Name: Upright-Imaging von Drosophila Egg Chambers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Lernen Sie die Upright-Imaging-Methode für hochauflösende Visualisierung von Drosophila-Eikammern. Diese Technik ermöglicht direkte Einblicke in die zelluläre Organisation des follikulären Epithels.

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Wir schätzen die Unterstützung von Mitgliedern der Fliegengemeinschaft, insbesondere von Dr. Denise Montell, Dr. Lynn Cooley und Dr. Pernille Rorth, für Reagenzien. Wir danken Flybase, dem Bloomington Drosophila Stock Center und der Developmental Studies Hybridoma Bank für die Informationen und die Bereitstellung von Fliegenbeständen bzw. Antikörpern. LM wird durch das Department of Education Grant, das Graduate Assistance in the Areas of National Need (GAANN) Training Fellowship (P200A120017) und durch eine NIGMS-Initiative zur Maximierung des Student Development Grant (2 R25-GM55036) unterstützt. Ein Teil der Mikroskopiearbeiten wurde durch den NSF MRT-Zuschuss DBI-0722569 und die Keith R. Porter Core Imaging Facility unterstützt. Die Forschung wurde teilweise durch einen NSF CAREER Award (1054422) und einen Basil O'Connor Starter Scholar Award des March of Dimes unterstützt, die beide an MSG verliehen wurden.

1. Präparation Ovariolen <ol><li> Übertragen Sie etwa fünfzehn 2-4 Tage alte weibliche Fliegen und ein paar Männer auf eine frische fliegen Essen Fläschchen mit Mehr Trockenhefe. Verwenden Baumwolle als Plugin für die Fläschchen, und fügen Sie ein paar Tropfen Wasser auf die Baumwolle, die Luftfeuchtigkeit hoch zu halten. </li><li> Ort Vial in einem 25 ° C Inkubator für 14-16 h, um die Anzahl der Stufe 8-10 Eikammern maximieren. Hinweis: Die Inkubationszeit variiert je nach Temperatur und gewünschte Bühne. </li><li> Bereiten Dissektion Medien, 0,1 M KPO 4 und NP40 Lösungen für den nächsten Tag erforderlich (siehe Materialien). </li><li> Anesthetize die Fliegen mit CO 2, und legen Sie unter einem Dissektionsmikroskop. Pipette einige Tropfen Dissektion Medien in jeden Hohlraum in der Glas Depression Rutsche. </li><li> Halten Zange in jeder Hand in einem ca. 30 ° Winkel zur Tischplatte und orientieren eine weibliche Fliege mit den Flügeln nach unten. Mit Ihrer nicht-dominanten Hand, nehmen Sie den weiblichen mit einer Pinzette, greifen sie an der einnterior des Bauches, in der Nähe des Brustkorbs, und tauchen sie in die Dissektion Medien in der Vertiefung Schieber (1A Einschub). </li><li> Mit der anderen Pinzette, fassen Sie das Exoskelett an der ventralen posterioren des Bauches und durch durchbohren. Besorgen Sie sich die Eierstöcke am hinteren Ende, und ziehen Sie sie aus dem Bauch und legen Sie die frische Medien auf der anderen Seite der Mulde Rutsche. (1A kleines Bild). Vermeiden Auseinanderziehen des Darms. Entsorgen Sie die Karkasse. </li><li> Wiederholen Sie mit den anderen weiblichen Fliegen bis alle Eierstöcke seziert werden. Entsorgen Sie die Männer. </li><li> Mit einer Pinzette, halten Sie ein Eierstock am hinteren Ende (in der Nähe der größten Ei Kammern), und mit der anderen Hand mit einem Pinzette zu einem der vordersten Ei Kammern (Germarium) einklemmen. (1A). </li><li> Langsam und stetig, ziehen eine Ovariole Kette aus dem Eierstock Scheide. Weiterhin individuell sezieren Ovariolen bis alle gewünschten Ei Kammern removed. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,7-1,8 für alle seziert Eierstöcke. </li><li> Wenn Sie fertig sind, übertragen Ovariolen auf eine 0,6 ml Tube mit einem Kunststofftransferpipette. </li><li> Lassen Ovariolen setzen sich am Boden der Röhre, dann nach Fixierung und Färbung Schritten fortfahren. </li></ol> 2. Immunfluoreszenz (IF) Färbung von Ovariolen <ol><li> Dissektion Medium vorsichtig aus Ovariolen mit einer Pipette. Achten Sie darauf, keine Ovariolen oder Eikammern entfernen. Lassen Sie ca. 50 ul Ovariolen und Dissektion Medien. </li><li> In 50 ul von 16% Paraformaldehyd und 150 ul 0,1 M KPO 4 Puffer in einem Rohr, und fügen Lösung Eikammern, sie zu beheben. Inkubation unter Schütteln für 10 min. ACHTUNG: Para ist giftig. </li><li> Entfernen Fixiermittel und spülen Sie zweimal mit 0,5 ml NP40 Waschpuffer. </li><li> Zweimal für 15 Minuten jeweils bei RT waschen. </li><li> Siehe Standard-ZF-Protokoll 15 für den nachfolgenden Schritten. <ol><li> Kurz nach der Fixierung, fügenPrimärantikörper an den geeigneten Verdünnungen inkubieren O / N bei 4 ° C. In NP40 mehrmals waschen, dann fügen Sekundärantikörper (1: 200 Verdünnungen). </li><li> Mehrmals waschen in NP40, dann fügen Sie DAPI (1: 1000) für 10 Minuten, dann wiederholen Wäschen. Sobald IF-Protokoll abgeschlossen ist, fügen Sie 200 ul von 50% Glycerin in PBS zu Eikammern und lassen Sie sich bei Raumtemperatur für 2 Std. </li><li> Entfernen Lösung, ersetzen Sie es mit 70% Glycerin in PBS und mit Folie abdecken. Zeigen Probe bei 4 ᵒC bis einbaufertig. Unterdessen mit Schritt 3 fortfahren. </li></ol></li></ol> 3. Geleistete Vorbereitung von Glycerin Jelly Slides <ol><li> Messen Sie mindestens 4 ml Gelee Glycerin mit einem Spatel und füllen ein Glas Zellkulturröhrchen in die Halbmarathonmarke. Schmelzen Glycerin Gelee in einem Wasserbad bei 55 ° C für 30 min. </li><li> Gießen Sie einen kleinen Tropfen Glycerin, etwa 300 &amp; mgr; l aus der Stammlösung auf zwei Objektträgern. Mit einem Gewebe, verbreiten Glycerin in einer dünnen layer über jede der Folien. Dies liefert eine Basis und ermöglicht die einfache Entfernung von Glycerin Gelee in Schritt 5.6. </li><li> Schneiden Sie die Spitze aus einer gefilterten 1.000 ul Pipettenspitze. Verwenden Schnitt Pipettenspitze 1000-1500 ul warmen Glycerin Gelee langsam auf jedem Objektträger übertragen. Achten Sie darauf, um Blasen zu vermeiden. </li><li> Lassen Glycerin Gelee Folien sitzen für 5 Minuten bei Raumtemperatur eingestellt. </li><li> Platzieren Sie jede Glycerin Gelee Folie in 60 mm x 15 mm Petrischale und mit Plastikfolie abdecken. Bei 4 ° CO / N. Optional Speicher Glycerin Gelee Folien für bis zu 5 Tage bei 4 ° C. </li></ol> 4. Montage Egg Chambers <ol><li> Mit Proben aus Schritt 2.5, Pipette mehr 3 ul Tropfen Eikammern in 70% Glycerin in einem Glycerin Gelee Rutsche. Weiter Pipettieren 3 ul Tropfen, bis alle Eier Kammern sind auf dieser Folie. Stellen Sie sicher, jeder Tropfen mindestens zehn Eikammern. Inzwischen Hitze ein Kulturröhrchen aus Glycerin Gelee in einem 55 ° C Wasserbad. </li><li> Stellen Sie das Glycerin Gelee Rutsche mit Ei Kammern unter einem Dissektionsmikroskop. Einstellen der Vergrößerung, so daß nur ein Tropfen Eikammern ist in dem Sichtfeld (1B). </li><li> Mit einer 30-Gauge-Nadel, wie einem Löffel, nehmen Sie die gewünschte Stufe Eikammer. Wenn nötig, separate gewünschten Ei Kammern von einem Ovariole Kette mit Hilfe der Nadel wie ein Messer. </li><li> Um Verunreinigungen, die mit einer Abbildungs ​​stören können, zu vermeiden, übertragen das Ei Kammer zur zweiten Glycerin jelly Schieber mit dem vorderen zugewandt links (1E -1). Wiederholen, bis es mindestens sieben Eikammern reihen sich in einer Spalte (Abbildung 1C). </li><li> Bilden neue Spalten von sieben bis alle gewünschten Eikammern werden dem zweiten Glycerin jelly Träger übertragen. </li><li> Reißen Sie ein kleines Stück Gewebe und Twist. Verwenden Sie diese Option, um das überschüssige PBS-Glycerin von den Ei Kammern durch leichtes Berühren jeden einzelnen zu absorbieren. Achten Sie darauf, Eikammern nicht entfernen. </li><li> Schneiden Sie dieSpitze eines gefilterten 200 ul Pipettenspitze. Verwenden Sie diese Funktion, um 150 ul Glycerin Gelee, um alle Spalten der Eikammern decken zu übertragen. HINWEIS: Die Menge an Glycerin Gelee benötigt, um die Säulen zu decken auf Eikammer Stufen und die Anzahl der Säulen. Menge eingestellt werden kann. </li><li> Lassen montiert Eikammern sitzen für 5 min bei RT, bis die obere Schicht aus Glycerin Gelee vollständig verfestigt (1D). </li><li> Den Objektträger montiert Ei Kammern in einem 60 mm x 15 mm Petrischale und mit Plastikfolie abdecken. Lagerung bei 4 ° CO / N, damit die Glycerin Gelee Schichten (in der dunklen Ort, wenn es Bedenken über Photobleaching) zusammen zu verfestigen. </li></ol> 5. Herstellung von Egg Chambers for Imaging <ol><li> Zeigen Schieber montiert Ei Kammern unter einem Dissektionsmikroskop. Einstellen der Vergrößerung, so daß nur eine Spalte Eikammern ist in dem Sichtfeld. </li><li> Mit einem Winkel von 45 ° Miniatur Skalpell, schneiden Sie ein straight Linie entlang der rechten Seite der ersten Spalte Eikammern (nahe der hinteren Seite der Eikammern). (1D-E) </li><li> Als nächstes wird über der ersten Eierkammer an der Oberseite und unter der letzten Eikammer in der Spalte geschnitten. An diesem Punkt der Spalte Eikammern sollte auf drei Seiten geschnitten werden. </li><li> Verwendung eines microknife, Scheibe entlang der linken Seite der Säule, so nahe wie möglich an der vorderen Seite der Eikammern (1E -3). </li><li> Je 100 ul kaltem 1X PBT über die Schnitt Spalte. </li><li> Verwenden Sie einen abgerundeten Kanten Spachtel, um das überschüssige Glycerin Gelee um drei Seiten des Schnittes Spalte Eikammern und entsorgen zu entfernen, während der Rest auf der Folie. </li><li> Stecken Sie den Spachtel in den Schnitt an der vorderen Seite des Eier Kammern und trennen Sie die Spalte aus der Primär Glycerin Gelee Block. </li><li> Bereiten Proben entweder invertiert (5.8.1) oder stehend (5.8.2) Mikroskopie. <ol><li> Für Inverses Mikroskop: Transfer ter Spalte Eikammern zu einem Deckglas mit vorderen Seite Eikammern nach unten. Die Schritte 5.2-5.8, bis alle Spalten von Glycerin Gelee wurden entfernt und gelagert. Fügen Sie ein paar Tropfen 50% PBS-Glycerin auf jeden Block von Eikammern, um sie vor dem Austrocknen zu schützen. Bild Eikammern direkt auf Deckglas. </li><li> Für aufrechten Mikroskop: Übertragen Sie die Spalte von Ei Kammern auf einen Objektträger mit der vorderen Seite nach oben ein. Die Schritte 5,2-5,9, bis alle Spalten von Glycerin Gelee wurden entfernt und auf Objektträgern montiert. Fügen Sie ein paar Tropfen 50% PBS-Glycerin auf jeden Block von Ei Kammern und Deckblöcke mit einem # 1 ½ Deckglas. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Hier beschreiben wir eine Methode zu montieren und Bild klein, entwickelt Eikammern von einer End-on-Perspektive. Gemeinsame Methoden zur Bildgebung Ei Kammern für Seitenansichten optimiert und vor allem ermöglichen eine präzise Visualisierung von mediolaterale Follikelzellen, wenn mit fluoreszierenden Antikörpern gefärbt. Die Verwendung von Z-Stapeln oder 3-D-Rekonstruktion Hilfsmittel in Anzeigen mehrerer Brennebenen, aber ist immer noch für subzelluläre Auflösung der Pole des elliptischen Eikammern (2D)</stro...

Studium der Drosophila melanogaster hat große Einblicke in die genetische Regulation einer Vielzahl von Phänomenen ist. Insbesondere gab es umfangreiche Forschung auf Ei-Entwicklung, da Oogenese eine tractable Weg zu vielen verschiedenen Entwicklungsprozessen, einschließlich Gewebe Strukturieren Zellpolaritätswechsel, Zellzyklus-Schalt und translationale Regulation 1,2,3,4 untersuchen. Ein wichtiger morphogenic Ereignis während der Oogenese ist die Spezifikation, den Erwerb von Motilität und Migration aus einem Satz von Zellen, die sogenannten Randzellen (in 5 überprüft). Da Zellmigration ist ein Schlüsselmerkmal von tierischen Morphogenese und weil die genetische Regulation dieses Prozesses ist gut konserviert, sind wahrscheinlich auch in anderen Zusammenhängen wichtig Mechanismen in Fliegen bestimmt. So untersuchen wir die molekularen Kontrolle der Grenzzellmigration. Für unsere Untersuchungen haben wir eine neue Methode, um die vorderen Pole der sich entwickelnden Eier Beobachtung entwickelt,denen Grenz Zellen entstehen, zu untersuchen, wie sie im Detail zu entwickeln. Innerhalb der Eierstöcke, Eikammern bei verschiedenen Entwicklungsstadien existieren entlang Ketten genannt Ovariolen, die in einer dünnen Hülle (1A) umhüllt sind. Jedes Ei Kammer wird weitergehen, um ein Ei zu bilden. Während der Oogenese, müssen mehrere unterschiedliche Zelltypen in einer koordinierten Art und Weise zu entwickeln. Die D. melanogaster Eikammer aus 16 Keimlinien-Zellen, einschließlich einer Eizelle von einem einlagigen Follikelepithels 6 umgeben. Eine kleine Anzahl von spezialisierten Zellen, die so genannte polare Zellen, entstehen an den vorderen und hinteren Pole des Epithels. Die 6-8 enden Zellen stammen im anterioren Epithel der Eierkammer, von den Polarzellen 5,7 induziert. Mitte der Oogenese (Stufe 9), die Grenzzellen lösen sich von ihren Nachbarn und wandern zwischen den Nährzellen, die Eizelle an der hinteren der Eikammer 5,7 zu erreichen. Diese Bewegung muss erreicht werden,während die Grenzzellen in einer Cluster-Umgebung zwei unbewegliche Polarzellen, so dass dies eine Art kollektive Zellmigration. Erfolgreiche Migration der Grenzzellverband sorgt für die richtige Entwicklung der Mikropyle der Eierschale, die für die Befruchtung notwendig ist. Die vorderen polare Zellen anweisen Grenzzellschicksals durch die Aktivierung eines Signalübertragungskaskade. Polar Zellen eine Cytokin, ungepaarte (UPD), die zu einer Transmembranrezeptor, Domeless (DOME) bindet, auf benachbarte Follikelzellen in Stufe 8 von Oozytenentwicklung 8,9. Die Bindung von UDP verursacht Janus Tyrosin-Kinase (JAK), um das Signal Transducer und Aktivator der Transkription (STAT) 8,10,11 phosphorylieren. STAT bewegt sich dann in den Kern, um die Transkription zu aktivieren. Langsam Border Cells (SLBO) ist ein Transkriptionsfaktor, der eine direkte transkription Ziel von STAT ist und wird auch für die Grenzzellmigration 12 erforderlich. Seitenansichten Eikammern zeigen that STAT-Aktivität wird in einem Gradienten über die vordere Epithel 8,11,13 geregelt. Follikelzellen nächsten zu den polaren Zellen die höchste aktiviert STAT, damit sie sich Randzellen und dringen in den benachbarten Keimbahngewebes. Um zu verstehen, wie die Grenzzellen innerhalb festgelegter und nehmen Sie aus dem Epithel, müssen wir beobachten, wie sich das Gewebe organisiert. Wenn wir sehen Eikammern von einer anterioren-on Sicht würden wir radiale Symmetrie der STAT-Aktivität in den Follikelzellen rund um die Polarzellen erwarten. Eine End-Ansicht würde auch genauer Unterschiede von Membranproteinen und Zell-Zell-Interfaces zeigen vor und während der Ablösung als Vergleich die Zellen in unterschiedlichen Brennebenen. Da Eikammern sind länglich und miteinander durch Stiel Zellen angebracht, auf Objektträger nieder sie seitlich, so dass es schwierig ist, den vorderen Architektur zu beobachten. So viele Informationen über die Zellen, an den Polen des Eies Kammerwurde von Seitenansichten abgeleitet. Obwohl einige Informationen durch algorithmische 3-D-Rekonstruktionen von optischen Schnitten, Lichtstreuung, Photobleaching und schlechtere Auflösungsgrenzen in der Z-Achse erhalten werden diese Angaben weniger detailliert und zuverlässig in der Abwesenheit von teuren Techniken wie superauflösende Mikroskopie 14 . Andere Arten von Abschnitt basierten Bildgebung (beispielsweise Elektronenmikroskopie oder Mikrotom Schnitte) erfordert umfangreiche Manipulation von Geweben, einschließlich Entwässerung, was die Wahrscheinlichkeit für Artefakte. So eine neue Methode zur Bild D. entwickelten wir melanogaster Eikammern während aufrecht. Diese Methode hat sich bereits bei der Aufklärung, wie bewegliche Zellen sind vom Schicksal bestimmt (siehe Repräsentative Ergebnisse und Manning et al, im Berichts) bewährt und dürfte im weiteren Sinne wertvoll in Studien anderer Aspekte der Oogenese sein.

<table><tbody><tr><td>0,1 M Kaliumphosphatpuffer (KPO4 Puffer)</td><td></td><td></td><td>Fügen Sie 3,1 g NaH2PO4&bull; H2O und 10,9 g Na2HPO4 (wasserfrei) zu destilliertem H2O zu einem Volumen von 1 L. Der pH-Wert der endgültigen Lösung beträgt 7,4. Dieser Puffer kann bis zu 1 Monat bei 4 °C gelagert werden.</td></tr><tr><td>16% wässrige Paraformaldehyd-Lösung, EM-Qualität</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15710</td><td>methanolfrei zur Konservierung von GFP-Fluoreszenz</td></tr><tr><td>30G x 1/2 Zoll Nadel&nbsp;</td><td>VWR</td><td>BD305106</td><td>Regular bevel</td></tr><tr><td>Active Dry</td><td>Yeast Genesee Scientific</td><td>62-103</td><td>Zur Mast weiblicher</td></tr><tr><td>Fliegen Rinderserum Albumin</td><td>PAA-Zellkultur-Firma</td><td>A15-701</td><td>Verwendet in NP40 Wash Buffer</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td>Dumostar Legierung, biologische Spitze; scharfe Spitzen sind für die Ovariolendissektion unerlässlich</td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>5 mg/ml Stammlösung&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td>Zugabe zum Präpariermedium (10%)&nbsp;</td></tr><tr><td>Glaskulturröhrchen</td><td>VWR</td><td>47729-576</td><td>14 ml</td></tr><tr><td>Glas-Depressionsobjektträger</td><td>VWR</td><td>470019-020</td><td>1,2 mm dick, Double Cavity</td></tr><tr><td>Glycerin Jelly&nbsp;</td><td>Electron Microsocpy Sciences</td><td>17998-10</td><td>Eindeckmedien</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>IBI Scientific</td><td>IB15760</td><td>70% in PBS</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-500ML</td> <td>(austauschbar für Nonidet P-40) &nbsp; Wird in NP40 Waschpuffer verwendet&nbsp;</td></tr><tr><td>Leica Fluoreszierendes Stereoskop</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica SP5 Konfokalmikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>40x/0.55NA Trockenobjektiv&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikrospatel &nbsp;</td><td>VWR</td><td>82027-518</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl-Objektträger</td><td>VWR</td><td>16004-368</td><td>75x25x1</td></tr><tr><td>mm NP40 Waschpuffer</td><td></td><td></td><td>50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0,5 % Ipegal, 1 mg/ml BSA und 0,02 % Natriumazid</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Glutamin</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td>Hinzugefügt zur Ergänzung des Dissektionsmediums (0,6X)</td></tr><tr><td>Petrischale-Polysterin, steril</td><td>VWR</td><td>82050-548</td><td>60 B x 15 H mm</td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td><td>10 Packungen Pulver</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat zweibasig</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786-500G</td><td>Verwendet in 0,1 M KPO4 Puffer&nbsp;</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791-500G</td><td>Verwendet in 0,1 M KPO4 Puffer&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[Kopf]</td></tr><tr><td>Schneider' s Insect Medium</td><td>Life Technologies</td><td> 11720018</td><td>mit L-Glutamin und Natriumbicarbonat</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>Wird in der Fluoreszenz-Antikörperfärbung</td></tr><tr><td>verwendet Natriumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014-500G</td><td>Verwendet in NP40 Waschpuffer</td></tr><tr><td>TRIS-HCl</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70144</td><td>1 m TRIS-HCl, pH 7,4</td></tr><tr><td>Volocity 3D-Bild Analysesoftware</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Für die Bearbeitung von konfokalen Z-Stapeln</td></tr></tbody></table>

upright-imaging von<em&gt; drosophila</em&gt; egg chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Die Oogenese von Drosophila melanogaster bietet einen idealen Kontext für die Untersuchung verschiedener Entwicklungsprozesse, da der Eierstock relativ einfach in der Architektur ist, gut charakterisiert ist und für genetische Analysen zugänglich ist. Jede Eikammer besteht aus Keimbahnzellen, die von einer einzigen Epithelschicht aus somatischen Follikelzellen umgeben sind. Untergruppen von Follikelzellen differenzieren sich in bestimmten Stadien zu mehreren verschiedenen Zelltypen. Standardtechniken ermöglichen in erster Linie einen seitlichen Blick auf die Eikammern und damit auf die Organisation und Identität der Follikelzellen. Das Upright Imaging Protocol beschreibt eine Montagetechnik, die eine neuartige, vertikale Ansicht von Eikammern mit einem konfokalen Standardmikroskop ermöglicht. Die Proben werden zunächst zwischen zwei Schichten Glyceringelee in einer lateralen (horizontalen) Position auf einen Glasobjektträger montiert. Das Gelee mit den umhüllten Eikammern wird dann in Blöcke geschnitten, auf ein Deckglas gegeben und umgedreht, um die Eierkammern aufrecht zu positionieren. Montierte Eikammern können entweder mit einem aufrechten oder einem inversen konfokalen Mikroskop abgebildet werden. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der Spezifikation, Organisation, molekularen Marker und Eizellentwicklung von Follikeln mit neuen Details und aus einer neuen Perspektive.

Die aufrechte bildgebenden Verfahrens konnten wir direkt die Organisation von Zellen in der vorderen Follikelepithels auf Stufe 8 zu sehen Ein allgemeiner Marker für Follikel Zellschicksal, die Augen Absent (EYA) Protein, sowie die Kern-DNA-Marker DAPI, hat auch Ausdruck in diesem Bereich der Zellen, und zeigten, dass alle Zellen könnten mit ähnlichen Färbungsintensitäten (2B &#39;) zu sehen ist. Proteine, die in Reaktion auf das Cytokin UPD reguliert zeigten jedoch erlichen Muster Expressionsniveaus. P...

Die in diesem Protokoll beschriebene aufrechte Bildgebungsmethode ermöglicht die detaillierte Visualisierung der Pole eines sich entwickelnden Drosophila melanogaster-Eies. Diese End-on-Ansicht bietet eine neue Perspektive auf die Anordnungen und Morphologien mehrerer Zelltypen im follikulären Epithel.

Upright-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die hochauflösende Abbildung der Pole von Drosophila-Eikammern zu ermöglichen. Dies wird zunächst durch die Dissektion der Ovarien und deren Färbung mit fluoreszierenden Antikörpern erreicht. Der zweite Schritt besteht darin, die gewünschten Eikammern zu identifizieren und zu isolieren.Als Nächstes werden ausgewählte Proben orientiert und ausgerichtet und dann in Glycerin-Gelatine-Blöcken eingebettet. Im letzten Schritt werden die Blöcke geschnitten und gedreht, um die Eikammern so zu montieren, dass ihre Längsachse vertikal steht. Abschließend kommt die konfokale Mikroskopie zum Einsatz, um die zelluläre und subzelluläre Organisation an den Polen der Eikammer sichtbar zu machen.Epithelien, wie Anordnungen von Randzellen, lassen sich mit bestehenden Methoden, bei denen Proben senkrecht zur Abbenebene mittels optischer Schnitte und algorithmischer 3D-Rekonstruktion betrachtet werden, nur eingeschränkt darstellen, da diese Verfahren zu Photobleichen und Lichtstreuung führen und eine geringere Auflösung bieten, was weniger genaue Bilder ergibt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, Proben in einem neuen Winkel zu montieren und sie direkt zu betrachten. Mithilfe dieser Technik bilden wir die Pole sich entwickelnder Eikammern ab, was Einblicke in die Organisation der Follikelzellen ermöglicht.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Vorbereitungs- und Montageschritte aufgrund der mikroskopischen Manipulation von Färbeproben und der Neuausrichtung der Proben aus konventionellen Blickwinkeln schwer zu erlernen sind. Die Durchführung des Verfahrens übernimmt Lathea Manning, eine Doktorandin in meinem Labor. Um das Experiment zu beginnen, nehmen Sie einen Glas-Tropftrichter und pipettieren Sie mehrere Tropfen des Dissektionsmediums in jede Vertiefung.Betäuben Sie die Fliegen mit Kohlendioxid und legen Sie sie unter ein Stereomikroskop. Orientieren Sie anschließend eine weibliche Fliege mit den Flügeln nach unten und dem Kopf nach links. Halten Sie die Pinzette in jeder Hand in einem Winkel von 30 Grad zur Tischoberfläche, wobei die nicht-dominante Hand die Pinzette führt.Nehmen Sie die Fliege mit einer Pinzette auf. Halten Sie die Fliege am vorderen Abdomen nahe am Thorax fest und tauchen Sie sie in das Dissektionsmedium ein, in der Vertiefungsscheibe mit dem anderen Paar Pinzetten.Greifen Sie das Exoskelett an der ventralen Hinterseite des Abdomens und stechen Sie hindurch. Fassen Sie die Ovarien am hinteren Ende an und ziehen Sie sie aus dem Abdomen heraus, um sie anschließend in das frische Medium auf der anderen Seite des Vertiefungsröhrchens zu legen. Halten Sie dann ein Ovar am hinteren Ende nahe den größten Eikammern fest und kneifen Sie mit der anderen Hand langsam und gleichmäßig eine der vordersten Eikammern oder Jamer ab.Ziehen Sie eine Eibläschenkette aus der Eierstockhülle heraus und dissezieren Sie die Eibläschen einzeln weiter, bis alle gewünschten Eikammern entfernt sind. Sobald die Dissektion abgeschlossen ist, überführen Sie mit einer Plastik-Transferpipette das Eibläschen in ein 0,6-Milliliter-Röhrchen und lassen Sie es auf den Boden des Röhrchens absinken. Entfernen Sie vorsichtig mit einer Pipette so viel wie möglich vom Dissektionsmedium aus dem Eibläschen.Stellen Sie sicher, dass keine Ovariole oder Eikammern in ein neues Röhrchen übertragen werden. Geben Sie 50 µL 16 % Paraformaldehyd zu 150 µL 0,1 molarer Kaliumphosphatpufferlösung hinzu und fügen Sie diese Mischung zu den Eikammern hinzu. Inkubieren Sie sie unter Schütteln für 10 Minuten. Nach der Inkubation entfernen Sie das Fixans.Zweimal mit NP-40-Puffer spülen, anschließend zwei Mal über Aerials mit jeweils 0,5 Milliliter NP-40-Puffer für jeweils 15 Minuten bei Raumtemperatur waschen. Nach Fixierung und Waschen die primären Antikörper hinzufügen und die Ovale über Nacht bei vier Grad Celsius oder drei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation die Proben viermal jeweils 20 Minuten lang mit 0,5 Milliliter NP-40-Puffer bei Raumtemperatur waschen.Anschießend sekundäre Antikörper in einer Verdünnung von 1 zu 200 hinzufügen und das Gefäß drei Stunden oder über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Danach DPI in einer Verdünnung von 1 zu 1000 hinzufügen und das Gefäß 10 Minuten lang inkubieren. Anschließend die Proben viermal mit jeweils 0,5 Milliliter NP-40-Waschpuffer je Waschdurchgang über jeweils 20 Minuten bei Raumtemperatur waschen.Nach Abschluss des Immunfluoreszenz- oder IF-Protokolls 200 Mikroliter 50 % Glycerin in PBS zu den Eikammern geben und zwei Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln stehen lassen. Die Lösung entfernen, dann durch 70 % Glycerin in PBS ersetzen und das Röhrchen mit Aluminiumfolie abdecken. Die Proben bei vier Grad Celsius lagern, bis sie zur Einbettung bereit sind.Um die Glycerin-Gelee-Schiebeportion vorzubereiten, Glycerin-Gelee mit einem Spatel abmessen, um ein 15-Milliliter-Pyrex-Glaskulturrohr etwa zur Hälfte zu füllen, und das Glycerin-Gelee 30 Minuten lang in einem Wasserbad bei 55 Grad Celsius schmelzen. In der Zwischenzeit einen 300-Mikroliter-Tropfen Glycerin aus der Stammlösung auf zwei Objektträger geben. Mit einem Tuch das Glycerin in einer dünnen Schicht über jeden der Objektträger verteilen.Um eine Basis zu schaffen, die das einfache Entfernen des Glyceringels ermöglicht. Überprüfen Sie, ob das Glyceringel vollständig geschmolzen ist. Schneiden Sie anschließend die Spitze einer gefilterten 1000-Mikroliter-Pipettenspitze ab und übertragen Sie langsam 1000 bis 1.500 Mikroliter warmes Glyceringel auf jeden Objektträger, wobei Sie darauf achten, Blasenbildung zu vermeiden.Lassen Sie die Glycerin-Gelatine-Präparate fünf Minuten bei Raumtemperatur stehen, um das jeweilige Glycerin-Gelatine-Präparat fest werden zu lassen. Legen Sie jedes Präparat in eine 60 mm × 15 mm große Petrischale. Decken Sie die Schale mit Frischhaltefolie ab und lagern Sie die Präparate über Nacht bei vier Grad Celsius.Pipettieren Sie mehrere Tropfen mit je drei Mikrolitern Eikammern aus den zuvor vorbereiteten Proben in 70 % Glycerin auf eine Glycergelatine-Objektträger. Fahren Sie mit dem Pipettieren von Tropfen à drei Mikrolitern fort, bis alle Eikammern auf dem Objektträger sind, und stellen Sie sicher, dass jeder Tropfen mindestens 10 Eikammern enthält. Erwärmen Sie anschließend ein Reagenzglas mit Glycergelatine in einem Wasserbad auf 55 °C, legen Sie einen Glycergelatine-Objektträger mit Eikammern unter ein Stereomikroskop und stellen Sie die Vergrößerung so ein, dass nur ein Tropfen mit Eikammern im Sichtfeld sichtbar ist.Verwenden Sie eine Nadel mit 30er Gauge-Größe als Löffel, um bei Bedarf die gewünschte Eikammer im entsprechenden Entwicklungsstadium aufzunehmen. Trennen Sie die gewünschten Eikammern mithilfe der Nadel als Messer von einer ovarialen Kette, um Verunreinigungen zu vermeiden, die die Bildgebung stören könnten. Überführen Sie die Eikammer auf die zweite Glycerin-Gelee-Präparatplatte.Wiederholen Sie diesen Schritt, bis mindestens sieben Eikammern in einer Spalte ausgerichtet sind, wobei die vorderen Seiten nach links zeigen. Entfernen Sie mit der Nadel Schmutz oder unerwünschte Eikammern und bilden Sie neue Spalten aus sieben, bis alle gewünschten Eikammern auf den zweiten Glycerin-Gelatine-Objektträger übertragen wurden. Wickeln Sie ein kleines Stück Kim-Tuch auf, und saugen Sie dann vorsichtig den überschüssigen PBS-Glycerin-Gemisch von den Eikammern ab, indem Sie jede einzelne leicht berühren. Achten Sie darauf, keine Eikammern zu entfernen.Schneiden Sie die Spitze einer 200-Mikroliter-Filterpipettenspitze ab und übertragen Sie 150 Mikroliter Glyceringel, um alle Spalten der Eikammern zu bedecken. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob alle Spalten der Eikammern bedeckt sind. Lassen Sie die präparierten Eikammern fünf Minuten bei Raumtemperatur ruhen, bis die oberste Schicht des Glyceringels vollständig erstarrt ist.Danach eine Objektträgerpräparation mit angehefteten Eikammern in eine 60 Millimeter mal 15 Millimeter große Petrischale geben und mit Plastikfolie abdecken. Die Schale über Nacht bei vier Grad Celsius lagern, um die Zusammenlagerung der Glyceringel-Schichten im Dunkeln zu ermöglichen. Falls eine Photobleiche auftreten könnte, eine Objektträgerpräparation der angehefteten Eikammern unter ein Stereomikroskop stellen.Stellen Sie die Vergr&ouml;&szlig;erung so ein, dass nur eine Spalte von Eikammern im Sichtfeld ist. Schneiden Sie mit einem winzigen Skalpell in einem Winkel von 45 Grad entlang der rechten Seite der ersten Spalte von Eikammern nahe der posterioren Seite der Eikammern eine gerade Linie.Schneiden Sie anschließend oberhalb der ersten Eikammer an der Spitze und unterhalb der letzten Eikammer in der Säule, sodass die Eikammern nun an drei Seiten durchtrennt sind. Verwenden Sie ein Mikromesser, um entlang der linken Seite der Säule möglichst dicht an der vorderen Seite der Eikammern entlangzuschneiden. Pipettieren Sie dann 100 Mikroliter kaltes 1×PBST über die durchtrennte Säule mit einem Rundspatel.Entfernen Sie das überschüssige Glycerin-Gel an den drei Seiten der durchtrennten Eikammer-Säule und entsorgen Sie es. Führen Sie das Spatel in den Schnitt an der vorderen Seite der Eikammern ein und lösen Sie die Säule vom primären Glycerin-Gel-Block, um sie auf einem Objektträger zu montieren und mit der Bildgebung fortzufahren. Die aufrechte Bildgebungsmethode ermöglicht eine direkte Visualisierung der Zellorganisation im vorderen follikulären Epithel im Stadium acht.Ein allgemeiner Marker für Follikelsulfat, das Eyes absent oder IA-Protein, sowie der nukleäre DNA-Marker DAPI zeigen eine gleichmäßige Expression über dieses Zellfeld und belegen, dass alle Zellen mit ähnlichen Färbungsintensitäten sichtbar sind. Die konventionelle Ansicht einer Eikammer steht im Gegensatz zur Ansicht, die durch eine dreidimensionale Rekonstruktion der Eikammer entsteht. Die Einlage zeigt die gedrehte Achse.Die x-Achse zeigt nach unten. Die z-Achse zeigt nun nach links, und die y-Achse zeigt auf den Betrachter zu. Einzelne Zellen erscheinen unscharf aufgrund der geringen Auflösung in z-Richtung.Daher stellt der neue Ansatz eine bedeutende Verbesserung der Bildgebung dar. Die aufrechte Bildgebungsmethode visualisiert effektiv das vordere Epithel in Eikammern des Stadiums neun. In diesem Entwicklungsstadium aggregieren sich die Randzellen zusammen um die Polzellen.Diese verdichteten Ansammlungen werden mittels Endon-Bildgebung beobachtet. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Proben montiert werden, um neue Betrachtungsperspektiven zu ermöglichen. Mithilfe dieser Technik haben wir die Pole sich entwickelnder Eikammern in ausgewählten Entwicklungsstadien abgebildet.Diese allgemeine Technik könnte für andere Entwicklungsstadien von Drosophila, die Oogenese oder für andere Arten kleiner Gewebe verwendet werden.

upright-imaging-of-drosophila-egg-chambers

Research

Forschung

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Beschallung-erleichtert Immunfluoreszenzfärbungen der Late-Stage embryonalen und Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe<em&gt; In-situ</em

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Upright-Imaging von

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