung mechanistischer Einblicke in Signalwege helfen, eine Plattform für groß angelegte Arzneimittelscreenings bieten und Herzkrankheiten zuverlässig modellieren.

Generierung von ventrikulären HiPSC-abgeleiteten Cardiomyozyten und hochwertigen Zellpräparaten für die Calciumhandling-Charakterisierung

Hier beschreiben wir eine einfach zu bedienende Methodik zur Erzeugung von 3D-selbstorganisierten kardialen Mikrogewebe-Arrays, die aus vordifferenzierten humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten, Herzfibroblasten und Endothelzellen bestehen. Diese benutzerfreundliche und zellarme Technik zur Erzeugung kardialer Mikrogewebe kann für die Krankheitsmodellierung und frühe Stadien der Arzneimittelentwicklung implementiert werden.

Herstellung von 3D-Cardiac Microtissue Arrays unter Verwendung von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten, kardialen Fibroblasten und Endothelzellen

Hier stellen wir ein Protokoll zur robusten Erzeugung und Erweiterung menschlicher Kardiomyozyten aus mononukleären Zellen des patienteneigenen peripheren Blutes vor.

Erzeugung und Expansion menschlicher Kardiomyozyten aus mononukleären Zellen des patientenperipheren Blutes

Humane induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) bieten eine Alternative zur Verwendung von Tieren für das präklinische Kardiotoxizitäts-Screening. Eine Einschränkung für die weit verbreitete Einführung von hiPSC-CMs im präklinischen Toxizitätsscreening ist der unreife, fetale Phänotyp der Zellen. Hier werden Protokolle für eine robuste und schnelle Reifung von hiPSC-CMs vorgestellt.

Hochdurchsatz-Kardiotoxizitäts-Screening unter Verwendung von reifen, humaninduzierten pluripotenten Stammzell-Kardiomyozyten-Monoschichten

Lernen Sie die Ableitung hochreiner Kardiomyozyten aus humanen iPS-Zellen durch Small-Molecule-modulierte Differenzierung und Glukose-Deprivation. Diese Methode ermöglicht präzise Modellierung kardiovaskulärer Erkrankungen.

Ableitung von Highly Purified Kardiomyozyten aus Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit Small Molecule modulierte Differenzierung und anschließende Glucose Starvation (Video) | JoVE Journal

Ableitung von Highly Purified Kardiomyozyten aus Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit Small Molecule modulierte Differenzierung und anschließende Glucose Starvation

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