Eine schnelle und zuverlässige Pipeline für bakterielle Transkriptomanalyse Fallstudie: Serin-abhängige Genregulation in

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen Überblick über die transkriptomischen Veränderungen bei Bakterien unter einer bestimmten Bedingung zu geben. Dies wird erreicht, indem zunächst bakterielle Zellen unter einer spezifischen Bedingung kultiviert und geerntet werden. Anschließend wird die gesamte RNA aus den geernteten Zellen isoliert und cDNA aus der RNA hergestellt.

Dann werden die cDNAs markiert und auf hausinternen Mikroarray-Slides hybridisiert. Abschließend wird der Slide gewaschen, anschließend werden die Slides gescannt und analysiert. Letztendlich dient der Microarray dazu, die transkriptomischen Veränderungen in bakteriellen Zellen unter der spezifischen Bedingung darzustellen.

Der Hauptvorteil der DNA-Microarray-Technologie gegenüber anderen bestehenden Methoden zur Untersuchung der Genexpression wie QPCR oder Northern Blotting besteht darin, dass sie einen globalen Überblick über alle transkriptomischen Veränderungen unter einer bestimmten Bedingung bietet. Sie ist schnell, zuverlässig und vergleichsweise kostengünstig. Die Durchführung der Prozedur übernehmen Mohammed Sal und Airon Manzu, PSD-Studenten aus meinem Labor für molekulare Genetik. Nach dem Auftauen von s pmo, ED 39 Zellpellets und deren Resuspension in 400 Mikrolitern TE gemäß dem Textprotokoll bereiten Sie Folgendes in RNA-freien Schraubkappenröhrchen vor: 0,5 Gramm Glaskügelchen, 50 Mikroliter 10 %iger SDS, 500 Mikroliter zuvor hergestelltes Phenol-Chloroform und die resuspendierten Zellpellets.

Um die Zellen zu lysieren, setzen Sie die Röhrchen in einen Bead-Beater und homogenisieren zweimal je 60 Sekunden lang, wobei Sie zwischen den Impulsen eine Minute auf Eis legen. Zentrifugieren Sie die Proben anschließend bei 10.000 G und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Überführen Sie die obere Phase in ein neues Röhrchen und geben Sie 500 Mikroliter Chloroform zu. Zentrifugieren Sie erneut für fünf Minuten. Pipettieren Sie 500 Mikroliter der oberen Phase in frische Röhrchen.

Geben Sie zwei Volumina Lysierpuffer hinzu und mischen Sie durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Isolieren Sie anschließend mithilfe eines RNA-Isolationskits die Gesamt-RNA gemäß der Herstelleranleitung, um kontaminierende DNA aus der RNA zu entfernen. Fügen Sie 100 Mikroliter D's-eins-Mix hinzu und inkubieren Sie bei 15 bis 25 Grad Celsius für 20 bis 30 Minuten.

Verwenden Sie das RN a's-Kit, um die gereinigte RNA zu waschen, und eluieren Sie in einem Volumen von 50 Mikrolitern, um die an kneeling-Reaktion in 300-Mikroliter-PCR-Röhrchen durchzuführen. Mischen Sie die gesamte RNA mit zwei Mikrolitern zufälliger Monomere und verwenden Sie gegebenenfalls nukleasefreies Wasser, um das Volumen auf 18 Mikroliter aufzufüllen. Inkubieren Sie das an kneeling-Gemisch bei 70 Grad Celsius für fünf Minuten.

Kühlen Sie die Reaktionen anschließend 10 Minuten bei Raumtemperatur ab und zentrifugieren Sie sie kurz, bevor Sie die Röhrchen mindestens eine Minute lang auf Eis stellen. Um cDNA umzuschreiben, bereiten Sie die Reverse-Transkriptionsmischung vor, geben 18 Mikroliter der Mischung zu 12 Mikrolitern der Mastermischung hinzu und inkubieren die Reaktion zwei bis 16 Stunden bei 42 Grad Celsius. Degradieren Sie die mRNA aus der Reaktion, indem Sie drei Mikroliter einer 2,5-molaren NaOH-Lösung hinzufügen, und stellen Sie sie etwa 15 Minuten bei 37 Grad Celsius ein.

Dann 15 Mikroliter zweimolares hepesfreie Säure hinzufügen, um das NaOH zu neutralisieren. Danach die cDNA mit PCR-Reinigungssäulen reinigen und mit einem Spektrophotometer die cDNA-Konzentration bestimmen, um die cDNA zu markieren. Fügen Sie fünf Mikroliter eines amino-reaktiven Farbstoffs zu 20 bis 60 Nanogramm pro Mikroliter cDNA hinzu.

Stellen Sie die Mischung im Dunkeln bei Raumtemperatur 60 bis 90 Minuten lang inkubieren, bevor Sie PR-Reinigungssäulen verwenden, um die mit Farbstoff markierte cDNA aufzubereiten, die in 50 Mikroliter Elutionspuffer eluiert wird. Mit einem Spektrophotometer sicherstellen, dass die Konzentration der markierten cDNA mindestens 0,5 Pikomol pro Mikroliter in einem Gesamtvolumen von 50 Mikroliter beträgt. Nach der Zubereitung des Hybridisierungspuffers gemäß dem Textprotokoll den Puffer mindestens 30 Minuten lang auf 68 Grad Celsius vorheizen. Zum Probenvorbereiten gleiche Mengen der markierten cDNAs kombinieren und anschließend Vakuumkonzentratoren bei hoher Temperatur verwenden, um das Volumen auf sieben Mikroliter oder weniger zu reduzieren.

Unterdessen, um die Lifter-Slips zu reinigen und das Hintergrundsignal zu verringern, verwenden Sie Seife und viel Leitungswasser, gefolgt von 100 % Ethanol, nachdem Sie die Lifter-Slips abgetrocknet haben. Platzieren Sie einen Slip mit der weißen Teflon-Beschichtung nach unten auf einem Objektträger. Lösen Sie anschließend die getrockneten Farbstoffproben in sieben Mikrolitern H2O auf und inkubieren Sie zwei Minuten bei 94 Grad Celsius. Geben Sie danach sofort 35 Mikroliter vorgewärmten shy-Puffer hinzu, mischen Sie vorsichtig und zentrifugieren Sie eine Minute bei maximaler Geschwindigkeit.

Um die Niederschläge zu pelletieren, den Probengefäß vorheizen, indem es etwa fünf Minuten lang auf 68 Grad Celsius erwärmt wird, bevor es beladen wird. Um den Objektträger und den Heberzettel zusammenzubauen, den Hybridisierungs-Objektträgerhalter auf einen Heizblock bei 50 Grad Celsius stellen. Die DNA-Microarray-Objektträger mit dem Heberzettel auf den beheizten Hybridisierungs-Objektträgerhalter legen und den Objektträger mit dem Heberzettel eine Minute lang vorheizen.

Danach so schnell wie möglich 40 Mikroliter des Probenziels an das Ende des Objektträgers geben. Das Fluid durch Kapillarkraft zwischen den Glasoberflächen fließen lassen. Nun die vorgewärmte Hybridisierungskassette aus dem Hybridisierungsbrutschrank nehmen und das Gerät schließen.

Danach Filterpapier, das mit drei Milliliter 2x SSC getränkt ist, in die Hybridisierungskassette legen. Den Hybridisierungsschieber mit den Objektträgern vorsichtig in die Hybridisierungskassette geben. Die Hybridisierungskassette schließen und zurück in den Hybridisierungsofen stellen, anschließend 16 bis 18 Stunden inkubieren.

Zur Wäsche der Objektträger bereiten Sie frische Waschpuffer eins, zwei und drei vor und bringen Sie auf 30 Grad Celsius. Um sicherzustellen, dass das SDS sich auflöst, sobald die Inkubation abgeschlossen ist, tauchen Sie die Objektträger so schnell wie möglich vorsichtig in ein Falcon-Röhrchen, das mit 50 Milliliter Waschpuffer eins gefüllt ist, bis das Glas den Boden des Röhrchens erreicht. Sobald der Heber abrutscht und ohne das Array zu beschädigen auf den Boden des Röhrchens sinkt, entfernen Sie den Objektträger mit einer Pinzette und legen ihn in das Gestell der Waschstation.

Verwenden Sie unmittelbar 500 Milliliter Waschpuffer eins, um die Objektträger fünf Minuten lang zu waschen. Anschließend überführen Sie die Objektträger in Waschpuffer zwei für 20 bis 30 Minuten, bevor Sie sie in 500 Milliliter Waschpuffer drei für fünf Minuten überführen. Trocknen Sie die Objektträger abschließend bei 2000 U/min für zwei Minuten, bevor Sie die Mikroarray-Analyse durchführen.

Entsprechend dem Textprotokoll zur Untersuchung der Wirkung von L-Serin auf das gesamte Transkriptom von S. pneumoniae wurde eine Microarray-Analyse des D39-Wildtyp-Stamms durchgeführt, der in CDM mit 150 Mikromolar L-Serin im Vergleich zu 10 Millimolar L-Serin im gleichen Medium kultiviert wurde. Diese Tabelle listet die Konzentrationen der aus jeder Kultur isolierten Gesamt-RNA auf, wie in dieser Abbildung dargestellt. Nach Entfernung der DNA wurde die Qualität der RNA überprüft.

Diese beiden Bahnen repräsentieren RNA aus 150 Mikromolar Seine und diese beiden Bahnen stammen aus Kulturen, die mit 10 Millimolar Seine gezüchtet wurden. Das Vorhandensein von zwei deutlichen Banden weist auf hochwertige RNA hin. Die Konzentrationen von cDNA, die aus Gesamt-RNA synthetisiert wurde, sind in dieser Spalte verzeichnet, und die der AM-Mean-Reaktionsfarbstoff-markierten Proben sind hier aufgelistet.

Eine Streudiagrammanalyse des mittleren reaktiven Verhältnisses der AM-Farbstoffe ist in dieser Abbildung dargestellt, und die Daten wurden weiter analysiert, um Rauschen zu reduzieren. Diese Tabelle fasst die Ergebnisse der Microarray-Studien zusammen, nachdem die Kriterien einer mehr als oder gleich zweifachen Differenz und eines P-Werts von weniger als 0,001 angewendet wurden. Wie hier zu sehen ist, wurden eine Reihe von Genen unterschiedlich exprimiert, wenn minimales L-Serin im Vergleich zum maximalen vorhanden war, nachdem dieses Verfahren angewendet wurde.

Andere Methoden wie beag, Elektrozyten-Assays, QPCR, Knockout- und Expressionsstärkenanalysen können verwendet werden, um die nachfolgenden Fragen nach der Entwicklung zu beantworten. Diese Technik ermöglichte es den VFR-Forschern im Bereich der Molekular- und Zellbiologie, die regulatorischen Netzwerke und Mechanismen in RAM-positiven Systemen zu untersuchen.