Protokolle für die Beschaffung Zygotic und somatischen Embryonen zur Untersuchung der Regulation der frühen Embryo-Entwicklung in der Modell-Hülsenfrucht Medicago truncatula

Das übergeordnete Ziel der folgenden Verfahren ist es, zu zeigen, wie viele Cargo-Tula-Embryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien gewonnen werden können. Um die genetische Regulation der Embryogenese in Pflanzen zu untersuchen, kann dies erreicht werden, indem die Morphologie der Schote mit den verschiedenen Entwicklungsstadien der zygotischen Embryonen verknüpft wird und durch die Kultivierung von Blattexplan, um somatische Embryonen in den verschiedenen Stadien zu erhalten. Letztendlich können quantitative PCR und Beta-Glucuronidase verwendet werden, um die Expression von Genen während der Embryogenese in den spezifischen Entwicklungsstadien von Interesse zu beurteilen. Die Vorteile dieser Techniken bestehen darin, dass die Markierung einzelner Blüten für die in vivo Experimente nicht erforderlich ist und optimierte in vitro Verfahren komplementäre experimentelle Ansätze bieten.

visuelle Demonstration des Kulturverfahrens ist wichtig, da so die Details der Manipulationen genauer verfolgt werden können. Wang wird das In-vivo-Verfahren vorführen, während Kim Nolan das In-vitro-Verfahren vorführen wird. Um die Entwicklung des zygotischen Embryos zu erleichtern, stechen Sie die Oberfläche der Samenschalen der Samen einer Monte cargo Trinokularpflanze ein und weichen Sie die Samen über Nacht vollständig mit Wasser bedeckt ein.

Am nächsten Tag säen Sie je drei Samen in 10 Töpfe mit einem Durchmesser von 15 Zentimetern in Blumenerde und bringen Sie die Töpfe in ein Gewächshaus. Züchten Sie die Pflanzen in einer 14-stündigen Fotoperiode mit einer Tag-Nacht-Temperatur von 23 bis 19 Grad Celsius, bewahren Sie die gesündesten Sämlinge nach der Keimung auf, so dass es eine Pflanze pro Topf gibt, und umgeben Sie die Sämlinge mit einem Spalier, damit die Pflanzenstängel klettern können, wenn die Schoten erscheinen. Sammeln Sie in den entsprechenden Stadien, die in Tabelle eins und Abbildung eins beschrieben sind, um das gewünschte frühe Entwicklungsstadium des Embryos zu erhalten.

Isolieren Sie anschließend mit einer Pinzette die Les von den Pods. Alternativ können für eine verfeinerte Mikroskopie, die in Hoyer-Lösung vollständig klar ist, die Embryonalstadien durch Bildgebung der Embryonen unter einem Standard-Verbundmikroskop bestätigt werden. Sammeln Sie dann die für das Experiment erforderliche Anzahl von UL aus dem zentralen Bereich der Kapsel und lagern Sie sie bei der entsprechenden Temperatur für die nachgeschaltete Analyse für die somatische Embryonalentwicklung.

In vitro ernten Sie Blättchen aus dem jüngsten, fast vollständig aufgeblähten Tate-Blatt eines länglichen Stängels einer tran atula-Sorte, die in Kultur leicht Embryonen bilden kann. Bewahren Sie die Tate-Blätter auf einem feuchten Papiertuch in einem Kulturtopf auf, um ein Austrocknen zu vermeiden. Dann arbeiteten Sie in einer UV-sterilisierten Biosicherheitswerkbank und legten die Blätter in die Netzkugel eines Autoklaven-Frühlingstee-Eies.

Ein eingetauchtes Sieb aus 70%igem Ethanol in einem Autoklaven mit 250 Milliliter Schraubverschluss. Nach 30 Sekunden den Polycarbonat-Kulturtopf auffüllen, das Blattgewebe abtropfen lassen und dann den Infuser 10 Minuten lang in eine ein- bis achtfach verdünnte Bleichlösung tauchen. Schwenken Sie den Topf unter gelegentlichem leichtem Schwenken vorsichtig und lassen Sie das überschüssige Wasser ab.

Spülen Sie dann das Ei aus. Noch einmal in frischem entionisiertem Wasser in einem neuen Topf. Verwenden Sie nun eine sterile Pinzette, um die Blätter aus dem Teeei in eine frische Kultur zu überführen, und setzen Sie die Kanne mit sterilem deionisiertem destilliertem Wasser auf die sterile Kappe.

Spülen Sie dann die Blätter durch Umkehren und Schwenken ab. Lassen Sie dann die Segel auf dem sterilen Wasser schwimmen, um die Implantate zu plattieren. Schneiden Sie die Ränder der einzelnen sterilisierten Packungsbeilagen mit steriler Technik ab.

Schneiden Sie dann das verbleibende Rechteck in zwei oder drei, acht bis 10 mal drei bis fünf Millimeter große rechteckige Explan, wobei sich die Mittelader in der Mitte jeder X-Explanplatte befindet. Sechs x Explantate pro Agar erstarrtes Kulturmedium mit neun Zentimeter Durchmesser. Petrischalen mit der ABA-Dichtungsseite nach unten, um die übliche Blattausrichtung beizubehalten.

Anschließend verschließen Sie die Petrischalen mit Perfil und inkubieren die Platten im Dunkeln bei 28 Grad Celsius in einem kontrollierten Temperaturraum. Nach drei Wochen verwenden Sie einen sterilen Spatel aus Edelstahl und eine Pinzette, um die Explantate des Differenzierungslochs auf frisches Medium zu subkultivieren. Die ersten Embryonen sollten in etwa vier Wochen beobachtet werden, da die Schwielenbildung auftritt und die Kallus die Größe des größten hier gezeigten Explans übersteigt.

Übertragen Sie nur 50% des individuellen Kallus bei der Subkultur auf das frische Medium. Verwenden Sie schließlich ein Stereomikroskop, um die verschiedenen Embryonalstadien über eine vier- bis achtwöchige Inkubationszeit zu sammeln und die Explantate gemäß den Versuchszielen zu verarbeiten. Nach der Entnahme zygotischer Embryonen, wie gerade stromabwärts in C gezeigt, können zwei Hybridisierungen oder andere geeignete Strategien von besonderem Interesse angewendet werden, wie in diesen Bildern gezeigt, kann die Unterscheidbarkeit von SSIS und Spencer beobachtet werden, indem man den plattierten X-Plänen folgt.

In der vierten bis achten Woche können somatische Embryonen in diskreten Stadien lokalisiert und für die sofortige Analyse entnommen werden. Diese Daten veranschaulichen beispielsweise, wie Embryonen im frühen Olein-Stadium die Expression einer Art von medizinischem Tula-Eoin-Gen aufweisen, eine andere jedoch nicht. Ein besonderer Vorteil des somatischen Embryosystems besteht darin, dass die Umwandlung des Kallus durchgeführt werden kann, ohne eine ganze Pflanze zu regenerieren.

In der Tat, wie hier gezeigt. Beta-Glucuronidase kann verwendet werden, um die Genexpression in den verschiedenen Stadien der Embryogenese sichtbar zu machen. Nachdem Sie sich das Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Pod auswählen und deaktivieren, um Andres zu erhalten.

Sie sollten auch ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen sterilen Explan für die somatische Embryogenese nach ihrer Entwicklung vorbereiten und platten. Diese Techniken haben es ermöglicht, die Transkriptionsregulation der frühen Stadien der Embryogenese in Bezug auf die Entwicklung des Embryonenwachstums und die Nährstoffspeicherung zu untersuchen.