Name: Synchronisation Caulobacter crescentus Für die Untersuchung der Bakterienzellzyklus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Lernen Sie die Synchronisation von Caulobacter crescentus durch Dichtezentrifugation zur Untersuchung des bakteriellen Zellzyklus. Diese Methode ermöglicht die schnelle Isolierung von Swarmer-Zellen für biochemische und mikroskopische Analysen.

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Die Autoren danken den Mitgliedern des Shapiro-Labors und Erin Schrader für ihre Kommentare zum Manuskript. Die Autoren danken für die finanzielle Unterstützung aus: NIH-Postdoktorandenstipendium F32 GM100732 an JMS und NIH-Stipendien R01 GM51426 und R01 GM32506 an LS.

1. Groß Synchrony - Optimal für Western Blot, Microarray / RNA-Seq und Sonstiges Material Intensive Tests <ol><li> Von einem Gefrierschrank Lager oder eine Platte, wachsen einem 5 ml O / N-Kultur des Stammes NA1000 durch Schütteln bei 28 ° C in PYE Medium. </li><li> Beimpfen von 0,5 ml der Zellen aus Schritt 1 in 25 ml M2G (Tabellen 1-2) und schüttelt bei 28 ° C, bis die Kultur eine OD 600 zwischen 0,5 und 0,6 erreicht. </li><li> Impfen Sie die Zellen in 1 l M2G und schütteln bei 28 ° C. </li><li> Sobald OD 600 erreicht 0,5 bis 0,6, bestätigen das Vorhandensein von Zellen mit Hilfe swarmer montiert flüssigen Phase Mikroskopie. Spot 1 ul der Zellen auf einen Objektträger, Deckel mit einem Deckglas und Bild durch Phasenmikroskopie. Bestätigen des Vorhandenseins von swarmer Zellen durch Visualisierung schneller schwimmen Zellen in der Population. </li><li> Spin-Zellen für 15 min bei 7 KXG bei 4 ° C in einem JA-10-Rotor. </li><li> Überstand verwerfen und fügen Sie 180 ml kaltes M2 (Tabellen 1-2) und sanft resuspend alle Zellen mit einer serologischen Pipette. Entsorgen Sie lose pelletierten Zellen; sie sind predivisional und stolzierte Zellen. </li><li> 60 ml kalte Kolloidales Siliciumdioxid-Lösung (unbedingt die Kolloidales Siliciumdioxid-Suspension auch vor der Zugabe zu den Zellen mischen) und mischen Sie die Zellsuspension gut. </li><li> Gießen Sie die Zellsuspension in acht 30-ml-Röhrchen und Spin für 30 min bei 6,4 KXG bei 4 ° C in einem JA-20 Rotor. HINWEIS: Man sollte zwei verschiedenen Bands zu sehen; die swarmer Band ist das untere Band während stolzierte / predivisional Zellen sind in der Top-Band (Abbildung 1B). </li><li> Die Top-Band vorsichtig absaugen und entfernen Sie die Flüssigkeit auf ca. 1 cm über dem swarmer Band (das untere Band). </li><li> (Kritisch) Mit einer Pasteur-Pipette, entfernen Sie vorsichtig die swarmer Band aufnehmen und in ein sauberes Röhrchen. Abzuwaschen Kolloidales Siliciumdioxid, oben das Rohr mit kaltem M2 und Schleudern für 10 min bei 6,4 KXG bei 4 ° C in einem JA-20-Rotor. </li><li> Vorsichtig den Überstand verwerfen und Resuspendieren derZellen in 20 ml kaltem M2 und Schleudern für 10 min bei 6,4 KXG bei 4 ° C in einem JA-20-Rotor. </li><li> Resuspendieren alle Pellets in 30 ml kaltem M2 und messen Sie die OD 600 mit einem Spektralphotometer und leere mit kaltem M2 Medium. Sparen Sie 1 ul für Phase-Bildgebung für swarmer Zellen überprüfen; 90-95% der Zellen sollten Schwärmer sein. </li><li> Anzentrifugieren die Zellen für 5 min bei 6,4 KXG bei 4 ° C in einem JA-20-Rotor. Zellen in 28 ° C M2G Medium, so dass der A 600 ist ~ 0,3-0,4 und beginnen bei 28 ° C schüttelnd. HINWEIS: Typische Ausbeuten zwischen 30 und 60 ml swarmer Zellkultur von 1L unsynchronisierten Zellen. </li><li> Fangen Sie an, Zeitpunkte (Wildtyp-Kultur wird in etwa 135 bis 140 Minuten in Anspruch nehmen zu teilen) 8,9. Zu jedem Zeitpunkt, messen Sie die OD 600. Prüfen, ob die OD 600 nach der Teilung ist ungefähr 2X die Anfangs-OD 600. </li><li> Für Western-Blot oder Genexpressionsassays entfernen 1 ml Aliquots der culture zu den gewünschten Zeitpunkten, Spin-down bei max Geschwindigkeit in einer Tischzentrifuge für 30 Sekunden, schnell Dekantieren des Mediums, und Flash Einfrieren des Zellpellets in flüssigem Stickstoff. Bewahren Sie die Zellen bei -80 ° C bis Downstream-Analyse. </li></ol> 2. Kleines Synchrony - Optimal für die Mikroskopie <ol><li> Von einem Gefrierschrank Lager oder eine Platte, wachsen ein 5 ml O / N-Kultur unter Schütteln bei 28 ° C im M2G. </li><li> Verdünnen Sie in 15 ml M2G (Tabellen 1-2) und wachsen, bis mid-log (OD 600 = 0,5-0,6). </li><li> Spin 6,4 KXG für 10 min bei 4 ° C in einem JA-20-Rotor und Resuspension in 1 ml kaltem M2 (Tabellen 1-2) und in ein 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Spin bei 15 KXG für 3 min in ein Mikrozentrifugenröhrchen Zellen zu pelletieren, absaugen Überstand, legen Sie die Tablette auf Eis, und resuspendieren in 900 ul kaltem M2. </li><li> Hinzufügen 900 ul kaltem PVP beschichtet kolloidales Siliciumdioxid und Spin für 20 min bei 15 KXG bei 4 ° C in einem Mikrofonrocentrifuge Rohr. </li><li> (Critical) Verwerfen Sie pipettieren aus der Spitze marschierte / predivisional Zellband und sammeln Sie die unten swarmer Band in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Waschen der swarmer Zellen zwei Mal in 1 ml kaltem M2 während der Zentrifugation bei 15 KXG für 3 min. </li><li> Vor dem letzten Spin, verschieben Sie die Zellen in eine vorgekühlte 1 ml Reagenzglas und messen Sie die OD 600 der Zellen im Vergleich zu einem Rohling aus M2. </li><li> Resuspendieren die endgültige Zellpellet in 28 ° C M2G bei einer OD von 0,3 bis 0,4 und schütteln / Roll-Zellen bei 28 ° C. Anmerkung: Typische Ausbeuten liegen zwischen 2 und 4 ml swarmer Zellkultur. </li><li> Für die Mikroskopie Experimente, zum gewünschten Zeitpunkt Punkten Platz 1 ul der Zellen auf eine M2G Agarose-Pad für die Bildgebung. </li></ol>

<ol><li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-level+design+of+bacterial+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">System-level design of bacterial cell cycle control.</a> FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).</li>
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<li>Boutte, C. C., Crosson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+logic+of+stringent+response+regulation+in+Caulobacter+crescentus%3A+starvation+signalling+in+an+oligotrophic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The complex logic of stringent response regulation in Caulobacter crescentus: starvation signalling in an oligotrophic environment.</a> Mol. Microbiol. 80, 695-714 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Der bakterielle Zellzyklus ist ein grundlegender Prozess im Leben und wichtig für die Erforschung des Wachstums und als Angriffspunkt für Antibiotika der nächsten Generation. In dieser Arbeit haben wir die Schnellsynchronisationsverfahren für C. crescentus NA1000, einen Modellorganismus für die Untersuchung des bakteriellen Zellzyklus und der asymmetrischen Zellteilung, detailliert beschrieben. Diese Methode eignet sich für Western Blot, Genexpressionsprofilierung und Fluoreszenzmikroskopie-Assays, um die raumz...

Die bakterielle Zellzyklus steuert sowohl die Replikation des Genoms und die Teilung der Tochterzellen. Wichtig ist, wie Antibiotika-Resistenz ist eine wachsende Bedrohung der öffentlichen Gesundheit stellt der bakteriellen Zellzyklus eine ungenutzte Ziel für Antibiotika-Entwicklung. In dem Bakterium Caulobacter crescentus, führt jede Zellzyklus in einer asymmetrischen Teilung, wodurch zwei Tochterzellen unterschiedlicher Schicksal (1A) 1,2. Eine Tochterzelle erbt eine Geißel und ist beweglich, während die andere Tochter erbt einen Stiel und sitzend. Eine integrierte genetische Schaltung steuert Zellzyklus und Zellschicksal von Transkriptionsregulation, Phospho-Signalisierung und regulierte Proteolyse 3. Zusätzlich Chromosomenreplikation und gleichzeitige Trennung Ausbeute Tochterzellen, die genau eine Kopie des Chromosoms 4 enthalten. Wichtig ist, dass diese beiden Zelltypen schnell durch collo getrennt werdenidal Silicateilchen Dichtezentrifugation im synchronisierbar NA1000 Stamm 5-7 ermöglicht die Isolierung der swarmer Zellen aus dem Rest der Population mit hohen Ausbeuten (1B). Isoliert swarmer Zellen dann synchron gehen durch asymmetrische Zellteilung. Hier haben wir ausführlich das Protokoll für die Synchronisierung von Caulobacter Belastung NA1000. Wir bieten Protokolle und gemeinsame Tipps zur Fehlerbehebung für Klein- und angelegte Synchronisationen. Das experimentelle Verfahren bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die räumlich-zeitliche Kontrolle der Caulobacter Zellzyklus und Zellschicksal zu verhören.

<table><tbody><tr><td>PVP-beschichtete kolloidale Kieselsäure (Percoll)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4937</td><td></td></tr><tr><td>kolloidale Kieselsäure (Ludox AS-40)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>420840</td><td></td></tr><tr><td>JA10 Rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>369687</td><td></td></tr><tr><td>JA20 Rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>334831</td><td></td></tr><tr><td>Eisensulfat-Chelatlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0518</td><td></td></tr><tr><td>30 ml Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>8445</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD</td><td>SX0720-1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>VWR</td><td>BDH9268-500G</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Amresco</td><td>0621-500g</td><td></td></tr></tbody></table>

synchronisation<em&gt; caulobacter crescentus</em&gt; für die untersuchung der bakterienzellzyklus

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Der Zellzyklus ist wichtig für das Wachstum, die Genomreplikation und die Entwicklung in allen Zellen. Bei Bakterien haben sich Studien des Zellzyklus weitgehend auf unsynchronisierte Zellen konzentriert, was es schwierig macht, die zeitlichen Ereignisse zu ordnen, die für das Fortschreiten des Zellzyklus, die Genomreplikation und die Teilung erforderlich sind. Caulobacter crescentus stellt ein hervorragendes Modellsystem für den bakteriellen Zellzyklus dar, bei dem Zellen durch Dichtezentrifugation schnell in einen G0-Zustand synchronisiert werden können. Experimente zur Zellzyklussynchronisation wurden verwendet, um die molekularen Ereignisse zu ermitteln, die die Chromosomenreplikation und -segregation steuern, um ein genetisches regulatorisches Netzwerk zu kartieren, das die Zellzyklusprogression steuert, und um die Etablierung polarer Signalkomplexe zu identifizieren, die für die asymmetrische Zellteilung erforderlich sind. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die schnelle Synchronisation von Caulobacter NA1000 Zellen zur Verfügung. Die Synchronisation kann sowohl in einem großmaßstäblichen Format für die Erstellung von Genexpressionsprofilen und Western-Blot-Assays als auch in einem kleinen Format für Mikroskopie oder FACS-Assays durchgeführt werden. Die schnelle Synchronisierbarkeit und die hohen Zellausbeuten von Caulobacter machen diesen Organismus zu einem leistungsfähigen Modellsystem für Untersuchungen des bakteriellen Zellzyklus.

Synchronisations ergibt typischerweise zwei Banden von Zellen (1B): der swarmer Band, das eine höhere Dichte hat, und eine gestielte / predivisional Zellenband mit geringerer Dichte. Um sicherzustellen, dass effiziente Synchronisation gemeinsame Kontrollen umfassen die Überwachung der OD 600 und Messung der Konzentrationen von Ctra Protein durch Western-Blot auf verschiedene Zellzykluszeitpunkten. Die OD 600 sollte um etwa 2-fach im Verlauf des Zellzyklus (Figur 2)...

Die Synchronisation von Bakterienzellen ist essentiell für die Erforschung des bakteriellen Zellzyklus und der Entwicklung. Caulobacter crescentus ist durch Dichtezentrifugation synchronisierbar und ermöglicht so ein schnelles und leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung des bakteriellen Zellzyklus. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Synchronisation von Caulobacter-Zellen zur Verfügung.

Synchronisation<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Für die Untersuchung der Bakterienzellzyklus

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Coob-Backer-Schwärmerzellen zu isolieren, um eine synchronisierte Zellkultur zu etablieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine gemischte Kultur von Coob-Backer-Zellen angezüchtet und anschließend das Wachstum kurzzeitig durch Resus-Aufschwemmen der Zellen in kaltem Medium angehalten wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Schwärmerzellen durch Dichtegradientenzentrifugation voneinander zu trennen.Der nächste Schritt besteht darin, die Schwarmzellen in warmem Medium erneut zu suspendieren, wodurch die Zellen in den Zellzyklus eintreten können. Schließlich können die isolierten Schwarmzellen mithilfe biochemischer Assays oder der Mikroskopie während des gesamten Zellzyklus verfolgt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden, wie beispielsweise der Babyzellmaschine, liegt darin, dass Zellen schnell isoliert und in ausreichenden Mengen vermehrt werden können, um biochemische Untersuchungen durchzuführen.Mithilfe dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der Zellbiologie beantworten, beispielsweise welche Prozesse die Chromosomen-Segregation und den asymmetrischen Zellteilungszyklus steuern. Beginnen Sie damit, fünf Milliliter PYE-Medium mit Bakterien von einer Platte der Stammkultur Colo Backer CSIS, NA 1000, zu impfen. Kultivieren Sie die Probe über Nacht bei 28 Grad Celsius unter Schütteln. Am folgenden Tag übertragen Sie 0,5 Milliliter der Übernachtkultur in einen Kolben mit 25 Millilitern M2G-Medium und schütteln den Kolben bei 28 Grad Celsius, bis die Kultur eine optische Dichte zwischen 0,5 und 0,6 erreicht hat.Als Nächstes verdünnen Sie die Kultur in einem Liter M-zwei-G-Medium, um die gewünschte Start-Optische Dichte zu erreichen, und schütteln das Kolben bei 28 Grad Celsius. Wenn die optische Dichte der Kultur 0,5 erreicht, pipettieren Sie einen Mikroliter der Kultur auf einen Objektträger und bedecken die Flüssigkeit anschließend mit einem Deckglas. Bilden Sie die Zellen mittels Phasenkontrastmikroskopie ab, um das Vorhandensein schnell schwimmender Schwarmzellen zu bestätigen. Überführen Sie die Kultur in ein steriles Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen dann 15 Minuten bei 7.000 × g und 4 Grad Celsius.Entfernen Sie anschließend die locker pelletierten Zellen, während Sie das Überstand entfernen, und geben Sie 180 Milliliter kaltes M2-Medium hinzu. Lösen Sie die Zellen vorsichtig mit einer serologischen Pipette erneut auf. Geben Sie danach 60 Milliliter kalte kolloidale Kieselsäurelösung zur Zellsuspension hinzu und mischen Sie gründlich. Geben Sie die Zellsuspension auf acht 30-Milliliter-Röhrchen auf und zentrifugieren Sie sie bei 6.400 × g für 30 Minuten. Stellen Sie 4 Grad Celsius ein. Entfernen Sie die Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge und überprüfen Sie jedes Röhrchen auf zwei deutlich getrennte Bänder.Das untere Band enthält die Schwärmerzellen, während sich die prädivisionellen Zellen im oberen Band befinden. Saugen Sie anschließend vorsichtig das obere Band und die Flüssigkeit bis auf etwa einen Zentimeter oberhalb des unteren Bandes ab. Entfernen Sie mithilfe einer Pasteurpipette das Schwarmband und überführen Sie es in ein sauberes Gefäß.Füllen Sie das Reagenzglas mit kaltem M2-Medium und zentrifugieren Sie es anschließend, um die kolloidale Kieselsäure zu entfernen. Danach entsorgen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren die Zellen in 20 Milliliter kaltem M2-Medium. Zentrifugieren Sie erneut, um die Zellen zu pelletieren. Resuspendieren Sie die Pellets in 30 Milliliter kaltem M2-Medium und messen Sie dann die optische Dichte der Suspension.Geben Sie ein Mikroliter der Zellsuspension auf einen Objektträger und verwenden Sie die Phasenkontrastmikroskopie, um auf Schwarmzellen zu prüfen. Zentrifugieren Sie anschließend die Zellen und resuspendieren Sie sie in M2G-Medium auf eine optische Dichte zwischen 0,3 und 0,4. Inkubieren Sie die Kultur unter Schütteln bei 28 Grad Celsius für Western-Blot- oder Genexpressionsanalysen.Entnehmen Sie alle 10 bis 30 Minuten jeweils ein Milliliter-Probe aliquot über einen Zeitraum von etwa 140 Minuten, bis sich die optische Dichte der Kultur verdoppelt hat. Zentrifugieren Sie die Zellen mit einem Tischzentrifugengerät für 30 Sekunden, um sie abzutrennen, und saugen Sie anschließend das Medium schnell ab. Gefrieren Sie die Zellpellets in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius für kleine synchronisierte Ansätze. Inokulieren Sie fünf Milliliter M2G-Medium mit NA1000-Zellen und kultivieren Sie die Zellen über Nacht bei 28 Grad Celsius unter Schütteln. Am folgenden TagVerdünnen Sie die Kultur in 15 Milliliter M2G-Medium und kultivieren Sie die Zellen, bis die optische Dichte zwischen 0,5 und 0,6 liegt. Zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie anschließend in einem Milliliter kaltem M2-Medium. Überführen Sie die Zellen in ein zwei Milliliter fassendes Mikrozentrifugenröhrchen, pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und aspirieren Sie den Überstand.Bringen Sie dann das Gefäß auf Eis und resuspendieren Sie das Zellpellet in 900 µL kaltem M zwei Medium. Fügen Sie anschließend 900 µL kaltes PVP-beschichtetes kolloidales Siliziumdioxid hinzu und zentrifugieren Sie das Gefäß 20 Minuten lang. Aspirieren Sie vorsichtig die obere Bande der prädivisonellen Zellen und sammeln Sie die untere Schwärmerbande in einem neuen Mikrozentrifugenröhrchen.Waschen Sie die Schwärmerzellen zwei Mal in einem Milliliter kaltem M2-Medium, wobei zwischen jedem Waschschritt eine Zentrifugation für drei Minuten erfolgt, direkt vor der letzten Zentrifugation. Geben Sie die Zellsuspension in ein vorab gekühltes einteiliges Glasröhrchen mit einem Milliliter Fassungsvermögen und messen Sie die optische Dichte der Zellen. Anschließend überführen Sie die Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren nach der Zentrifugation.Reese, suspendieren Sie das endgültige Zellpellet in vorgewärmtem M zwei G-Medium bei einer optischen Dichte zwischen 0,3 und 0,4 und schütteln Sie die Zellen bei 28 Grad Celsius. Falls eine Mikroskopie gewünscht ist, geben Sie einen Mikroliter der Kultur zu den entsprechenden Zeitpunkten auf ein M zwei G-Aeros-Pad. Die differenzielle Dichtezentrifugation einer asynchronen Kultur ergibt zwei Zellbänder.Das untere Band enthält Schwärmerzellen mit einer höheren Dichte, das obere Band enthält Lagerzellen und prädivisionäre Zellen mit einer geringeren Dichte. Die optische Dichte der Kultur steigt während des Zellzyklus um etwa das Zweifache an. In dieser Zeit differenzieren sich Schwärmerzellen zu Lagerzellen, anschließend replizieren sich die Lagerzellen und durchlaufen eine asymmetrische Zellteilung.Mit jeder Teilung entsteht eine neue Schwärmerzelle und die ursprüngliche Zelle bleibt als Vorratszelle erhalten. Eine Western-Blot-Analyse für den Hauptregulator des Zellzyklus CTRA ist eine hilfreiche Kontrolle, um die Synchronisation zu überprüfen. CTRA blockiert die DNA-Replikation in Schwärmerzellen und wird nach Beginn der DNA-Replikation abgebaut. Anschließend wird CTRA später im Zellzyklus erneut synthetisiert, wodurch eine erneute Initiation der DNA-Replikation verhindert und die Transkription zahlreicher Entwicklungs-Gene aktiviert wird. Dieses oszillierende Muster der CTRA-Proteinspiegel deutet auf eine erfolgreiche Synchronität hin.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man NA 1000-Zellen synchronisiert, um den bakteriellen Zellzyklus zu untersuchen. Dieses Verfahren zur Zellsynchronisierung kann in einer bis zwei Stunden durchgeführt werden, wenn es korrekt ausgeführt wird. Dabei ist es wichtig, sich daran zu erinnern, schnell zu arbeiten.

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Engineering adhärenten Bakterien durch Schaffung eines einheitlichen Synthetic Curli Operon

Quelle: Murata, K. et. al., Visualisierung der DNA-Kompression in Cyanobakterien durch Hochspannungs-Kryo-Elektronentomographie. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt die synchrone Kultivierung von Cyanobakterien unter Hell-Dunkel-Zyklen, um die zirkadiane regulierte DNA-Verdichtung zu untersuchen. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigt kondensierte DNA zu definierten Zeitpunkten und bestätigt damit die Ausrichtung des Zellzyklus in der gesamten Population.

Synchronisierung von Cyanobakterienkulturen und DNA-Verdichtung durch Hell-Dunkel-Zyklen

Verständnis der Funktion der wesentlichen Prozesse in Bakterien ist eine Herausforderung. Fluoreszenz-Mikroskopie mit zielgruppenspezifischer Farbstoffe kann wichtige Einblicke in mikrobiellen Zelle Wachstum und Zellzyklus Fortschreiten geben. Hier wird Agrobacterium Tumefaciens als ein Modell-Bakterium verwendet, um Methoden für das live Cell Imaging zur Charakterisierung der wesentlichen Prozesse zu markieren.

Live Cell Fluoreszenzmikroskopie um wesentliche Vorgänge während der mikrobiellen Zellwachstum beobachten

Bakterienzellen sind räumlich sehr organisiert. Um diese Organisation im Laufe der Zeit in den langsam wachsenden Myxococcus Xanthus Zellen zu folgen, wurde ein Setup für Fluoreszenz live Cell Imaging mit hoher räumlich-zeitliche Auflösung über mehrere Generationen hinweg entwickelt. Mit dieser Methode konnte raumzeitliche Dynamik wichtige Proteine für Chromosom Segregation und Zellteilung bestimmt werden.

Fluoreszenz Live Cell Imaging der komplette Vegetative Zellzyklus von langsam wachsenden sozialen Bakterium Myxococcus xanthus

Hier beschrieben ist eine Methode zur Analyse von bakteriellen Genexpression in tierischem Gewebe auf zellulärer Ebene. Diese Methode bietet eine Ressource für das Studium der phänotypische Vielfalt innerhalb einer Bakterienpopulation in Reaktion auf die Umwelt Gewebe während einer Infektion auftreten.

Eine Fluoreszenz basierende Methode, bakterielle Genregulation in infizierten Gewebe zu studieren

Dieser Artikel enthält eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Untersuchung der subzellulären Lokalisierungsdynamik von Proteinen und zur Überwachung morphologischer Veränderungen mithilfe der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie in Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus.

Live-Cell Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung subzellulärer Proteinlokalisierung und Zellmorphologie Veränderungen in Bakterien

Diese Arbeit stellt eine Mikroskopiemethode vor, die eine Live-Bildgebung einer einzelnen Zelle von Escherichia coli zur Analyse und Quantifizierung des stochastischen Verhaltens synthetischer Genkreise ermöglicht.

Kontinuierliche Messung des biologischen Rauschens in Escherichia Coli mittels Zeitraffermikroskopie

Viele Bakterien verwenden Flagellen-getriebene Motilität, um ihre Umgebung zu navigieren und eine günstige Umgebung sowohl einzeln als auch als Kollektiv zu besiedeln. Demonstriert wird hier die Verwendung von drei etablierten Methoden, die Die Motilität als Selektionswerkzeug nutzen, um Komponenten / Pfade zu identifizieren, die zur Schwimm- und Schwarmmotilität beitragen.

Untersuchung der Flagellen-getriebenen Motilität in Escherichia coli durch Anwendung von drei etablierten Techniken in einer Serie

Die Antibiotikapersistenz beschreibt die Fähigkeit kleiner Subpopulationen innerhalb einer empfindlichen isogenen Population, hohe Dosen bakterizider Antibiotika vorübergehend zu tolerieren. Das vorliegende Protokoll kombiniert Ansätze zur Charakterisierung des Antibiotika-Persistenz-Phänotyps auf molekularer und zellulärer Ebene, nachdem Escherichia coli tödlichen Dosen von Ofloxacin ausgesetzt wurde.

Populations- und Einzelzellanalyse der Antibiotikapersistenz in Escherichia coli

Eine Herausforderung bei der Analyse synchronisierter Zeitreihenexperimente besteht darin, dass sich die Experimente oft in der Dauer der Erholung von der Synchronität und der Zellzyklusperiode unterscheiden. Daher können die Messungen aus verschiedenen Experimenten nicht aggregiert analysiert oder ohne weiteres verglichen werden. Hier beschreiben wir eine Methode zur Ausrichtung von Experimenten, um phasenspezifische Vergleiche zu ermöglichen.

Abgleich von synchronisierten Zeitreihendaten unter Verwendung des Modells zur Charakterisierung des Zellzyklusverlusts für experimentübergreifende Vergleiche

Lernen Sie die Synchronisation von Caulobacter crescentus durch Dichtezentrifugation zur Untersuchung des bakteriellen Zellzyklus. Diese Methode ermöglicht die schnelle Isolierung von Swarmer-Zellen für biochemische und mikroskopische Analysen.

Synchronisation

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