Synchronisation Caulobacter crescentus Für die Untersuchung der Bakterienzellzyklus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Coob-Backer-Schwarmzellen zu isolieren, um eine synchronisierte Zellkultur zu etablieren. Dies wird erreicht, indem zuerst eine Mischkultur von Coob-Backer-Zellen gezüchtet und dann das Wachstum kurzzeitig gestoppt wird, indem Resus die Zellen in kaltem Medium suspendiert. Der zweite Schritt besteht darin, die Schwarmzellen durch Differentialdichtezentrifugation zu trennen.

Der nächste Schritt besteht darin, die Schwarmzellen in warmem Medium zu resuspendieren, wodurch die Zellen in den Zellzyklus eintreten können. Schließlich können die isolierten Schwarmzellen mithilfe biochemischer Assays oder Mikroskopie über den gesamten Zellzyklus hinweg verfolgt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden, wie z. B. der Babyzellmaschine, besteht darin, dass Zellen schnell isoliert werden können und genügend Mengen für biochemische Studien vergrössert werden können.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Zellbiologie zu beantworten, z. B. was die Chromosomentrennung und den asymmetrischen Zellteilungszyklus steuert. Zu Beginn inokulieren Sie fünf Milliliter PYE-Medium mit Bakterien aus einer Platte mit dem Colo-Backer-CSIS-Stamm NA 1000. Die Kultur wird über Nacht bei 28 Grad Celsius gezüchtet und am nächsten Tag geschüttelt, 0,5 Milliliter der Übernachtkultur werden in einen Kolben mit 25 Millilitern M zwei G Medium überführt und der Kolben wird bei 28 Grad Celsius geschüttelt, bis die Kultur eine optische Dichte zwischen 0,5 und 0,6 erreicht.

Als nächstes verdünnen Sie die Kultur in einen Liter M zwei G Medium, um die gewünschte optische Ausgangsdichte zu erhalten, und schütteln Sie den Kolben bei 28 Grad Celsius, wenn die optische Dichte der Kultur 0,5 Grad Celsius erreicht. Pipettieren Sie einen Mikroliter der Kultur auf einen Objektträger und bedecken Sie dann die Flüssigkeit mit einem Deckglas. Bilden Sie die Zellen mit Hilfe der Phasenmikroskopie ab, um das Vorhandensein von schnell schwimmenden Schwarmzellen zu bestätigen. Übertragen Sie die Kultur in ein steriles Zentrifugenröhrchen und drehen Sie die Zellen dann 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 7.000 G G.

Als nächstes entsorgen Sie die lose pelletierten Zellen beim Abgießen des Überstands und fügen Sie 180 Milliliter kaltes M zwei Medium hinzu. Verwenden Sie eine serologische Pipette, um die Zellen sanft wieder zu suspendieren. Geben Sie dann 60 Milliliter kalte kolloidale Kieselsäurelösung in die Zellsuspension und mischen Sie gut.

Gießen Sie die Zellsuspension in acht 30-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie 30 Minuten lang bei 6.400 mal G. Stellen Sie vier Grad Celsius ein. Nehmen Sie die Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge und überprüfen Sie das Röhrchen auf zwei unterschiedliche Banden.

Das untere Band enthält die Schwarmzellen und die Vorteilungszellen befinden sich im oberen Band. Saugen Sie dann das obere Band und die Flüssigkeit vorsichtig bis zu etwa einem Zentimeter über dem unteren Band an. Verwenden Sie eine Pasterpipette, um das Schwarmband zu entfernen und in ein sauberes Röhrchen zu übertragen.

Füllen Sie das Röhrchen mit kaltem M zwei Medium und zentrifugieren Sie das Röhrchen, um das kolloidale Siliziumdioxid wegzuspülen. Entsorgen Sie anschließend den Überstand vorsichtig und resuspendieren Sie die Zellen in 20 Millilitern kalter M zwei Medium Zentrifuge. Um die Zellen wieder zu pelletieren, resuspendieren Sie die Pellets in 30 Milliliter kaltem M zwei Medium und messen Sie dann die optische Dichte der Suspension.

Geben Sie einen Mikroliter der Zellsuspension auf einen Objektträger und verwenden Sie die Phasenbildgebung, um nach Schwarmzellen zu suchen. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren sie in M zwei G Medium auf eine optische Dichte zwischen 0,3 und 0,4. Inkubieren Sie die Kultur durch Schütteln bei 28 Grad Celsius für westliche Parzellen- oder Genexpressionsassays.

Entfernen Sie alle 10 bis 30 Minuten etwa 140 Minuten lang ein Milliliter-Aliquot, bis sich die optische Dichte der Kultur verdoppelt. Verwenden Sie eine Tischzentrifuge, um die Zellen 30 Sekunden lang herunterzuschleudern und dann den mittleren Blitz schnell abzusaugen. Frieren Sie die Zellpellets in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius für die Synchronität im kleinen Maßstab, inokulieren Sie fünf Milliliter M zwei G Medium mit NA 1000-Zellen und züchten Sie die Zellen über Nacht unter Schütteln bei 28 Grad Celsius am nächsten Tag.

Verdünnen Sie die Kultur in 15 Millilitern M zwei G Medium und züchten Sie die Zellen, bis die optische Dichte zwischen 0,5 und 0,6 liegt. Zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie dann in einem Milliliter kaltem M zwei Medium. Übertragen Sie die Zellen in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und aspirieren Sie das Substrat.

Legen Sie dann das Röhrchen auf Eis und resuspendieren Sie das Zellpellet in 900 Mikrolitern kaltem M zwei Medium. Fügen Sie anschließend 900 Mikroliter kaltes PVP-beschichtetes kolloidales Siliziumdioxid hinzu und zentrifugieren Sie das Röhrchen 20 Minuten lang. Aspirieren Sie vorsichtig das obere Zellband vor der Teilung und sammeln Sie dann das untere Schwarmband in einem neuen Mikrozentrifugenröhrchen.

Waschen Sie die Schwarmzellen zweimal in einem Milliliter kaltem M zwei Medium und zentrifugieren Sie zwischen jedem Waschgang drei Minuten lang kurz vor dem letzten Schleudern. Geben Sie die Zellsuspension in ein vorgekühltes Ein-Milliliter-Reagenzglas und messen Sie die optische Dichte der Zellen. Dann werden die Zellen in ein Mikrofurchenröhrchen überführt und nach der Zentrifusion zentrifugiert.

Reese, suspendieren Sie das endgültige Zellpellet in Prewarm M zwei G Medium bei einer optischen Dichte zwischen 0,3 und 0,4 und schütteln Sie die Zellen bei 28 Grad Celsius. Wenn eine Mikroskopie gewünscht wird, geben Sie einen Mikroliter der Kultur zu den entsprechenden Zeitpunkten auf ein M two G aeros Pad. Die Differentialdichtezentrifugation einer asynchronen Kultur ergibt zwei Zellbanden.

Das untere Band enthält Schwarmzellen, die eine höhere Dichte aufweisen, und das obere Band enthält gefüllte und vorgeteilte Zellen, die eine niedrigere Dichte aufweisen. Die optische Dichte der Kultur nimmt im Laufe des Zellzyklus um etwa das Doppelte zu. Während dieser Zeit differenzieren sich Schwarmzellen zu Stammzellen, die Stammzellen replizieren sich dann und durchlaufen eine asymmetrische Zellteilung.

Mit jeder Teilung, die eine neue Schwarmzelle und die Stammzelle hervorbringt, ist ein Western Blot für den Zellzyklus-Master-Regulator CTRA eine nützliche Kontrolle, um die Synchronisation zu überprüfen, CTRA blockiert die DNA-Replikation in Schwarmzellen und wird bei der DNA-Replikation abgebaut. CTRA wird dann später im Zellzyklus synthetisiert, wodurch die Wiederinitiierung der DNA-Replikation verhindert und die Transkription vieler Entwicklungsgene aktiviert wird. Dieses oszillierende Muster der CTRA-Proteinspiegel deutet auf eine erfolgreiche Synchronität hin.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Callback- oder NA 1000-Zellen synchronisieren, um den bakteriellen Zellzyklus zu untersuchen. Dieser Zellsynchronisierungsvorgang kann bei korrekter Ausführung in ein bis zwei Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, schnell zu arbeiten.