Ableitung von Highly Purified Kardiomyozyten aus Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit Small Molecule modulierte Differenzierung und anschließende Glucose Starvation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine gereinigte Population von aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten zu erzeugen. Zunächst werden humane induzierte pluripotente Stammzellen in einer Zellmonoschicht kultiviert, bis sie etwa zu 85 % konfluent sind. Anschließend wird eine kleine Molekülverbindung, die den Wnt-Signalweg aktiviert, hinzugefügt, und die Zellen werden zwei Tage lang inkubiert, um die Bildung von Mesoderm zu induzieren.

Anschließend wird eine niedermolekulare Verbindung, die den Wnt-Signalweg hemmt, den Zellen zugesetzt, um die Differenzierung zum Herzmeseoderm zu steuern. Die Zellen werden danach weitere zwei Tage inkubiert. Am siebten Tag schlagen die differenzierten Kardiomyozyten; der heterogene differenzierte Zellpopulation wird dann in einem kulturmedium mit niedrigem Glucosespiegel inkubiert, um die Kardiomyozyten selektiv zu reinigen.

Schließlich werden die Zellen unter einem Lichtmikroskop visuell überprüft und mittels Durchflusszytometrie analysiert, um die Erzeugung einer hochreinen Population von schlagenden Kardiomyozyten zu bestätigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Kardiomyozyten-Differenzierungsprotokollen, die kleine Moleküle verwenden, liegt in dem zusätzlichen Schritt der Glukoseentzug. Dies ermöglicht uns, Kardiomyozyten zu reinigen, die in der Lage sind, andere Energiequellen als Glukose zu nutzen.

Nicht-Kardiomyozyten können selektiv aus dieser heterogenen Population differenzierter Zellen entfernt werden. Die Kardiomyozyten können anschließend für nachgeschaltete Anwendungen verwendet werden, wie beispielsweise die Modellierung von Erkrankungen in vitro oder die hochdurchsatzfähige Wirkstoffforschung. Vorbereitung der Assays: Beschichten Sie sechs-Well-Platten mit einer Lösung der extrazellulären Matrix oder ECMS und tauen Sie eine Vial mit gefrorenen humanen induzierten pluripotenten Stammzellen, oder HI PSCs, wie im begleitenden Text beschrieben, auf.

Nach der Zentrifugation suspendieren Sie die aufgetauten Zellen in E acht mit Rock-Inhibitor. Überführen Sie dann den Inhalt der Vialle in eine Vertiefung einer sechswelligen Platte, die zuvor mit ECMS beschichtet wurde. Stellen Sie die Zellen in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.

Nach 24 Stunden haben sich die Zellen angeheftet. Ersetzen Sie das Medium durch E acht Medium ohne Rock-Inhibitor. Kultivieren Sie die Zellen weiter und wechseln Sie das E acht Medium täglich.

Wenn die HI-PSCs eine Konfluenz von 75 bis 80 % erreichen, ist es Zeit, sie zu passagieren. Aspirieren Sie das Kulturmedium schnell. Spülen Sie die Vertiefungen mit einem Milliliter sterilem PBS bei Raumtemperatur und aspirieren Sie danach das PBS.

Gegeben Sie dann 500 µL einer 0,5 mmolaren EDTA-Lösung oder einer anderen Zellablösungslösung hinzu. Inkubieren Sie für ein bis sieben Minuten bei Raumtemperatur unter mikroskopischer Beobachtung, bis eine sichtbare Kräuselung oder Verdickung der Kolonien an den Rändern erkennbar ist; saugen Sie anschließend die Ablösungslösung ab. Fügen Sie dann 1 mL E8-Medium, ergänzt mit 10 µmol Rock-Inhibitor, hinzu und pipettieren Sie mit einer P1000 mehrfach vorsichtig auf und ab, um die H-iPS-Z-Kolonien vollständig von der Platte zu lösen, wobei sich fünf bis zehn Zellklumpen bilden.

Überführen Sie die Suspension anschließend in ein 15-Milliliter-Konischgefäß, um die großen Zellklumpen weiter aufzulösen. Pipettieren Sie mehrmals auf und ab, bis kleinere Klumpen entstanden sind, wie hier gezeigt. Verdünnen Sie die Zellen anschließend im Verhältnis 1 zu 12, indem Sie 11 Milliliter E8-Medium mit Rock-Inhibitor zur einmilliliterigen Zellsuspension hinzufügen.

Als Nächstes das ECMS aus den vorcodierten Platten abpipettieren und zwei Milliliter der resuspendierten Zellen in jedes Loch geben; etwa 100.000 Zellen pro Loch in einer 6-Loch-Platte sind ideal. Dabei darauf achten, die Zellen gleichmäßig im Loch zu verteilen, um eine Ansammlung von Zellen in der Mitte des Lochs zu vermeiden. Die Platte für 24 Stunden in den Inkubator stellen.

Am nächsten Tag das Medium durch E acht ersetzen, das keinen ROCK-Inhibitor enthält. Das Medium alle 24 Stunden wechseln, bis die Zellen 80 % konfluent sind. In der Regel sind die Zellen drei bis sechs Tage nach der Dissoziation mit EDTA oder einer Xcel-Detachmentslösung wieder bereit für die Passage; säen Sie etwa 100.000 humane iPSCs auf mit ECM beschichteten Sechswell-Kulturplatten für die Differenzierung aus.

Befolgen Sie die gleichen Schritte wie bei HI-PSCs, wenn die Zellen eine Konfluenz von 85 % erreicht haben: Wechseln Sie auf das R-P-M-I-B-27-Medium ohne Insulin, jedoch mit sechs Mikromolar des GSK-3-beta-Inhibitors CHIR 9 9 0 2 1. Inkubieren Sie die Zellen für 48 Stunden und untersuchen Sie die Zellen täglich unter dem Mikroskop.

Nach 24 Stunden Behandlung mit CHIR können erhebliche Mengen an Zelltod beobachtet werden. Dies ist normal und tritt üblicherweise nach zwei Tagen Behandlung auf. Die HIPS nehmen an Größe und Anzahl zu und differenzieren weiter in mesodermale Richtung.

Ersetzen Sie das Kulturmedium, das CHIR enthält, durch R-P-M-I-B 27 Insulin-Medium und inkubieren Sie bis zum dritten Tag. Am dritten Tag wechseln Sie das Medium in R-P-M-I-B 27 ohne Insulin. Geben Sie fünf µM des Wnt-Inhibitors IWR-1 hinzu und inkubieren Sie die Zellen für 48 Stunden.

Am fünften Tag die Zellen unter dem Mikroskop untersuchen. Die mesodermalen Zellen sollten sich in Richtung der kardialen Linie orientieren und anfangen, sich zusammenzulagern und charakteristische, verzweigte Strukturen zu bilden. Das Medium auf R-P-M-I-B 27 ohne Insulin umstellen und die Zellen 48 Stunden lang inkubieren.

Am siebten Tag. Ersetzen Sie das Medium ab dann alle drei Tage durch R-P-M-I-B 27, das Insulin enthält, und wechseln Sie zwischen dem achten und zehnten Tag zu dem gleichen Medium. Spontanes Schlagen von Kardiomyozyten ist nach 10 Tagen der Differenzierung zu beobachten.

Mehr als 50 % der Zellflächen schlagen. Allerdings können sich schlagende Zellschichten mit nicht-kardialen Zellen vermischt haben; am 10. Tag werden verzweigte Strukturen deutlich ausgeprägt sein. Terminal differenzierte Kardiomyozyten proliferieren über diesen Punkt hinaus nicht mehr.

Am Tag 10 nach der Differenzierung das Medium in jedem Brunnen der Sechs-Loch-Platte durch zwei Milliliter Niedrigglukose-Medium ersetzen und die Zellen bis zum Tag 13 drei Tage lang in diesem Medium kultivieren. Am Tag 13 die Zellen in RPMI-B27-Medium mit Insulin zurückversetzen oder alternativ zur Re-Expansion der Zellen, was die Dissoziation von nicht-kardiomyogenen Zellen während des Glukoseentzugs erleichtert.

Entfernen Sie das Medium und waschen Sie einmal mit PBS. Geben Sie 500 Mikroliter Zelldissoziationsenzym hinzu und inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang. Nach fünfminütiger Enzyminkubation dispergieren Sie die Kardiomyozyten mithilfe einer P-1000-Pipette durch bis zu 30-maliges Auf- und Abpipettieren in eine Einzelzell-Suspension. Nach der Dissoziation überführen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Konischglas.

Gefüllt mit fünf Millilitern R-P-M-I-B 27 Medium mit Insulin, um das Enzym für die Zell-Dissociation zu verdünnen; Zentrifugieren für vier Minuten bei 200 G. Nach dem Zentrifugieren das Überstandsvolumen absaugen und verwerfen. Anschließend die Zellen in zwei Millilitern R-P-M-I-B 27 Medium resuspendieren und auf eine neue, mit ECMS beschichtete 6-Well-Platte aussäen. Typischerweise steigt die Zellüberlebensrate mit zunehmender Konfluenz für optimales Zellüberleben.

Impfen Sie 2 Millionen Zellen pro Vertiefung in eine sechswellige Platte für Zellen, die nicht umgeimpft werden. Am 14. Tag wechseln Sie das Medium zurück auf zwei Milliliter Niedrigglukose-Medium für einen zweiten Glukoseentzugszyklus. Kultivieren Sie die Zellen in diesem Niedrigglukosezustand weitere drei Tage.

Die meisten Nicht-Kardiomyozyten sterben am 17. Tag ab. Wechseln Sie das Medium zu zwei Millilitern R-P-M-I-B 27 mit Insulin. Die verbleibenden Zellen sind hochgradig gereinigt. Kardiomyozyten.

Diese Zellen können für die Genexpressionsanalyse, die Wirkstoffscreening, die metabolische Analyse und verschiedene andere nachgeschaltete Assays verwendet werden, um die Kardiomyozytenreinheit nach Differenzierung und Reinigung mittels Glukoseverarmungsmethode zu untersuchen. Zellen wurden mittels Immunfärbung gegen den Kardiomyozytenmarker kardiales Troponin T (CTnT) charakterisiert. Die Immunfluoreszenzmikroskopie einer unreinen Population differenzierter Zellen zeigte, dass zwar viele Zellen am Tag 13 CTnT-positiv (grün dargestellt) waren, jedoch viele Zellen keinen CTnT-Ausdruck aufwiesen, was auf das Vorhandensein von Nicht-Kardiomyozyten hindeutet. Im Gegensatz dazu waren nach einer dreitägigen Glukoseverarmung ab Tag 10 nahezu alle Zellen am Tag 13 CTnT-positiv, was auf eine erfolgreiche Reinigung der Kardiomyozyten nach Glukoseverarmung hinweist.

Diese Daten wurden weiter durch eine Durchflusszytometrie-Analyse bestätigt. Wie in Rot angegeben, waren etwa 50 % der Zellen, die keiner Glukoseverarmung ausgesetzt waren, TN NT zwei positiv. Hingegen waren 90 % der glucosedeprivierten Zellen TN NT zwei positiv.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man humane induzierte pluripotente Stammzellen in hochgereinigte Populationen von Kardiomyozyten differenziert. Diese gereinigten Zellen können hochdurchsatzfähig für eine Vielzahl nachgeschalteter in-vitro-Anwendungen hergestellt werden. Wenn Sie pluripotente Stammzellen kultivieren, denken Sie daran, dass sie vor der Passage nicht bis zur hundertprozentigen Konfluenz wachsen dürfen.

Einige Stammzelllinien differenzieren am besten, wenn die anfängliche Konfluenz der pluripotenten Stammzellen unter 85 % liegt. Schließlich können einige Stammzelllinien schneller oder stärker auf den Schritt der Glukoseentzug reagieren. Überwachen Sie diese Parameter stets, bevor Sie mit neuen Stammzelllinien arbeiten.