Ein Großer Lateral Craniotomy Verfahren für Mesoskalige Breitfeld Optical Imaging von Hirnaktivität

Das übergeordnete Ziel dieser großen lateralen Kraniotomie besteht darin, Echtzeit-Aufnahmen über einen weiten Bereich eines kortikalen Hemisphärenabschnitts durchzuführen. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass große kortikale Areale zur Beobachtung freigelegt werden können und sie in Kombination mit Technologien wie der Optogenetik eingesetzt werden kann. Diese Technik kann Einblicke in die Charakterisierung der neuronalen Dynamik zwischen Zellen sowie zwischen verschiedenen Gehirnschaltkreisen auf unterschiedlichen zeitlichen und räumlichen Auflösungsstufen ermöglichen.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist aufgrund des erhöhten Risikos von Blutungen und kortikalen Schäden entscheidend, da die Dura häufig mit der Gehirnoberfläche und den Blutgefäßen verbunden ist. Diese Methode kann angewendet werden, um die neurobiologischen Mechanismen der Gehirnschaltkreisentwicklung sowie deren Veränderungen im Laufe des Lebens als Reaktion auf neue Erfahrungen oder Pathologien wie die Alzheimer-Krankheit oder Schlaganfall zu untersuchen. Um dieses Verfahren zu beginnen, autoklavieren Sie alle chirurgischen Instrumente und stellen Sie sicher, dass die Sterilität während der gesamten Operation aufrechterhalten wird.

Stellen Sie sicher, dass ausreichend Pufferlösung für das Gehirn für die Operation vorhanden ist. Überführen Sie anschließend eine anästhesierte Maus auf die Haltevorrichtung für den Kopf und platzieren Sie sie auf einer temperaturregulierenden Heizplatte, die auf 37 Grad Celsius eingestellt ist. Sichern Sie die oberen Zähne der Maus in einer Zahnhalterung.

Drehen Sie dann den Kopf um etwa 30 Grad nach links, um die rechte Seitenfläche des Kopfes freizulegen. Befestigen Sie anschließend den Kopf der Maus mit dem stumpfen Ende der Ohrstifte. Tragen Sie danach ein Augensalbe auf, um eine Austrocknung der Hornhaut zu verhindern.

Um das zerebrale Ödem zu reduzieren, injizieren Sie Dexamethason intramuskulär mit vier Milligramm pro Kilogramm. Wischen Sie die Haut über dem Operationsbereich dreimal mit in 4% Chlorhexidin getränkten Wattestäbchen ab, gefolgt von dreimaligem Abwischen mit 70% Alkohol. Injizieren Sie Lidocain subkutan über der Stelle der Kraniotomie.

Heben Sie unter einem Stereomikroskop die Haut mit einer Pinzette einen Millimeter links der Mittellinie direkt hinter dem Ohr an und führen Sie mit einer chirurgischen Schere einen kleinen horizontalen Schnitt durch. Führen Sie einen seitlichen Schnitt von fünf bis sechs Millimetern in Richtung des rechten Ohrs durch und schneiden Sie anschließend in Richtung des rostralen Endes des Kopfes. Setzen Sie die Schere am ursprünglichen Einschnitt an und schneiden Sie 10 Millimeter in rostraler Richtung.

Danach die Haut rund um das rechte Ohr und in der Nähe des rechten Auges schneiden, um die rechte Seite des Schädels und des Schläfenmuskels freizulegen. Sicherstellen, dass der breiteste Teil des freigelegten Bereichs mindestens sieben Millimeter beträgt. Anschließend die Haut weiter beschneiden, falls der Operationsbereich vergrößert werden muss.

Entfernen Sie mithilfe eines Wattestäbchens durch kreisförmiges Reiben die Periost von der Schädeloberfläche. Stellen Sie sicher, dass kein Periost mehr vorhanden ist und der Schädel vollständig trocken ist, was für eine erfolgreiche Befestigung der Kopfplatte entscheidend ist. Trennen Sie anschließend mit Feder-Scheren und einer Pinzette den Schläfenmuskel vom Schädel.

Schneiden Sie den Muskel lateral ab und ziehen Sie ihn zurück, bis er den Schuppenbein-Knochen erreicht. Achten Sie sorgfältig darauf, die oberflächliche Temporalvene, die entlang der Ebene des Schuppenbeins in der Nähe des Auges verläuft, nicht zu beschädigen, da sonst eine Blutung auftreten könnte. Stoppen Sie die Blutung mit Gelatineschwamm, der zuvor in Gehirnpuffer getränkt wurde.

Bei starker Blutung einen Hitzekoagulator verwenden. Butylcyanoacrylat-Kleber auf die blutenden Stellen tropfen lassen. Um dieses Verfahren zu beginnen, zuerst das Bregma markieren, um die zugrundeliegenden Hirnregionen zu orientieren, Ethylcyanoacrylat-Kleber entlang der unteren Kante der Kopfplatte auftragen und die Kopfplatte über dem Kraniotomiebereich verkleben.

Füllen Sie danach den entstandenen Zwischenraum zwischen Schädel und Kopfplatte mit Zahnzement, wobei nur der Kraniotomiebereich freigelassen wird. Warten Sie anschließend, bis der Zahnzement trocken und ausgehärtet ist. Umreißen Sie danach den Bereich des Schädel-Fensters, indem Sie die Oberfläche des Schädels leicht mit dem Zahnbohrer ritzen.

Verfolgen Sie die Bohrung vorsichtig entlang der ursprünglichen Markierung, um diese zu vertiefen, und stellen Sie sicher, dass das Bohrwerkzeug nicht durch den Schädel hindurch in das Gehirn eindringt. Wechseln Sie dabei alle paar Minuten zwischen dem Bohren und dem Abtupfen der Schädeloberfläche mit angefeuchteten, gerollten Tüchern. Dieser äußerst schwierige Beginn erfordert, dass Chirurgen durch den verhärteten Schädel bohren, um ihn zur Entfernung freizulegen, ohne den darunterliegenden Kortex zu beschädigen.

Langsam ist locker, gleichmäßig ist schnell. Überprüfen Sie während des Bohrens regelmäßig, ob der Schädel durch Druck nachgibt, indem Sie vorsichtig mit der Pinzette oder dem stillstehenden Bohrer darauf drücken. Sobald das Knochengewebe nachzugeben beginnt, stellen Sie das Bohren ein und tauchen Sie das gesamte Fenster in Gehirnpuffer ein.

Warten Sie mindestens fünf Minuten vor der Entfernung des Schädels, um den Knochen weicher zu machen und die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass die Dura am Knochen haftet, wodurch der Vorgang der Schädelentfernung erleichtert wird. Führen Sie danach die Schädelentfernung beginnend an der vorderen Kante durch. Lösen Sie vorsichtig den lockeren Schädel mithilfe einer Pinzette von der Dura.

Sobald der Knochen lose ist und auf der Dura liegt, diesen mit der Pinzette festhalten und vorsichtig von der Dura abheben. Stellen Sie sicher, dass der Knochen niemals in das Gehirn eindringt. Benutzen Sie die Pinzette und die Feder-Schere, um die Dura vorsichtig aufzureißen und wegzuschneiden.

Es ist darauf zu achten, dass das Hirnparenchym und die Blutgefäße nicht beschädigt werden. Setzen Sie den Vorgang fort, bis die Dura an der Stelle des Schädel-Fensters vollständig entfernt ist. Bei korrekter Durchführung erscheint das Gehirn sehr sauber mit deutlich sichtbaren Blutgefäßen und ohne Verfärbungen oder Beschädigungen.

Besprühen Sie die Deckglas mit 70 % Ethanol und trocknen Sie es vorsichtig mit einer Druckluftdose. Stellen Sie sicher, dass das Glas vollständig sauber ist und keine Flecken oder Staubpartikel aufweist. Bereiten Sie anschließend 1,3 % Agarose vor, indem Sie 200 Milligramm Agarosepulver in 15 Milliliter Gehirnpuffer erhitzen.

Platzieren Sie ein Thermometer in dem heißen Agarosegel und kühlen Sie die Agarose auf etwa 40 Grad Celsius ab, also knapp über der Erstarrungstemperatur. Die Abkühlung kann beschleunigt werden, indem kaltes Wasser über das Gefäß laufen gelassen wird, wobei darauf geachtet werden muss, dass kein Wasser in das Agarosegel gelangt. Rühren Sie vorsichtig mit dem Thermometer um, während Sie die Temperatur überwachen.

Unmittelbar vor dem Auftragen des Agars entfernen Sie die Pufferlösung aus der Schädelmulde. Achten Sie darauf, dass keine Bläschen oder Partikel vorhanden sind, da diese die Bildgebung stören würden. Saugen Sie nun die Agarose mit einer Transferpipettenspitze auf und geben Sie die Agarose direkt auf das Gehirn ab.

Danach die Deckglasabdeckung schnell über die Oberfläche legen und mit Agarose-Tropfen an den Ecken befestigen. Gezeigt ist hier eine photo-mikrografische Aufnahme einer weiten einseitigen Kraniotomie, bei der Bregma in jedem Bild durch einen weißen Kreis markiert ist. Dargestellt sind Aktivierungsmuster der Großhirnrinde bei einer mit 0,5 % Isofluran anästhesierten Maus nach Reizung des kontralateralen Schnurrhaars, akustischer Reizung, Reizung der kontralateralen Vordergliedmaße, Reizung der kontralateralen Hintergliedmaße sowie visueller Reizung des kontralateralen Auges mit einer Leuchtdiode.

Es kam zu einer medianen Aktivierung durch alle Formen der sensorischen Stimulation 10 bis 25 Millisekunden nach der Aktivierung des primären sensorischen Kortex. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in drei bis vier Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, den Blutverlust so gering wie möglich zu halten und sicherzustellen, dass der Kortex nicht beschädigt wird.

Mithilfe dieses Verfahrens können andere bildgebende Verfahren wie die optische Bildgebung dabei helfen, wichtige Fragen zu beantworten, beispielsweise wie neuronale Dynamiken durch spontane Aktivität im gesunden und erkrankten Gehirn beeinflusst werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg dafür, dass Forscher im Bereich der Systemneurowissenschaften Wechselwirkungen und neuronale Dynamiken zwischen weit voneinander entfernten kortikalen Regionen bei Mäusen untersuchen konnten. Dieses Video zeigt Ihnen, wie man eine umfangreiche laterale Kraniotomie beim Mausmodell mit minimalem Blutverlust und kortikalen Schäden durchführt, wodurch Sie die notwendigen Daten erfassen können, um Ihre dringendsten wissenschaftlichen Fragen zu beantworten.