Eine schnelle und zuverlässige Pipeline für bakterielle Transkriptomanalyse Fallstudie: Serin-abhängige Genregulation in Streptococcus pneumoniae

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen Überblick über die transkriptomischen Veränderungen in Bakterien zu geben, die unter einer bestimmten Bedingung auftreten. Dies wird erreicht, indem zunächst Bakterienzellen unter einer bestimmten Bedingung gezüchtet und geerntet werden. Als nächstes wird die Gesamt-RNA aus den geernteten Zellen isoliert und CDNA aus der RNA hergestellt.

Dann werden die CDNAs markiert und mit hauseigenen Mikroassay-Objektträgern hybridisiert. Schließlich wird der Objektträger gewaschen, wonach die Objektträger gescannt und analysiert werden. Letztendlich wird der Microarray verwendet, um die transkriptomischen Veränderungen in Bakterienzellen unter der spezifischen Bedingung darzustellen.

Der Hauptvorteil der DNA-Microarray-Technologie gegenüber anderen bestehenden Methoden zur Untersuchung der Genexpression wie QPCR oder Northern Blot besteht darin, dass sie einen globalen Überblick über alle transkriptomischen Veränderungen bietet, die unter einer bestimmten Bedingung auftreten. Es ist schnell, zuverlässig und relativ günstig. Mohammed Sal und Airon Manzu, PSD-Studenten aus meinem Labor für Molekulargenetik, werden das Verfahren demonstrieren. Nach dem Auftauen, s pmo, ED 39 Zellpellets und Resus, die in 400 Mikrolitern te gemäß dem Textprotokoll suspendiert sind, bereiten Sie Folgendes in RNA-freien Schraubverschlussröhrchen vor, 0,5 Gramm Glasperlen, 50 Mikroliter 10% SDS, 500 Mikroliter zuvor hergestelltes Phenolchloroform und die resuspendierten Zellpellets.

Um die Zellen zu brechen, legen Sie die Röhrchen in einen Rührbesen und homogenisieren Sie sie zweimal für jeweils 60 Sekunden, wobei Sie sie zwischen den Impulsen eine Minute lang auf Eis legen, dann zentrifugieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 10.000 g und vier Grad Celsius. Die obere Phase wird in ein frisches Röhrchen überführt, bei 500 Mikrolitern Chloroform i a, a und weitere fünf Minuten zentrifugiert. Pipettieren Sie 500 Mikroliter aus der oberen Phase in frische Röhrchen.

Fügen Sie zwei Volumina Lysebindungspuffer hinzu und mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren. Isolieren Sie dann mit einem RNA-Isolationskit die Gesamt-RNA gemäß dem Protokoll des Herstellers, um kontaminierende DNA aus der RNA zu entfernen. Fügen Sie 100 Mikroliter D a's one mix hinzu und inkubieren Sie bei 15 bis 25 Grad Celsius für 20 bis 30 Minuten.

Verwenden Sie das Kit von RN a, um die gereinigte RNA und Elue in ein Volumen von 50 Mikrolitern zu waschen, um die kniende Reaktion in 300-Mikroliter-PCR-Röhrchen durchzuführen. Mischen Sie die Gesamt-RNA mit zwei Mikrolitern zufälliger Monomere und verwenden Sie bei Bedarf nukleasefreies Wasser, um das Volumen auf 18 Mikroliter zu erhöhen. Inkubieren Sie die kniende Mischung fünf Minuten lang bei 70 Grad Celsius.

Kühlen Sie die Reaktionen dann 10 Minuten lang bei Raumtemperatur ab und drehen Sie sie kurz, bevor Sie die Röhrchen mindestens eine Minute lang auf Eis legen. Um CDNA rückwärts zu transkribieren, bereiten Sie die reverse Transkriptionsmischung vor, kombinieren Sie 18 Mikroliter der Mischung mit 12 Mikrolitern Mastermix und inkubieren Sie die Reaktion zwei bis 16 Stunden lang bei 42 Grad Celsius. Bauen Sie die mRNA aus der Reaktion ab, indem Sie drei Mikroliter 2,5 molare und ein OH hinzufügen und etwa 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius platzieren.

Fügen Sie dann 15 Mikroliter von zwei Molhaufen freier Säure hinzu, um die NAOH zu neutralisieren. Nachdem Sie die CDNA mit PCR-Aufreinigungssäulen mit einem Spektralphotometer aufgereinigt haben, messen Sie die CDNA-Konzentration, um die CDNA zu markieren. Fügen Sie fünf Mikroliter eines am mittleren Reaktivfarbstoffs zu 20 bis 60 Nanogramm pro Mikroliter CDNA hinzu.

Legen Sie die Mischung 60 bis 90 Minuten lang in den dunklen und inkubierten Raum, bevor Sie PR-Reinigungssäulen verwenden, um den farbstoffmarkierten CDNA in 50 Mikrolitern Evolutionspuffer mit einem Spektralphotometer zu reinigen, und stellen Sie sicher, dass die Konzentration der markierten CDNA mindestens 0,5 Pikomol pro Mikroliter in einem Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern beträgt. Nach der Zubereitung des schüchternen Puffers gemäß dem Textprotokoll den Puffer mindestens 30 Minuten auf 68 Grad Celsius vorheizen. Um die Probe vorzubereiten, kombinieren Sie gleiche Mengen markierter CDNAs und verwenden Sie dann Vakuumkonzentratoren bei hoher Temperatur, um das Volumen auf sieben Mikroliter oder weniger zu reduzieren.

In der Zwischenzeit, um die Lifter-Slips zu reinigen, um das Hintergrundsignal zu reduzieren, verwenden Sie Seife und viel Leitungswasser, gefolgt von 100% Ethanol, nachdem Sie die Lifter-Slips nach dem Föhnen getrocknet haben, legen Sie einen mit dem weißen Teflonfutter nach unten auf eine Folie. Als nächstes lösen Sie die getrockneten Farbstoffproben in sieben Mikrolitern H2O auf und inkubieren zwei Minuten lang bei 94 Grad Celsius. Sofort 35 Mikroliter vorgewärmten Puffer hinzufügen, vorsichtig mischen und eine Minute lang bei maximaler Geschwindigkeit schleudern.

Um Ausfällungen zu pelletieren, heizen Sie die Sonde vor dem Beladen etwa fünf Minuten lang auf 68 Grad Celsius vor. Um die Rutsche und den Lifter-Slip zusammenzubauen, platzieren Sie den Hybridisierungs-Schlittenhalter auf einem Heizblock bei 50 Grad Celsius. Legen Sie DNA-Microarray-Objektträger mit dem Lifter-Slip auf den beheizten Hybridisierungs-Slide-Halter und heizen Sie den Slide mit dem Lifter-Slip eine Minute lang vor.

Geben Sie dann so schnell wie möglich 40 Mikroliter des Probenziels an das Ende des Objektträgers. Lassen Sie die Flüssigkeit durch Kapillarkraft zwischen den Glasoberflächen fließen. Nehmen Sie nun die vorgewärmte Hybridisierungskassette aus dem Hybridisierungsofen und schließen Sie die Maschine.

Legen Sie dann mit drei Millilitern von zwei XSSC getränktes Filterpapier in die Hybridisierungskassette. Setzen Sie den Hybridisierungs-Objektträgerhalter mit den Dias vorsichtig in die Hybridisierungskassette ein. Schließen Sie die Hybridisierungskassette und stellen Sie sie wieder in den Hybridisierungsofen und inkubieren Sie sie 16 bis 18 Stunden lang.

Bereiten Sie zum Waschen der Objektträger die frischen Waschpuffer eins, zwei und drei vor und stellen Sie sie auf 30 Grad Celsius. Um sicherzustellen, dass sich das SDS nach Abschluss der Inkubation auflöst, tauchen Sie die Objektträger so schnell wie möglich vorsichtig in ein Falcon-Röhrchen, das mit 50 Millilitern Waschpuffer gefüllt ist, bis das Glas am Boden des Röhrchens aufliegt. Nachdem der Heber verrutscht ist und auf den Boden des Röhrchens gesunken ist, ohne das Array zu zerkratzen, entfernen Sie den Schieber mit einer Pinzette und legen Sie ihn in das Gestell der Waschstation.

Verwenden Sie sofort 500 Milliliter Waschpuffer eins, um die Objektträger fünf Minuten lang zu waschen. Übertragen Sie dann die Objektträger für 20 bis 30 Minuten in den Waschpuffer zwei, bevor Sie sie für fünf Minuten in 500 Milliliter Waschpuffer drei übertragen. Trocknen Sie die Objektträger abschließend zwei Minuten lang bei 2000 U/min, bevor Sie eine Microarray-Analyse durchführen.

Gemäß dem Textprotokoll zur Untersuchung des Einflusses von L-Serin auf das gesamte Transkriptom der S-Pneumonie wurde eine Microarray-Analyse des D39-Wildtyp-Stammes durchgeführt, der in CDM mit 150 Mikromolaren der L-Seine gezüchtet wurde, verglichen mit dem, der in 10 Millimolaren L-Seine im selben Medium gezüchtet wurde. In dieser Tabelle sind die Konzentrationen der Gesamt-RNA aufgeführt, die aus jeder Kultur isoliert wurden, wie in dieser Abbildung dargestellt. Nach der Entnahme der DNA wurde die Qualität der RNA untersucht.

Diese beiden Spuren repräsentieren RNA aus 150 mikromolaren Seine, und diese beiden Spuren stammen aus Kulturen, die mit 10 millimolaren Waden gezüchtet wurden. Das Vorhandensein von zwei durchsichtigen Banden deutet auf eine gute RNA-Qualität hin. In dieser Spalte sind die Konzentrationen von CDNA, die aus der Gesamt-RNA synthetisiert wurden, und die Konzentrationen der mittleren AM-Reaktivfarbstoff-markierten Proben sind hier aufgeführt.

In dieser Abbildung ist eine Streudiagrammanalyse des mittleren Verhältnisses von AM reaktiven Dies zu sehen, und die Daten wurden weiter analysiert, um das Rauschen zu reduzieren. Diese Tabelle fasst die Ergebnisse der Microarray-Studien zusammen, nachdem die Kriterien größer oder gleich auf eine zweifache Differenz und einen P-Wert von weniger als 0,001 angewendet wurden. Wie hier zu sehen ist, wurden eine Reihe von Genen in Gegenwart von minimalem L-Serin im Vergleich zum Maximum unterschiedlich exprimiert. Nach diesem Verfahren wurde eine Reihe von Genen unterschiedlich exprimiert.

Andere Methoden wie Beag, Elektrozytenassays, QPCR, Knockout und/oder Expressionsstärke können verwendet werden, um die anstehenden Fragen nach seiner Entwicklung zu beantworten. Diese Technik ermöglichte es den VFR-Forschern auf dem Gebiet der Molekular- und Zellbiologie, die regulatorischen Netzwerke und Mechanismen in RAM positiv zu untersuchen.