Name: EPA-Methode 1615 Messung der Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser, Kultur und RT-qPCR. Teil III. Virenerkennung durch RT-qPCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Erfahren Sie die Quantifizierung von Enteroviren und Noroviren in Wasserproben mittels RT-qPCR nach EPA-Methode 1615. Diese standardisierte Vorgehensweise ermöglicht Risikobewertungen für Trink- und Freizeitgewässer.

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Die Autoren danken Dr. Eric Rhodes für die Vorbereitung der Klone, die bei der Entwicklung des Standardkurvenreagenzes verwendet wurden, Brian McMinn für die Unterstützung bei der Probenverarbeitung, Larry Wymer für die statistische Analyse, Dr. Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, für die Bereitstellung des in dieser Studie verwendeten Sabin-Poliovirus-Serotyps 3 und Dr. H. W. Virgin, Washington University, St. Louis, MO, für murines Norovirus. Die Autoren danken auch Gretchen Sullivan für die Unterstützung bei der Vorbereitung von Laborreagenzien, Dr. Mohammad Karim für die Vermehrung von murinen Norovirus-Beständen und lokalen privaten Brunnenbesitzern und Versorgungsunternehmen, die uns die Entnahme von Wasserproben ermöglicht haben. Obwohl diese Arbeit von der EPA geprüft und zur Veröffentlichung freigegeben wurde, spiegelt sie nicht unbedingt die offizielle Politik der Agentur wider. Die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerziellen Produkten stellt keine Billigung oder Empfehlung zur Verwendung dar.

Hinweis: Verwenden Sie Datenblätter, um alle Schritte des Protokolls verfolgen; B. Datenblätter werden in der ergänzenden Materialien Tabellen S2-S4 gegeben. 1. Standard Curve Vorbereitung <ol><li> Vorbereitung einer Arbeitsstammlösung der Standardkurve Reagenz (zB Armored RNA EPA-1615), indem sie von der vom Hersteller in einer Konzentration von 2,5 x 10 8 Teilchen / ml (2,5 x 10 8 GC / ml) unter Verwendung von TSM geliefert Konzentration verdünnen III-Puffer. Teilen Sie die Arbeits Lager in 250 ul Aliquots mit 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 ° C. HINWEIS: Siehe ergänzenden Materialien Protokoll Schritt S1, um Anweisungen an den Vorbereitung Arbeitsvorräte von Viren und Plasmide für die Verwendung als alternative Standardkurve Reagenzien. </li><li> Auftauen eine oder mehrere der Arbeitsaktienteilmengen. Bereiten Sie fünf 10-fache serielle Verdünnungen mit 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, so dass Konzentrationen von 2,5 × 10 7, 2,5 × 10 6, 2,5 x10 5, 2,5 × 10 4 und 2,5 x 10 3 GC / ml. <ol><li> Bereiten Sie die erste Verdünnung durch Zugabe von 25 ul der 2,5 x 10 8 GC / ml Arbeits Lager bis 225 ul TSM III-Puffer. Mischen Sie für 5-15 Sekunden mit einem Vortex-Mischer. </li><li> Bereiten Sie die nächste Verdünnung durch Zugabe von 25 &amp; mgr; l der Verdünnung in Schritt 1.2.1 bis 225 ul TSM III Puffer hergestellt. Mischen Sie immer und auch weiterhin einen ähnlichen Prozess, um die nächsten drei 10fache Verdünnungen herzustellen. </li></ol></li><li> Entpacken Sie die RNA aus der Standardkurve Arbeits Lager und die fünf Verdünnungen sofort nach dem Verfahren in Abschnitt 3. </li></ol> 2. Tertiär Konzentration <ol><li> Vorbereitung einer Zentrifugalkonzentrators (30.000 Molekulargewicht Cutoff) für jede Probe durch die Zugabe von mindestens 10 ml 1x PBS, 0,2% Rinderserumalbumin (BSA) auf die obere Probenkammer gesammelt. Stellen Sie sicher, dass Lösung hat den dünnen Kanal Konzentrationskammer gefüllt ist, und halten Sie dann O / N bei 4 ° C. <ol><li&gt; Entsorgen Sie die Flüssigkeit. Spülen Sie den Konzentrator einmal mit mindestens 10 ml sterilem analysenreinem Wasser, um überschüssiges BSA zu entfernen und dann das Wasser verwerfen. </li></ol></li><li> Fügen Sie eine Menge von Sekundärwasser Konzentrats aus jeder Testprobe gleich S, der Assayprobe Volume in separate Zentrifugalkonzentratoren. <ol><li> Berechnen Sie S nach Gleichung 1, <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq1.jpg" /> Wobei D das Volumen der ursprünglichen Wasserprobe untersucht wird, ist TSV gesamten Probenvolumen und FCSV ist der abschließende Konzentrierte Probenvolumen. Siehe ergänzenden Materialien S2 ein Beispiel für die Berechnung des S. </li></ol></li><li> Zentrifuge jede Testprobe bei 3000-6000 · g bei 4ºC in einem Schwingbecher-Rotor für 20 - 30 min. Überprüfen Sie die Lautstärke in der dünnen Kanal Konzentrationskammer. <ol><li> Wenn das Volumen größer als 400 &amp; mgr; l, zentrifugieren für 20 min oder länger. Weiter Zentrifugieren, bis die Probe in the dünnen Kanal Konzentrationskammer auf weniger als 400 &amp; mgr; verringert. Den Überstand entfernen. </li></ol></li><li> Waschen der Seiten des Zentrifugalkonzentrators mit 1 ml sterilem 0,15 M Natriumphosphat, pH 7-7,5 Virusrückgewinnung zu erhöhen. Zentrifuge wieder 3000-6000 · g und 4 ° C, bis die Probe auf weniger als 400 &amp; mgr; l verringert. Wiederholen Sie diesen Waschschritt ein weiteres Mal. </li><li> Mit Hilfe eines 100 bis 200 &amp; mgr; l-Mikropipette, sorgfältig zu messen und übertragen jeweils konzentrierte Probe in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (dh Transfer 200 ul in die Mikrozentrifugenröhrchen und dann den verbleibenden Konzentrat durch Einstellen der Mikropipette, bis die Restflüssigkeit vollständig ausgearbeitet werden in die Pipettenspitze). Hinzufügen 0,15 M Natriumphosphat, pH 7-7,5, um das Endvolumen auf 400 ± 2 ul einzustellen. </li><li> Auszug Nukleinsäure sofort durch Fortschreiten zu Schritt 3. Halten Sie alle konzentrierten Proben, die nicht processe werden kannd sofort bei 4 ° C für nicht mehr als 24 Stunden. </li></ol> 3. Nukleinsäure-Isolierung <ol><li> Mit 200 ul Extraktionspuffer, hergestellt wie in Stufe 3.3 und 200 ul des tertiären Konzentrat aus Schritt 2.5 oder Standardkurve Verdünnungs beschrieben von jeder Testprobe aus Schritt 1.3 Zur Abtrennung markierter 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Gefriert übrigen bei oder unter -70 ° C tert.-Konzentrate. Extrahieren Sie die Nukleinsäuren aus jeder Probe gemäß den Anweisungen des Nukleinsäure-Extraktion Kit Herstellers für die Spin-Protokoll für Blutproben mit den folgenden Ausnahmen. </li><li> Sie Protease auf die Wasserproben nicht hinzu oder benutzen Sie die mit der Nukleinsäureextraktion mitgelieferten Extraktionspuffer. </li><li> Bereiten Extraktionspuffer mit Carrier-RNA <ol><li> Add 310 ul Träger RNA-Verdünnungspuffer in eine Ampulle, die 310 &amp; mgr; g Träger-RNA. Mischen Sie zu lösen und dann in 6 Teilmengen, die etwa 50 &amp; mgr; l zu teilen. Lagerung bei -20° C. </li><li> Hinzuzufügen 28 ul aufgetautes Carrier-RNA pro ml Extraktionspuffer, um einen Träger-RNA-Konzentration von 0,027 ug / ul zu erhalten. Verwenden Sie den Carrier-RNA-Extraktionspuffer geändert anstelle von, dass mit dem Extraktions-Kits geliefert. </li></ol></li><li> Vorbereitung einer Stammlösung an Elutionspuffer durch Zugabe Ribonuklease (RNase) Inhibitor in einer Endkonzentration von 400 Einheiten / ml in der mit dem Extraktionskit gelieferten Elutionspuffer. <ol><li> Eluieren RNA von der Nukleinsäure bindenden Spinsäule, indem 50 ul Elutionspuffer mit RNase-Inhibitor in die Kolonne. Mindestens 1 Minute warten und dann bei 6.000 × g zentrifugieren für 1 min bei RT. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.4.1 und entfernen und entsorgen Sie die Spalte. </li></ol></li><li> Bereiten Aliquots der RNA-Extrakte aus Schritt 3.4.2. Bereiten Sie 6 Teilmengen der Standardkurve Arbeits Lager und jede Standardkurve Verdünnung mit je mindestens 15 &amp; mgr; l. Herstellung von 4-Aliquots von allen anderen RNA-Proben, die mindestens22 &amp; mgr; l jeder. Lagern ein Aliquot von jeder Probe und Standardkurve steuert bei 4 ° C, wenn sie durch reverse Transkription innerhalb von 4 h zu verarbeiten; Andernfalls speichern Sie alle Teilmengen bei oder unter -70 ° C. </li></ol> 4. Reverse Transkription (RT) <ol><li> Vorzubereiten 100 uM Vorratslösungen der einzelnen Oligonukleotid-Primer und Sonden in Tabelle 1 aufgelistet, indem ein Volumen von PCR-Grade-Wasser zu jedem Röhrchen unter Verwendung einer Menge (in Mikrolitern) gleich zehn mal der Anzahl Nanomol (nmol) des Oligonucleotids in die vorliegende Fläschchen (wie auf dem Etikett oder dem Datenblatt des Herstellers (zB gezeigt, resuspendieren ein Primer, der 36,3 nmol in 363 ul). Mischen Sie sich aufzulösen. <ol><li> Verdünnen Sie die 100 uM Lösungen 1:10 mit PCR-grade Wasser auf 10 &amp; mgr; M Arbeitslösungen vorzubereiten. </li></ol></li><li> Bereiten RT Master Mix 1 und 2 in einem Reinraum mit der Führung in der Tabelle 2. Pipette 16,5 ul RT Master Mix 1 zu jedem PCR-Platte auch mit einer Mehrkanalpipette. </li><li> Tauwetter, wenn eingefroren, die Nukleinsäureextrakte von jeder Feldprobe und Lab Befestigte Probenmatrix (LFSM, dh ausgesät Wassermatrixprobe). <ol><li> Verdünnen jedes Feld und LFSM Probe 1: 5 und 1:25 Elutionspuffer, enthaltend 400 Einheiten / ml RNase-Inhibitor. </li><li> Tauwetter, wenn eingefroren, aber nicht zu verdünnen Lab Fortified Blank weiß (LFB, dh ein positiver Qualitätskontrolle mit gesäten analysenreinem Wasser), Lab Reagenzienblind (LRB, dh ein negativer Qualitätskontrolle mit analysenreinem Wasser), Performance Evaluation (PE , dh verwendet ausgesät analysenreinem Wasser Proben an das Labor Leistung vor dem Beginn einer Studie), Leistungstest (PT zu bewerten, dh ausgesät Reagenzqualität Wasserproben mit Titern unbekannt einem Analysten, die während einer Untersuchung verwendet werden, um Labor-Leistung zu bewerten ), NA Batch negativen Extraktionskontrolle oder RNA extrahiert aus der Standardkurve gesetzt. </li></ol&gt; </li><li> Zeigen 6,7 ul der RNA aus jeder Probe, Kontrolle und Standardkurve in getrennte PCR-Platte Brunnen, mit drei Vertiefungen für die Proben und Kontrollen sowie zwei Vertiefungen für Standardkurven (siehe Abbildung S1 für eine RT Platte Beispiel). <ol><li> Zeigen 6,7 ul Elutionspuffer in separate PCR-Platte Brunnen für Nicht-Template-Kontrollen (NTC). Fügen Sie 2-8 NTC pro RT Platte, unter Verwendung von zwei für die erste Probe und dann zwei weitere für jeden vierten zusätzlichen Probe. </li><li> Verteilen Sie die negativen Extraktion und NTC Kontrollen in der gesamten Platte. </li></ol></li><li> Verschließen Sie die PCR-Platte mit einer hitzebeständigen Plattenversiegelung. Mischen Sie die Proben für 5-10 sec und dann bei ≥ 500 · g kurz zentrifugieren. </li><li> Inkubiere die Platte für 4 min bei 99 ° C und dann schnell abgekühlt auf 4 ° C in einem Thermocycler. Zentrifuge erneut bei ≥ 500 · g kurz. </li><li> Die Plattendichtung vorsichtig entfernen und fügen Sie dann 16,8 ul RT Master Mix 2 in jede Vertiefung. Seal die Platte wieder mit einem hitzebeständigen Plattenversiegelung, gefolgt von Mischen und eine kurze Zentrifugation bei ≥ 500 x g. </li><li> Die Platte wird in einem Thermocycler ausgeführt für 15 min bei 25 ° C, gefolgt von 60 min bei 42 ° C, 5 min bei 99 ° C, und dann mit einem 4 ° C Haltezyklus. </li><li> Prozess sofort oder innerhalb von 8 Stunden durch qPCR (Schritt 5) oder Proben bei oder unterhalb -70 ° C, bis sie verarbeitet werden können. Lagerung von Proben, die innerhalb von 8 Stunden bei 4 ° C verarbeitet werden können. </li></ol> 5. quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) <ol><li> Die mittlere Hepatitis G Cq Wert für jede Menge von Hepatitis-G-Reagenz vor der Ausführung keine Testproben. <ol><li> Führen Sie eine RT-Test 10 Mal hergestellt wie für NTC steuert (Schritt 4.1.1) beschrieben. Führen Sie das Hepatitis-G-qPCR-Assay, wie unten beschrieben (Schritte 5.2 bis 5.5.3). Berechnen Sie den mittleren Cq Wert der 10 Wiederholungen. </li><li> Stellen Sie die Hepatitis-G Reagenzienmenge in RT Master Mix 1 (Tabelle 2), Falls erforderlich, um eine mittlere Cq Wert zwischen 25 und 32 Einheiten erhalten. Ausgleich den Betrag angehoben oder durch Änderung der Wassermenge gesenkt wird hinzugefügt, um die RT Master Mix 1 Endvolumen bei 16,5 &amp; mgr; l pro Test zu halten. </li><li> Bestätigen Sie alle Einstellungen durch Wiederholen der Schritte 5.1.1 bis 5.1.2 und Änderung Tabelle 2, um die angepassten Mengen zu reflektieren. </li></ol></li><li> Bereiten qPCR Master-Mixes in einem Reinraum mit den Führungen in Tabelle 3 für Enterovirus, Tabelle 4 und Tabelle 5 für Norovirus Genogruppe I, Tabelle 6 zur Norovirus Genogruppe II, Tabelle 7 für murine Norovirus (Norovirus Genogruppe V), und Tabelle 8 zur Behandlung von Hepatitis G. Mix jedes Master-Mix und dann Zentrifuge bei ≥ 500 · g kurz. </li><li> Fügen Sie die PCR-Master-Mix in die entsprechenden Vertiefungen einer markierten optischen Reaktionsplatte, mit 14 ul pro Vertiefung und separater Platten für jede qPCR-Assay (siehe Abbildung S2 </strong&gt; für ein mögliches Layout für eine qPCR-Assay, basierend auf der RT-Layout in Abbildung S1). </li><li> Auftauen RT Platte aus Schritt 4.8 bei RT, wenn eingefroren. Mischen Sie mit einem Tellermischer und dann bei ≥ 500 · g kurz zentrifugieren. </li><li> Verzichtet werden 6 ul der entsprechenden cDNA in die entsprechenden Vertiefungen der optischen Reaktionsplatte. Mischen Sie die Proben in der optischen Reaktionsplatte und Zentrifuge bei 500 xg ≥ kurz. <ol><li> Führen Sie das Hepatitis-G-qPCR-Assay auf der unverwässerten und verwässerten Feld und LFSM Proben vor, die alle anderen qPCR-Assays. Verwenden Sie die niedrigste Verdünnung des Feldes oder LFSM Probe, die &lt;1 Cq Wert größer als der Mittelwert Hepatitis G Cq Wert für die Enteroviren und Noroviren qPCR-Assays. </li><li> Die quantitative PCR Thermocycler Software entsprechend den Anweisungen des Herstellers eingestellt. Identifizieren Sie die Standardkurve Proben als Standards und für jede Standardkurve Verdünnung, geben Sie in Tabelle 9 gezeigten genomischen Kopie Werte. </li><li&gt; Führen der Platte in der quantitativen PCR-Thermocycler für 10 min bei 95 ° C, gefolgt von 45 Zyklen von 15 sec bei 95 ° C und 1 min bei 60 ° C. </li></ol></li><li> Bestimmen, ob jeder Standardkurve entspricht den zulässigen Werten in Tabelle 10 angegeben. Siehe ergänzenden Materialien Abschnitt S3 für Beispiele. <ol><li> Berechnen Sie die Gesamtstandardabweichung (StdDev) für die Standardkurve unter Verwendung von Gleichung 2, <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq2.jpg" /> wobei Cq ist der Wert für jede Standardkurve Replikat berichtet, ist Cq der Mittelwert für jeden Satz von Replikaten ist #Cq die Gesamtzahl der Cq Werte für alle Standard-Steuer Replikate, die positive Werte (also nicht unbestimmt) haben, und # Stds ist die Anzahl der Standard-Steuerelementen, die positive Werte haben. </li><li> Wenn die quantitative PCR Thermocycler-Software nicht die Berechnung der Steigung für jede Standardkurve, die Berechnung der Steigung unter Verwendung von Gleichung 3,60; <img alt="Gleichung 3" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq3.jpg" /> wobei Cq ist der Mittelwert der höchsten und niedrigsten Verdünnungen verwendet, und melden Sie sich GC ist das Protokoll der genomischen Kopie Wert für den höchsten und niedrigsten Verdünnungen aus der Tabelle 9 verwendet. </li><li> Berechnen Sie die R 2 Wert unter Verwendung der Gleichung 4. <img alt="Gleichung 4" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq4.jpg" /> wobei Cq ist der Mittelwert aller Cq Werte und Log GC ist die mittlere Log GC-Wert für jede Wiederholung. </li><li> Berechnen Sie die% Wirkungsgrad unter Verwendung von Gleichung 5: <img alt="Gleichung 5" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq5.jpg" /></li></ol></li><li> Notieren Sie die von den Thermocycler-Software für alle Testproben auf der Basis von Standardkurven, die die Kriterien in der Tabelle 10 angegeben und die mittlere GC-Werte für jede Probe treffen berechnet GC-Werte. Wiederholung alle Proben mit Standardkurven, die die Kriterien nicht erfüllen, in <strong&gt; Tabelle 10 oder in denen irgendwelche negativen Kontrollen (LRB, NA Batch negativen Extraktionskontrolle oder NTC) sind positiv. Aufbereiten keine Proben, die die Kriterien nicht erfüllen oder falsche Positivkontrollen während der Wiederholung. </li><li> Bestimmen die GC pro Liter (GC L) für jede Testprobe unter Verwendung von Gleichung 6: <img alt="Gleichung 6" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq6.jpg" /> wenn GC ist der Mittelwert genomische Kopienzahl aus Schritt 5.7, ist die Gesamtverdünnungsfaktor für die Volumenverringerung, die während der tertiären Konzentration vorkommen der Faktor, 199 &#39;, RNA-Extraktion und RT-qPCR Schritten ist der Verdünnungsfaktor, der zur Hemmung kompensiert DF und D ist das Volumen des ursprünglichen Wasserprobe in Litern getestet. Siehe ergänzenden Materialien Abschnitt S4 ein Beispiel für die Berechnung der GC L. </li><li> Berechnen Sie die Gesamt GC von LFB und LRB Proben durch Multiplikation der mittleren GC-Wert aus Schritt 5.5 durch 199 und dividiert durch 0,3. </li></ol>

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<li>Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+positively+charged+alumina+nanofibre+cartridge+filters+for+the+primary+concentration+of+noroviruses%2C+adenoviruses+and+male-specific+coliphages+from+seawater%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater.</a> J. Appl. Microbiol. 109 (2), 635-641 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Großen nationalen Studien der viralen Kontamination von Quelle und trinken Wasser erfordern den Einsatz von mehreren analytischen Laboratorien. Unter diesen Bedingungen ist ein Standardverfahren ist notwendig, um sicherzustellen, dass die durch die mehreren Laboratorien erzeugten Daten vergleichbar. Es gibt viele veröffentlichte molekulare Methoden zur Virenerkennung, aber nur sehr wenige standardisierte molekularbiologischen Methoden. EPA-Verfahren 1615 ist eine standardisierte Methode speziell für die Detektion von Enterovirus und Norovirus in Wasser Matrizen durch RT-qPCR gestaltet. Standardisierte molekulare Methoden zur Virenerkennung in Lebensmitteln zur Verfügung (CEN / TS 15216-1 und ISO CEN / TS 15216-2 ISO, 7. April 2013) 16,17 und haben auf den Nachweis von Hepatitis A-Virus und Norovirus im Frühjahr angewandt worden Wasser 16. Alle Standardmethoden müssen Qualitätskontrollen und Leistungskriterien zu minimieren, inter- und intraLabor Variation und falsch positive Daten aufgrund von Laborkontamination schließen. Um falsche Daten weiter zu verringern, EPA-Methode 1615 folgt EPA Leitlinien für molekulare Methoden, 18, ​​die Trennung von Arbeit während der Verarbeitung und eine Möglichkeit, Arbeitsabläufe festgelegt. Es enthält eine Hepatitis-G-1,19 internen Kontrolle und Verfahren zu falsch negativen Ergebnissen aufgrund von Inhibitoren der RT-qPCR 15 zu minimieren. Es nutzt quantitative Assays zusammen mit standardisierten Mengen von sowohl Wasser als Probe entnommen und Wasser untersucht, so dass alle Felddaten werden in Genomkopien pro Liter des Feldes oder Trinkwasser abgetastet ausgedrückt. Während effiziente Einzelrohr (einstufig) RT-PCR-Assays sind im Handel erhältlich, absichtlich verwendet das Verfahren separaten Assays. Dies hat den Nachteil einer Minimierung der Probenmenge, die in jeder Reaktion getestet werden kann, aber eine höhere Flexibilität bei Verwendung mehrerer Primer-Sätze. RT-qPCR-Assays werden und nur so gut begrenzt, da die Primer und Sonden verwendet werden, und wahrscheinlich keine Primer-Set werden alle Virusvarianten innerhalb einer Gruppe zu erkennen. Das Enterovirus-Primer-Set, da entschieden wurdesie zielt auf die konservierten 5&#39;-nicht-kodierende Region, 20,21 erfasst eine Vielzahl von Enterovirusserotypen und Viren durch sie erfasst werden mit Auswirkungen auf die Gesundheit durch den Verzehr von unbehandeltem Grundwasser 1 verbunden. Zwei Primer-Sets zur Detektion Genogruppe I Noroviruses 22,23 eingesetzt. Die erste war aufgrund der starken Korrelation zwischen dem Gesundheitseffekte bei jungen Kindern ausgewählt und detektiert Virus 1. Die zweite Genogruppe Ich Primer-Set und der Primer-Set für Genogruppe II Noroviren verwendet wurden ausgewählt, weil sie die verschiedensten Stämme 24,25 zu erkennen. Trotz der großen Vorteile der qPCR und RT-qPCR Verfahren zum Nachweis viraler RNA in Wasser, gibt es mehrere Einschränkungen. Zunächst sind beide infektiösen und nicht-infektiösen Viruspartikel, einschließlich der von Desinfektionsmitteln inaktiviert, können durch diese Verfahren amplifiziert werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Borchardt geringeres Problem für unbehandelte Grundwasser from Aquiferen ähnlich denen in den Gemeinden untersucht, als für desinfizierte Oberflächengewässer 1. Für kultivierbaren Viren können dieses Problem unter Verwendung von PCR in Kombination mit Kultur 26,27 überwunden werden. Das Problem ist auch für einige Viren durch Verwendung von Nukleinsäure-Vernetzungsmittel 28-30 angesprochen. Dieser letztere Ansatz ist effektiver für Viren durch Hypochlorit inaktiviert und nicht effektiv für diejenigen, die durch UV-inaktiviert. Eine zweite Einschränkung dieser molekularen Verfahren ist, dass das Volumen der konzentrierten Probe, die typischerweise analysiert werden kann, ist viel kleiner als die für Kulturverfahren 6,31 verwendet. Dieses Problem wird häufig entweder durch Ersetzen eines Polyethylenglykol-basiertes Verfahren für die sekundäre Standardkonzentration durch organische Flockung, die die Probe in einem kleineren Volumen resuspendiert werden, oder durch die Zugabe eines tertiären Probenkonzentrationsschritt 6,32,33 ermöglicht gehandhabt . Verfahren 1615 verwendet ZentrifugierenUGAL Ultrafiltration zur tertiären Konzentration bereitzustellen. Zentrifugalen Ultrafiltration entfernt Wasser und Komponenten, weniger als 30.000 Daltons was sich in Konzentration von Viren in Proben und eine Verringerung der kleinen Gewichts Inhibitoren molekularer Assays Molekular. Diese ternäre Konzentrationsschritt führt zu einer Gesamtkonzentrationsfaktor von&gt; 10 5 für jedes Virus, das im Wasser vorlag getestet. Eine dritte Einschränkung ist die Anwesenheit von Inhibitoren der molekularen Verfahren in Umweltproben. Obwohl zahlreiche Ansätze, um Inhibitoren zu entfernen sind entwickelt worden, keine effektiven Ansatz für alle Wasser Matrizen und Virus-Typen 6,34,35, so dass die Verwendung von internen Kontrollen entwickelt, um den Grad der Hemmung wesentliche schätzen. Das Hepatitis-G-Reagens bei diesem Verfahren verwendete diese Forderung erfüllt, indem ein konstantes Niveau der viralen RNA in allen Reaktionen und einer RT-qPCR-Assay zum Schätzen Hemmung. Wenn der beste ter Inhibitor Removal Ansätze nicht zu einer Hemmung zu entfernen, Probenkonzentrate können, solange Viruskonzentrationen höher als Inhibitorkonzentrationen 14,15 sind verdünnt werden. Die hier beschriebene Standardkurve Verfahren hat sowohl Vorteile als auch eine große Einschränkung. Ein Vorteil ist, dass das verwendete Reagenz liefert alle notwendigen Komponenten in einem einzigen Reagenz, wodurch eine einzige Steuerung für alle Assays verwendet werden. Dieses Reagenz ist besonders von Vorteil für Norovirus-Assays. Norovirus Partikel können nur von infizierten Individuen, die es sehr schwierig, Viruspartikel zur Verwendung als Standards zu erhalten, erhalten werden. Ein wichtiger Vorteil ist, dass es ein RNA-Standard für alle Ziel-RNA-Viren in einem Reagenz, wie mit einem RNA-Standard ist für eine genaue Quantifizierung von RNA 36. Jedoch ist ihre Fähigkeit, Virus genau zu quantifizieren, dass Matrixeffekte werden nicht berücksichtigt beschränkt. Dies bedeutet, dass genomische KopieZahlenwerte können nicht berücksichtigt absolute werden und sollte nur in relativen Zahlen betrachtet werden. Es wird empfohlen, eine ausreichende Anzahl von Standardkurve arbeiten stock Aliquots (Schritt 1.2) bereit, komplette Studien decken. Beispielsweise liefert jeder 250-ul-Aliquot ausreichend Reagenz für 6 RT Platten. Wenn bekannt ist, dass eine Studie Analyse von 500 Proben erfordern würde ein Minimum von 12 Teilmengen benötigt werden (500 Proben / 7 Proben pro Platte RT / RT 6 Platten pro Aliquot). EPA-Methode 1615 ist ein Performance-basierte Methode. Viele Hersteller stellen äquivalente Reagenzien, die den hier festgelegt und diese Reagenzien können, solange die Leistungskriterien erfüllt werden ausgewechselt werden. Die Standardkurve, die auch als eine positive RT-qPCR-Steuerung, ist der Wert bei der Problembehandlung von Leistungsproblemen. Die Leistung kann durch Abbau von RNA, Reagenz Haltbarkeit, Versagen der Gefriergerätekalibrierung und technischen Fehler zurückgehen. Performance-Probleme sollten verdächtig seined, wenn Standardkurven unterscheiden sich von der in 4 dargestellt ist, oder wenn sie die Leistungsbeschreibung für die Standardkurven nicht erfüllen. Die RT-qPCR-Assay ist sehr robust; Totalausfall ist durch unsachgemäße Handhabung von RNA oder technische Fehler (zB eine fehlende Reagenz) wahrscheinlich. Große Sorgfalt sollte beim Umgang mit RNA-Proben zwischen Extraktion und RT-Schritt, um RNA-Abbau von Ribonukleasen zu reduzieren genommen werden. Poliovirus-Rückforderungen von Boden und analysenreines Wasser und murine Norovirus Rückforderungen aus dem Grundwasser erfüllt die EPA-Methode 1615 Performance Akzeptanzkriterien (Tabelle 11) und sind vergleichbar mit denen von anderen 33,37,38 gemeldet. Murine Norovirus Rückforderungen von LFB Proben waren viel niedriger als die des Poliovirus und würde die Poliovirus spezifischen Akzeptanzkriterien nicht erfüllt haben. Die Gründe für die niedrigeren murine Norovirus Erholung von analysenreinem Wasser sind nicht bekannt. Ähnlich wie die Ergebnisse hier, Karim und Colleagues berichteten von einer Rückgewinnung für Norovirus GI.1 von 4% aus Leitungswasser 39. Lee et al. 37 berichtete mittlere Wiederfindung für murine Norovirus und Menschen Norovirus GII.4 von 18% und 26% aus destilliertem Wasser mit Scheibenfilter sind. Verwenden von ähnlichen Bedingungen wie Lee und Kollegen, Kim und Ko beobachteten Ausbeuten von 46% und 43% für diese Viren bzw. 38. Gibbons et al. 40 um 100% Wiedergewinnung von menschlichem Norovirus GII.4 aus Meerwasser gewonnen, aber Kim und Ko 38 festgestellt, dass die Zugabe von Salz zu destilliertem Wasser bei ähnlichen oder höheren als Meerwasser erheblich verringert Einziehungen des murinen Virus und Konzentrationen resultierte in etwa einem zweifachen Verringerung GII.4 Erholung.

Quantitative PCR (qPCR, siehe Zusatzmaterialien für Definitionen der in diesem Manuskript verwendet) und reverse Transkription-qPCR (RT-qPCR) sind wertvolle Werkzeuge zur Detektion und Quantifizierung menschlicher Darmviren in der Umwelt- und trinken Wasser, und vor allem für viele Viren, die zu tun nicht replizieren oder repliziert schlecht in Zellkultursystemen. Beide Tools haben gezeigt, dass viele Virus-Typen in der Umwelt- und trinken Wasser in der ganzen Welt 1-6 vorhanden sind. Ihre Verwendung bei der Krankheitsausbruch Untersuchungen mit Sequenzierung der amplifizierten genomischen Fragmente gekoppelt hat Beweise für wässrige Virusübertragung zur Verfügung gestellt, wie sie haben gezeigt, dass das Virus im Trinkwasser gefunden, ist identisch mit Schuppen von Ausbruch Patienten 7-10. Sowohl qPCR und RT-qPCR sind nützlich, die öffentliche Gesundheit Werkzeuge. Zum Beispiel Daten aus Studien, die von der US Environmental Protection Agency (EPA) hat gezeigt, eine starke Beziehungschen Indikator Messungen durch qPCR und Auswirkungen auf die Gesundheit in Erholungsgewässer. Als Ergebnis enthält EPA Finale 2012 Freizeitangebot der Wasserqualitätskriterien eine qPCR Verfahren zur Überwachung von Freizeitstrände 11,12. Borchardt und Kollegen auch festgestellt, eine starke Beziehung zwischen akuter Gastroenteritis in Gemeinden mit unbehandeltem Grundwasser und Viren in das Grundwasser, wie durch RT-qPCR 1 gemessen. Der Zweck dieses Papiers ist es, die molekularen Testkomponente des EPA-Methode 1615 13,14 beschreiben. Dieser Assay verwendet RT-qPCR, eine quantitative Einschätzung des Enterovirus und Norovirus Genomkopien (GC) pro Liter, bezogen auf das ursprüngliche Volumen der Umwelt oder im Trinkwasser geleitet durch eine elektro Filter bereitzustellen. Ein Überblick über die molekularen Verfahren ist in Abbildung 1. Protokoll Abschnitt 1 Details der Verfahren zur Herstellung der Standardkurve gezeigt. Diese Standards werden von einem Reagenz, das ein RN enthält, hergestelltEine Kopie der Zielsequenz für alle Primer / Sonden-Sets. Abschnitt 2 beschreibt die tertiäre Konzentrationsverfahren. Abschnitt 3 gibt die Methode zur Extraktion von RNA aus den konzentrierten Wasser und Kontrollproben. Die RNA aus jeder Testprobe ist umgekehrt mit dreifachen Tests und zufällige Primer an prime die Transkription (Abschnitt 4) transkribiert. (; 2 Abschnitt 5) Die cDNA von jedem reverse Transkriptionsreaktion ist in fünf separaten virusspezifischen Assays, die dreifach durch qPCR analysiert werden geteilt. Der Assay verwendet Primer und Sonden, die von der wissenschaftlichen Literatur (Tabelle 1), die entworfen sind, um viele Enteroviren und noroviruses und einem Reagenz, das Hepatitis-G-RNA, um Testproben, die hemmend auf RT-qPCR 15 identifizieren, zu erfassen.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml Röhrchenkammer</td><td>Diversified Biotech</td><td>CHAM-3000</td><td></td></tr><tr><td>1 &deg; C cool brick</td><td>Diversified</td><td>Biotech BRIK-2501</td><td></td></tr><tr><td>10x PCR Puffer II und 25-mM MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>N8080130-20</td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C Gefrierschrank</td><td>VWR</td><td>97043-346</td><td>Muss ein manueller Abtaufroster</td></tr> <tr><td>sein-70 &deg; C oder kälterer Gefrierschrank</td><td>Thermo Scientific</td><td>MBF700LSAO-E</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Kammer</td><td>Diversified Biotech</td><td>CHAM-1000</td><td></td></tr><tr><td>Absolutes Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-100</td><td></td></tr><tr><td>Armored RNA EPA-1615</td><td>Asuragen</td><td>Sonderanfertigung</td><td>Wird zur Quantifizierung des RT-qPCR-Assays verwendet</td></tr><tr><td>Armored RNA Hepatitis G-Virus</td><td>Asuragen</td><td>42024</td><td></td></tr><tr><td>Autoklav</td><td>Steris</td><td>Amsco Labor-Serie</td><td></td></tr><tr><td>Biosicherheitswerkbank</td><td>NuAir Laborausrüstung Versorgung</td><td>Labgard 437 ES</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Affymetrix</td><td>10856</td><td>Kristalliner</td></tr><tr><td>Puffer AVE</td><td>Qiagen</td><td>1026956</td><td>Träger-RNA-Verdünnungspuffer</td></tr><tr><td>Puffer AVL</td><td>Qiagen</td><td>19073</td><td>Extraktion Puffer</td></tr><tr><td>Carrier RNA</td><td>Qiagen</td><td>Nicht zutreffend</td><td>Verwenden Sie Carrier-RNA, die mit Buffer geliefert wird AVL</td></tr><tr><td>Zentrifugenflaschen</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-562-23 oder 05-562-26</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenrotoren</td><td>Beckman Coulter</td><td>339080, 336380</td><td></td></tr><tr><td>Kühlsafe</td><td>Diversified Biotech</td><td>CSF-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Promega</td><td>P1171</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler&reg; 480 Sonden Master Kit</td> Roche <td>Diagnostics</td><td>4707494001</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-682-550</td><td>Verwenden Sie Ribonukleas- und Desoxyribonuklease-freie Röhrchen mit Schnappverschlüssen</td></tr><tr><td>Microcide III</td><td>Fitzgerald</td><td>99R-103</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'A' Film</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSA5001</td><td>Heat widerstandsfähige</td></tr><tr><td>Microseal 'F'-Folie</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>MSA1001</td><td>Tiefkühlbeständiger</td></tr><tr><td>Mini-Platten-Spinner</td><td>Labnet International</td><td>MPS1000</td><td></td></tr><tr><td>Mehrkanalpipette</td><td>Rainin</td><td>L8-20</td><td></td></tr><tr><td>Mehrrohrkammer</td><td>Diversifiziert Biotech</td><td>CHAM-5000</td><td></td></tr><tr><td>Optische Reaktionsplatte</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>4314320</tr><tr><td>PCR-Nukleotidmischung</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Platte</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSS9601</td><td></td></tr><tr><td>Wasser in PCR-Qualität</td><td>Roche</td><td>3315932001</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>U.S. Biological</td><td>D9820</td><td></td></tr><tr><td>Plattenmischer</td><td>Scientific Industries</td><td>MicroPlate Genie</td><td></td></tr><tr><td>Prionex Gelatine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0411</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>Enthält die Puffer AW1 (Puffer für den ersten Waschgang), AW2 (Puffer für den zweiten Waschgang), AE (Elutionspuffer); Ethanol muss den Puffern AW1 und AW2 vor der Verwendung zugesetzt werden; Verwenden Sie nicht den mit dem Kit gelieferten Puffer AL</td></tr><tr><td>Quantitativer PCR-Thermocycler</td><td>Life Technologies</td><td>4351405</td><td></td></tr><tr><td>Random Primer</td><td>Promega</td><td>C1181</td><td></td></tr><tr><td>Reagent Reservoir</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-381-27E</td><td></td></tr><tr><td>Gekühlte Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>367501</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2515 oder N2615</td><td></td></tr><tr><td>ROX Referenzfarbstoff</td><td>Life Technologies</td><td>12223</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II oder III Reverse Transkriptase</td><td>Life Technologies</td><td>18064-022 oder 18080044</td><td></td></tr><tr><td>OP-Handschuhe</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-058-800</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Life Technologies</td><td>4314879</td><td></td></tr><tr><td>Trisma-Basis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20 Zentrifugalkonzentratoren</td><td>Sartorius-Stedim</td><td>VS2022</td><td></td></tr></tbody></table>

epa-methode 1615 messung der enterovirus und norovirus vorkommen in wasser, kultur und rt-qpcr. teil iii. virenerkennung durch rt-qpcr

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA-Methode 1615 misst Enteroviren und Noroviren, die in Umwelt- und Trinkwasser vorkommen. Diese Methode wurde mit dem Ziel entwickelt, eine standardisierte Methode für den Einsatz in mehreren analytischen Labors während der Überwachungsperiode 3 der Unregulated Contaminant Monitoring Rule zu haben. Im Folgenden stellen wir das Protokoll für die Extraktion von viraler Ribonukleinsäure (RNA) aus Wasserprobenkonzentraten und für die quantitative Messung von Enterovirus- und Norovirus-Konzentrationen mittels reverser Transkriptions-quantitativer PCR (RT-qPCR) vor. Die Viruskonzentrationen für den molekularen Assay werden in Form von genomischen Kopien der viralen RNA pro Liter auf der Grundlage einer Standardkurve berechnet. Die Methode verwendet eine Reihe von Qualitätskontrollen, um die Datenqualität zu erhöhen und Schwankungen zwischen und innerhalb von Laboratorien zu reduzieren. Die Methode wurde evaluiert, indem die Virusrückgewinnung aus Boden- und Reagenzienwasser untersucht wurde, das mit Polioviren Typ 3 und murinen Noroviren als Surrogat für humane Noroviren besiedelt wurde. Die durchschnittliche Wiederfindung von Polioviren betrug 20 % im Grundwasser und 44 % in Wasser in Reagenzienqualität. Die durchschnittliche Wiederfindung von murinen Noroviren mit dem RT-qPCR-Assay betrug 30 % im Grundwasser und 4 % in Wasser in Reagenzienqualität.

Hier stellen wir ein Verfahren zur Quantifizierung von Enteroviren und Noroviren in Umwelt- und Trinkwassern mittels reverser Transkriptions-quantitativer PCR vor. Die mittlere Virusrückgewinnung aus dem Grundwasser mit diesem standardisierten Verfahren der EPA-Methode 1615 betrug 20 % für Polioviren und 30 % für murine Noroviren.

EPA-Methode 1615 Messung der Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser, Kultur und RT-qPCR. Teil III. Virenerkennung durch RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Konzentration von Enteroviren und Noroviren in Wasser mithilfe der quantitativen reversen Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion zu bestimmen. Dies wird erreicht durch eine dreistufige Konzentrierung von Viruspartikeln aus wässrigen Probenkonzentraten mittels zentrifugaler Ultrafiltration. Anschließend werden die Reagenzien für die Standardkurve wie im Protokoll beschrieben hergestellt. Danach erfolgt die Nukleinsäure-Extraktion aus den viralen Konzentraten und der Standardkurve. Die virale RNA wird dann in einer Verdünnung von 1:5 beziehungsweise 1:25 der RNA mit Hilfe von Random-Primern und reverser Transkriptase revers transkribiert. Schließlich wird die virale cDNA unter Verwendung virus-spezifischer Primer und Sonden in einem Echtzeit-Thermocycler amplifiziert, gefolgt von der Berechnung der genomischen Kopienzahl der Proben basierend auf der Standardkurve.Der Hauptvorteil der EPA-Methode 1615 gegenüber anderen standardisierten Verfahren wie ISO 15216 liegt darin, dass sie speziell für Wasserproben entwickelt wurde und einen Enterovirus-Assay umfasst. Diese Methode kann Risikobewertern auf dem Gebiet der Umweltmikrobiologie den aktuellen Stand bei der Beurteilung des Risikos durch Viren in Trink- und Badegewässern liefern. Personen, die neu in dieser Methode sind, werden im Allgemeinen Schwierigkeiten mit der in das Verfahren integrierten Standardisierung haben. Die Methode ist sehr detailliert und muss genau befolgt werden. Eine visuelle Demonstration des Verfahrens ist entscheidend, da bereits geringfügige Abweichungen negative Folgen haben können. Heute demonstrieren das Verfahren Nichole Brinkman, Jennifer Cashdollar, Shannon Griffin und ich selbst, Shay Fout. Wir alle sind wissenschaftliche Mitarbeiter des Nationalen Forschungslabors für Exposition der EPA in Cincinnati, Ohio. Nachdem eine Standardkurve gemäß Textprotokoll vorbereitet wurde, bereiten Sie einen Zentrifugal-Konzentrator für jede gesammelte Probe vor, indem Sie mindestens 10 Milliliter 1X PBS und 2 % BSA in die obere Probenkammer geben. Nach einer Übernacht-Inkubation, dem Waschen und dem Hinzufügen der Proben gemäß dem Textprotokoll zentrifugieren Sie jede Testprobe in einem Schwenkkorbrotor bei 3000 bis 6000 × g und vier Grad Celsius für zwanzig bis dreißig Minuten.Nachdem die Probe angemessen konzentriert wurde und in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen überführt wurde, fügen Sie 0,15 molares Natriumphosphatpuffer hinzu, um das Endvolumen auf 400 Mikroliter plus/minus zwei Mikroliter einzustellen. Um die Nukleinsäuren zu extrahieren, geben Sie 200 Mikroliter Extraktionspuffer für eine negative Extraktionskontrolle und 200 Mikroliter des tertiären Konzentrats für jede Testprobe oder Standardkurvenverdünnung in separate Mikrozentrifugenröhrchen und extrahieren Sie die RNA gemäß den im Textprotokoll der Anweisungen des Herstellers des Extraktionskits beschriebenen Modifikationen. Nach der Vorbereitung der Primer und Sonden, wie im Protokoll beschrieben, bereiten Sie in einem sauberen Raum die Mastermischungen für die reverse Transkription eins und zwei vor, wie hier gezeigt.Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 16,5 Mikroliter RT-Mastermix 1 in die Vertiefungen jeder PCR-Platte. Verdünnen Sie anschließend die aufgetauten Feld- und Laborprobenmatrix oder LSFM-Proben mit dem Elutionspuffer des Nukleinsäure-Extraktionskits, der 400 Einheiten pro Milliliter RNase-Inhibitor enthält, im Verhältnis 1:5 und 1:25. Übertragen Sie 6,7 Mikroliter der Nukleinsäuren aus jeder Testprobe, Kontrolle und Standardkurve in separate Vertiefungen der PCR-Platte, wobei Triplicate für Testproben und Kontrollen sowie Duplikate für die Standardkurven verwendet werden.Geben Sie 6,7 µL Elutionspuffer in die No-Template-Control- oder NTC-Vertiefungen. Führen Sie zwei bis acht NTCs pro RT-Platte durch, wobei zwei für die erste Probe und anschließend zwei oder mehr für jede vierte zusätzliche Probe verwendet werden, wobei die negativen Kontrollen gleichmäßig über die Platte verteilt sind. Versiegeln Sie die PCR-Platte mit einem hitzebeständigen Plattenverschluss und stellen Sie sicher, dass jede Vertiefung dicht verschlossen ist. Anschließend mischen Sie die Proben fünf bis zehn Sekunden lang und zentrifugieren sie kurzzeitig mit mehr als oder gleich 500 ×g. In einem Thermocycler die Platte bei 99 Grad Celsius vier Minuten lang inkubieren. Die Platte auf 4 Grad Celsius abkühlen lassen und dann erneut kurz zentrifugieren. Anschließend die Plattenabdichtung vorsichtig entfernen und 16,8 Mikroliter RT-Master-Mix 2 in jedes Reaktionsgefäß geben. Nach dem Versiegeln der Platte sowie kurzem Mischen und Zentrifugieren die Platte in den Thermocycler stellen und folgendes Programm durchführen: 25 Grad Celsius für 15 Minuten, gefolgt von 42 Grad Celsius für 60 Minuten, dann 99 Grad Celsius für fünf Minuten und abschließend Halten bei 4 Grad Celsius für bis zu acht Stunden oder Probenaufbewahrung bei minus 70 Grad Celsius für einen längeren Zeitraum.In einem sauberen Raum bereiten Sie quantitative PCR-Master-Mixes unter Verwendung der Anleitungen für Enterovirus, Norovirus-Genogruppe I, Norovirus-Genogruppe II und Hepatitis G vor. Mischen Sie jeden Master-Mix und zentrifugieren Sie kurz. Geben Sie anschließend, wie in diesem Beispiel gezeigt, 14 Mikroliter der PCR-Master-Mixes in die entsprechenden Vertiefungen einer beschrifteten optischen Reaktionsplatte, wobei für jeden qPCR-Assay separate Platten verwendet werden. Geben Sie 6 Mikroliter der entsprechenden cDNA in die entsprechenden Vertiefungen. Mischen Sie danach die Proben und zentrifugieren Sie kurz.Richten Sie die Thermocycler-Software wie im Protokoll beschrieben ein und führen Sie den Hepatitis-G-qPCR-Assay an unverdünnten und verdünnten Feld- und Laborkontrollproben oder LFSM-Proben durch, bevor Sie alle anderen qPCR-Assays durchführen. Vergleichen Sie den mittleren Cq-Wert jeder Probe mit dem vorab bestimmten mittleren Hepatitis-G-Cq-Wert für jede neue Charge an Hepatitis-G-Reagenzien. Verwenden Sie die niedrigste Verdünnung der Feld- oder LDF-Probe, deren Cq-Wert weniger als ein Cq-Wert über dem mittleren Hepatitis-G-Cq-Wert liegt, für die Enterovirus- und Norovirus-qPCR-Assays.Richten Sie die Software des quantitativen PCR-Thermocyclers gemäß den Herstelleranweisungen ein. Kennzeichnen Sie die Proben für die Standardkurve als Standards, und geben Sie für jede Verdünnung der Standardkurve die hier angegebenen genomischen Kopienzahlen ein. Führen Sie den Lauf bei 95 Grad Celsius für zehn Minuten durch, gefolgt von 45 Zyklen mit 90 Grad Celsius für 15 Sekunden und 60 Grad Celsius für eine Minute.Überprüfen Sie, ob jede Standardkurve die in dieser Tabelle angegebenen akzeptablen Werte erfüllt. Nach Berechnung der Standardabweichung, der Steigung, des Bestimmtheitsmaßes (R²) und der prozentualen Effizienz gemäß den Gleichungen im textlichen Protokoll notieren Sie die von der Thermocycler-Software für alle Testproben berechneten Werte der genomischen Kopienzahl (GC) basierend auf Standardkurven, die die in dieser Tabelle festgelegten Kriterien erfüllen, sowie die mittleren GC-Werte für jede Probe. Bestimmen Sie die GC pro Liter für jede Testprobe mithilfe der folgenden Gleichung, wobei GC die zuvor berechnete mittlere genomische Kopienzahl ist.Der Faktor 199 ist der Gesamtverdünnungsfaktor für die Volumenreaktionen, die während der tertiären Konzentrationen stattfanden. RNA-Extraktion und RT-qPCR-Schritte. DF ist der Verdünnungsfaktor, der für die Hemmung kompensiert, und D ist das Volumen der ursprünglichen Wasserprobe in Litern.Berechnen Sie abschließend die Gesamt-GC von im Labor angereicherten Feldblankoproben (LFB) oder Laborreagenzblankoproben (LRB), indem Sie den zuvor bestimmten mittleren GC-Wert mit 199 multiplizieren und durch 0,3 dividieren. Insgesamt wurde die Virusrückgewinnung anhand gepaarter LFSM-Grundwasserproben aus insgesamt sieben Probensätzen ermittelt, die aus drei öffentlichen Aufbereitungsanlagen und einem privaten Brunnen gewonnen wurden. Die Impfdosen für die LFSM-Proben betrugen drei Millionen MPN von Poliovirus Typ drei und fünf Millionen PFU von murinem Norovirus.Murines Norovirus wurde für die anfängliche Einzel-Laborbewertung der EPA-Methode 1615 verwendet, da das Standardkurvenreagenz zum damaligen Zeitpunkt nicht verfügbar war. Bei Grundwasserproben betrug die mittlere Poliovirus-Rückgewinnung 20 % mit einem Standardfehler von 2 %, während die mittlere Rückgewinnung von murinem Norovirus 30 % mit einem Standardfehler von 3 % betrug. Die reguläre Feld-Grundwasserprobe für jedes LFSM wies keine nachweisbaren Enteroviren oder Noroviren auf. Im Labor angereicherte Blindproben (LFB) und Laborreagenz-Blindproben (LRB) wurden unter Verwendung von beimpftem und unbeimpftem Reagenzwasser gemessen.Die Rückgewinnung von Poliovirus lag durchschnittlich bei 44 % mit einem Standardfehler von 1 %, während die Rückgewinnung von murinem Norovirus durchschnittlich 4 % mit einem Standardfehler von 0,5 % betrug. Diese Abbildung zeigt typische Standardkurven für Enterovirus und Norovirus-Genogruppe II. Die Kurve der Norovirus-Genogruppe II erfüllt die Kriterien für Standardkurven mit einem Bestimmtheitsmaß (R-Quadrat) von 0,9987, einer Gesamtstandardabweichung von 0,14 und einer Effizienz von 101 %. Die Enterovirus-Kurve erfüllt die Leistungskriterien für Standardkurven mit einem Bestimmtheitsmaß von 0,9874, einer Gesamtstandardabweichung von 0,58 und einer Effizienz von 103 %, weist jedoch etwa eine 100-fach geringere Empfindlichkeit und damit eine höhere Nachweisgrenze im Vergleich zu den Norovirus-Kurven auf.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man wasserbürtige Enteroviren und Noroviren mittels RT-qPCR anreichern und nachweisen kann. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie für Proben mit geringer Trübung innerhalb von etwa acht Stunden durchgeführt werden. Für Proben mit höherer Trübung kann zusätzliche Zeit erforderlich sein, insbesondere im dritten Anreicherungsschritt.Während dieses Verfahrens ist es wichtig, die Proben vor der reversen Transkription vor RNase-Kontamination zu schützen. Vergessen Sie nicht, dass PCR eine sehr leistungsfähige und nützliche Technik ist. Maßnahmen wie die Trennung von Arbeitsplätzen und die Verwendung geeigneter Kontrollen sind notwendig, um falsch positive und falsch negative Ergebnisse zu minimieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

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Erkennung und Genogrouping von Noroviren aus Kinder-Hocker mit der TaqMan One-Step RT-PCR

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

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