Name: Eine schnelle und zuverlässige Pipeline für bakterielle Transkriptomanalyse Fallstudie: Serin-abhängige Genregulation in Streptococcus pneumoniae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Erfahren Sie die bakterielle Transkriptomanalyse mit DNA-Microarrays und maßgeschneiderter Software. Diese Methode ermöglicht globale Genexpressionsstudien in Streptococcus pneumoniae unter spezifischen Bedingungen.

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Wir danken Anne de Jong und Siger Holsappel für die Hilfe bei der DNA-Microarrays Schiebe Produktion. Unterstützung Anne de Jong für bioinformatische Analyse wird auch geschätzt. Wir danken auch Jelle Slager zur Überprüfung des Papiers. Muhammad Afzal und Irfan Manzoor werden von der GC-Universität, Faisalabad, Pakistan unter der Fakultätsentwicklungsprogramms der HEC Pakistan unterstützt.

1. Vorbereitung der Medien und Zellkultur <ol><li> Wachsen S. pneumoniae D39 Wildtyp-Stamm 21, wie zuvor 11 beschrieben. Beimpfen von Zellen bei -80 ° C in 10% Glycerin (mit 1/100 Verhältnis in 50 ml sterile Röhrchen) in 50 ml chemisch definiertem Medium (CDM) mit einem End-pH von 6,4 15 gespeichert, aber ohne L-serin aus dem Aminosäure Mischung. Hinweis: zwei verschiedene CDM verwendet wurden; eine mit einer Mindestkonzentration von L-Serin (150 uM), und die andere, die eine maximale Konzentration von L-Serin (10 mM). Diese Mindestkonzentration ist im Allgemeinen die Konzentration von L-Serin im menschlichen Blutplasma, und das Ziel ist es, die Genexpression von S. vergleiche pneumoniae D39-Stamm unter diesen beiden Bedingungen. </li></ol> 2. Isolierung von Gesamt-RNA <ol><li> Materialien <ol><li> Verwenden Säure Phenol, RNA-Note für die Isolierung von Gesamt-RNA. </li><li> Macaloid: <ol><li> Suspend 2 GrammMacaloid in 100 ml TE und kochen für 5 min. Abkühlen auf RT und beschallen bis Macaloid gels.Centrifuge die Lösung bei 2000 × g für 5 min bei RT, Resuspendieren in 50 ml TE pH 8 und bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Lösungen: <ol><li> Behandeln Sie alle Lösungen mit Diethylpyrocarbonat (DEPC). 100 l DEPC / 100 ml Lösung, Inkubation O / N bei 37 ° C und Autoklaven für 15 min. </li></ol></li></ol></li><li> Methodik <ol><li> Wachsen 50 ml S. pneumoniae D39 Zellkultur in 50 ml-Röhrchen bei 37 ° C (ohne Schütteln) bis Mitte exponentiellen Phase (OD ~ 0.3). Centrifuge Kulturen bei 4 ° C auf 10.000 × g für 2 min. Entsorgen Medien und unverzüglich sperren Zellpellets in flüssigem Stickstoff. </li><li> Vormischung 300 ul Chloroform: IAA (24: 1) und 300 &amp; mgr; l Phenol (Säure Phenol, RNA-Qualität). Verwenden 500 &amp; mgr; l der organischen Phase in Schritt 2.2.3. </li><li> Bereiten Sie die folgende Mischung im Voraus in RNA-free-Schraube Kappe Rohre: 00,5 g Glasperlen, 50 ul 10% SDS, 500 ul Phenol / Chloroform: IAA (wie in Schritt 2.2.2 vorbereitet), Macaloid Schicht (150 bis 175 &amp; mgr; l, nicht fordern, wie es ist sehr viskos). Resuspendieren der Zellpellets in 400 ul TE (DEPC) und fügen Sie die resuspendierten Zellen in den Schraubverschluss Röhrchen. </li><li> Um die Zellen zu brechen, legen Sie die Schraubverschluss Röhrchen in einem Kugelmühle für 2x 60 &quot;Impulse (&quot; homogenisieren &quot;) mit 1 min Pause auf dem Eis. Zentrifuge werden die Proben für 10 min bei 10.000 × g (4 ° C). </li><li> Wird die obere Phase in ein frisches Röhrchen, 500 ul Chloroform: IAA (24: 1) und Zentrifuge 5 min bei 10.000 × g (4 ° C). </li><li> Übertragen Sie 500 ul der oberen Phase in frische Röhrchen, fügen Sie 2 Volumina (1 ml) der Lyse / Bindungspuffer und mischen durch Auf-und Abpipettieren. Isolieren der Gesamt-RNA unter Verwendung der RNA-Isolierung Kit und folgen Sie den Hersteller empfohlenen Protokoll. </li></ol></li></ol> 3. RNA Cleanup &lt;<html> ol&gt; <li> Um die Kontamination von DNA aus Gesamt-RNA zu entfernen, fügen Sie 100 ul DNAseI Mix (90 ul DNAse Puffer und 10 ul DNAseI) und Inkubation für 20 bis 30 min bei 15-25 ° C. </li><li> Wash gereinigt RNA unter Verwendung des RNAse-Kit. Zu erhalten 50 &amp; mgr; l der eluierten Volumens. </li></ol> 4. Analyse der RNA <ol><li> Bestimmen Sie die Konzentration der RNA auf einem Spektrophotometer. Bestimmen die Qualität der RNA durch die Verwendung eines Assay folgendermaßen (Abbildung 2). <ol><li> Verdünnen Sie 1 ul Probe mit 50 ul DEPC-Wasser auf eine Konzentration von 20 bis 200 ng / ul erhalten. </li><li> Verwenden Sie 1 ul verdünnt RNA-Probe, um die Qualität auf dem Bioanalyzer gemäß den Anweisungen des Herstellers zu überprüfen. </li></ol></li><li> Hinweis: ein Verhältnis von 23S: 16S von etwa 2,0 als gut 1 A260 Einheit RNA entspricht 40 &amp; mgr; g / ml.. Eine empfohlene Menge für Kennzeichnung ist 10-20 &amp; mgr; g. </li></ol> 5. cDNA Vorbereitung und Kennzeichnung ntent &quot;&gt; Hinweis: Das folgende Protokoll wurde für die cDNA-Zubereitung und Kennzeichnung gefolgt. <ol><li> Glühen <ol><li> Führen Annealingreaktion in 300 ul PCR-Röhrchen, wobei die Konzentration von Gesamt-RNA von 10 bis 15 &amp; mgr; g für hausgemachte Dias oder 5 ug für Unternehmen gemachten Folien. Mix-RNA mit 2 &amp; mgr; Zufalls Nonamere (1,6 pg / pl) und fügen Sie Nuklease-freies Wasser, wenn notwendig, die endgültige Volumen des Glühen Mischung auf 18 &amp; mgr; l zu halten. </li><li> Halten Sie die Annealing-Mischung bei 70 ° C für 5 min. Danach kühlen die Mischung auf RT für 10 min (Annealing) und, wenn nötig, Spin-down die Reaktionen auf den Boden des Rohrs. Platzieren Sie die Reaktionsröhrchen auf Eis für mindestens 1 min. </li></ol></li><li> Reverse Transkription <ol><li> Bereiten Sie die Reverse-Transkriptase-Mischung wie folgt: 18 &amp; mgr; Glühen Mischung, fügen Sie 12 ul-Master-Mix (bestehend aus 6 ul 5x First Strand Buffer, 3 ul 0,1 M DDT, 1,2 ul 25x AA-dUTP / Nukleotid-Mischung und 1,8 ul Reverse transcriptase (1 ul für Unternehmen gemachten Folien). Halten Sie die Reaktionsmischung für 2-16 h bei 42 ° C. </li></ol></li></ol> 6. Abbau von mRNA und Reinigung von cDNA <ol><li> Um die mRNA aus dem Reaktionsgemisch verschlechtern, werden 3 ul 2,5 M NaOH, bei 37 ° C für etwa 15 min. Nach Zusatz von 15 ul 2 M HEPES-freie Säure, um die NaOH neutralisieren. </li><li> Reinige den cDNA-Gemisch unter Verwendung von PCR Clean-up-Säulen und folgen Sie dem Protokoll des Herstellers. </li></ol> 7. Messung der cDNA-Konzentration <ol><li> Messen cDNA Konzentrationen auf einem Spektrophotometer. Um mit Beschriftungs weiterhin sicherstellen, dass die Konzentration der cDNA mindestens 60 ng / ul (hausgemachte Folien) oder 20 ng / ul (Unternehmen gemachten Folien). </li></ol> 8. Kennzeichnung von cDNA mit aminreaktiven Farbstoff und Reinigung <ol><li> Verwenden aminreaktiven Farbstoffes, um die cDNA zu markieren. Direkt mischen die cDNA mit einem Aliquot (5 ul)Amin-reaktive Farbstoff. </li><li> Inkubieren der Mischung bei RT im Dunkeln für 60 bis 90 min und direkt auf die Reinigung von Farbstoff-markierten cDNA. Reinige farbstoffmarkierte cDNA unter Verwendung von PCR Clean-up-Säulen und nach Herstellerprotokoll. Eluieren cDNA in 50 &amp; mgr; l Elutionspuffer. </li></ol> 9. Messung der markierten cDNA <ol><li> Verwenden eines Spektrophotometers, um den Einbau von aminreaktiven Farbstoffen in das cDNA messen. Überprüfen, dass die Konzentration von Amin-reaktiven Farbstoffe mindestens 0,5 pmol / ul in einem Gesamtvolumen von 50 ul. </li></ol> 10. Mischen von markierten cDNA-Proben <ol><li> Für hausgemachte Folien, verwenden alle markierten cDNA zur Hybridisierung mit nicht mehr als 30% Unterschied in der cDNA-Konzentration. Für Unternehmen gemachten Folien verwenden cDNA mit nicht mehr als 2-fachen Unterschied in der cDNA-Konzentration. Anmerkung: In der Regel werden etwa 300 ng cDNA für Firmen hergestellte Folien benötigt, was im Vergleich zu dem req sehr weniguired Menge an cDNA für hausgemachte Folien. </li></ol> 11. Die Hybridisierung und Waschen <ol><li> Verwenden Sie die folgenden Reagenzien: demi Wasser, Ethanol 99%, schüchtern Buffer (hausgemachte, mit 40 ul Hefe-RNA). Bereiten maximal 1 ml SHY. </li><li> Geräte und Lösungen Zubereitung <ol><li> Schalten Sie Vakuumkonzentratoren und Heizung mindestens 1 Stunde vor dem Trocknen. Schalten Sie Hybridisierungsofen, mit auf den richtigen Hybridisierungstemperatur eingestellten Sollwert (für S. pneumoniae DNA-Microarrays, verwenden 45 ° C). Ebenso vorheizen Hybridisierung Kassette und Ofen für 30-60 Minuten. </li><li> Heizen Sie SHY Puffer bei 68 C für mindestens 30 min. </li></ol></li><li> Probenvorbereitung (markierter cDNA) <ol><li> Kombinieren Sie gleiche Mengen von markierten cDNAs (max 30% Unterschied). Trocknen Sie die Probe mit Hilfe der Vakuum-Konzentratoren bei hoher Temperatur (ca. 40 Min.), Bis das Volumen ist kleiner als 7 &amp; mgr; l. </li></ol></li><li> Lifter-Rutsch- <ol><li> Verwenden Sie saubere Heber rutscht.Anmerkung: ± 30 &amp; mgr; l auf die Objektträger eingelegt werden. </li><li> Reinigen Sie die Heber-Zettel mit Seife, reichlich Leitungswasser und 100% Ethanol. Hinweis: Schmutzige Heber rutscht geben Hoch Hintergrund. </li><li> Lufttrocknen Heber-Zettel mit Luftpistole wegblasen Staubpartikel. Ein sauberes Heber-Rutsch auf der Folie mit dem weißen Teflon-Auskleidung an den Seiten zeigen nach unten. </li></ol></li><li> Hinzufügen Hybridisierungspuffer (zum markierten cDNA) <ol><li> Man löst die getrocknete Farbstoffproben in 7 ul H &amp; sub2; O und Inkubation bei 94 ° C für 2 min. </li><li> Unmittelbar, fügen 35 ul vorerhitzt SHY-Puffer (68 ° C), sanft und Schleuder Mischen bei maximaler Geschwindigkeit für 1 min auf der Ausscheidungen loszuwerden. Heizen Sie die Sonde bei 68 C etwa 5 min bis zum Verladen. </li></ol></li><li> Slide-Lifter-Rutsch-Montage und Vorwärmung. <ol><li> Legen Sie die Hybridisierung Diahalter auf einem Wärmeblock bei 50 ˚C. Zeigen DNA Microarray-Slides mit dem Lifter-Slip auf der beheizten Hybridisierung Diahalter und perwärmen Sie die Folie mit Lifter-Rutsch für eine Minute. Führen Sie die weiteren Schritte so schnell wie möglich. </li><li> Man fügt 40 ul der Probenziel zu dem Ende der Rutsche. Lassen Sie die Flüssigkeit zwischen den Glasflächen durch Kapillarkräfte fließt. Führen Sie alle Pipettieren langsam und vorsichtig. </li><li> Halten Sie die Folien mit Lifter feste horizontale jederzeit und bewegen sich langsam, um sicherzustellen, dass der Heber-Rutsch bewegte sich nicht. </li><li> Nehmen Sie die vorgewärmte Hybridisierungskassette aus dem Hybridisierungsofen und schließen Sie das Gerät. Platz Filterpapier mit 3 ml 2 × SSC (Standard-Kochsalzlösung-Citrat) in der Hybridisierungs Kassette eingeweicht. </li><li> Legen Sie vorsichtig die Hybridisierung Diahalter mit Rutschen in der Hybridisierungs Kassette. Schließen Hybridisierung Kassetten und in der Hybridisierung setzen Ofen erneut (für ca. 16-18 h). </li></ol></li><li> Slide Wasch <ol><li> Bereiten Sie frischen Waschpuffer I, II und III (750 ml pro Waschschritt). Für 500 ml Waschpuffer I, verwenden Sie 2 x SSC / 0,5% SDS. Für 500 ml Wasch Buffäh II, verwenden Sie 1 x SSC / 0,25% SDS. Für 500 ml Waschpuffer III, verwenden Sie 1 x SSC / 0,1% SDS (optional) </li><li> Legen Sie die Waschpuffer bei 30 ° C (um sicherzustellen, dass SDS gelöst ist). </li><li> Tauchen Sie die Folien so schnell wie möglich, aber sehr leicht, in einem Falcon-Röhrchen mit 50 ml gefüllten Waschpuffer I, bis das Glas ruht auf dem konischen Boden des Röhrchens. </li><li> Nach ein paar Sekunden, wenn der Heber-slip sinkt auf den Boden des Röhrchens, nehmen Sie die Folie mit einer Pinzette, ohne zu kratzen das Array und im Rack der Waschstation setzen. Fahren Sie mit dem Waschen ohne Zeitlücke. </li><li> Waschen Sie die Objektträger für 5 min in 500 ml Waschpuffer I (in einer Waschstation). Geben Sie ihm einen zweiten Wasch 20-30 min in 500 ml Waschpuffer II (in einer Waschstation). Ebenso, waschen Sie die Objektträger für 5 min in 500 ml Waschpuffer III (optional) (in einer Waschstation). </li><li> Trocknen der Objektträger für 2 min bei 2.000 Upm. </li></ol></li></ol> 12. Microarray-Analyse <ol><li> Scannen von Bildernmit jeweiligen Wellenlängen in Scanner und speichern Sie in einem Ordner &quot;Jove Project&quot;. </li><li> Verwenden Sie Software, um die gescannten Dateien zunächst analysieren, wie zuvor beschrieben, 22. Nach dem Ausführen der Software, wählen Sie die Registerkarte &quot;Bild öffnen&quot;, um den Rote-Image-Datei (-.550) als &quot;Rot&quot; und grünen Bilddatei (-.635) so laden &quot;Grüne&quot;. Laden Sie die Datei gal (.gal) mit S. pneumoniae Array-Liste auf Image-Datei, indem Sie &quot;Load Array List&quot; Lasche 22. Hinweis: Diese Liste Array bestand aus 48 Gitter, auf jeden Gitter gab es 16 Zeilen und 15 Spalten. Jeder Punkt in der Startaufstellung steht ein einzelnes Gen und Spot Information einschließlich Gen-Name wird durch eine Punktbeschreibungsdatei hinzugefügt. Die Punktzahlen werden von links nach rechts und von oben nach unten gegeben. </li><li> Nach sorgfältiger Auffinden des Grids, wählen Sie das Register &quot;Suchen Array, finden Blocks, Richten Eigenschaften&quot;, um die Spots auszurichten. Nach dem Ausrichten alle Funktionen, analysieren das Bild, indem Sie die &quot;Analyse&quot; tab. Erstellen Sie eine neue Datei mit Ergebnissen, Histogramm und Streudiagramm. Speichern Sie diese Datei aus Reiter &quot;Ergebnisse speichern unter&quot; als .gpr Datei zur weiteren Analyse. </li><li> Führen Sie weitere Normalisierung und Verarbeitung von Daten mit selbst entwickelten Microprep Software-Paket wie beschrieben 9. </li><li> Verwenden unabhängigen biologischen Replikaten für die DNA-Microarray-Daten, die farbstoff vertauscht sind. Führen CyberT Umsetzung einer Variante des t-test1 und berechnen False Discovery Raten (FDR), wie beschrieben, 9. </li><li> Auf differentiell exprimierte Gene, nehmen p &lt;0,001 und FDR &lt;0,05 als Standard. </li><li> DNA-Microarray-Daten Laden Sie am NCBI Einreichung Seite, um ein GEO (Gene Expression Omnibus) Zugangsnummer zu bekommen. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Wir beschreiben eine benutzerfreundliche Protokoll, angewendet werden können, um ganze Transkriptomanalyse von Bakterien durchzuführen. Der entscheidende Punkt dieser besonderen Technik ist, dass die Bedingungen, unter denen die Zellen geerntet variieren. Nach der Ernte der Zellen und RNA-Isolation, wird diese Technik gleich für alle Arten von Bakterienproben und folgt genau identische Schritte, und daher kann auf jede Art von Bakterienkulturen angewendet werden. Das Protokoll ist sehr einfach und bequem und beginnt von...

Die Untersuchung der Gesamtheit der mRNA-Häufigkeit (Transkriptom) von dem Genom eines einzelligen Organismus oder einer eukaryotischen Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt oder unter einer bestimmten Bedingung codiert, einschließlich Gen-Überexpression oder Knock-out wird Transkriptomik bezeichnet. Transcriptomics ermöglicht es uns, in welchem ​​Umfang Gene werden unter einer bestimmten Bedingung zu einem Zeitpunkt X ausgedrückt beobachten und gibt uns Informationen darüber, wie stark die Gene in Bezug auf einen Referenz ausgedrückt. Ein Mikroarray ist ein zweidimensionales Array auf einem festen Substrat (in der Regel ein Glasobjektträger oder Silizium-Dünnschichtzelle), die verwendet werden kann, um große Mengen an biologischem Material Assay unter Verwendung von Hochdurchsatz-Screening, und miniaturisierte, gemultiplext und parallele Verarbeitung und Detektion Methoden. Microarrays sind in verschiedenen Typen, einschließlich DNA-Microarrays, Protein-Microarrays, Peptidchips, Tissue Microarrays, Antikörper-Mikroarrays, Zellmikroarrays und andere. Ein DNA-Microarray istim Grunde eine Anordnung von mikroskopischen DNA-Spots an eine feste Oberfläche, üblicherweise Glas fixiert. DNA-Mikroarrays verwendet, um die Expression von einem Gen oder einer Reihe von Genen gleichzeitig zu messen oder mehrere Regionen eines Genoms 2,3 genotypisieren. Picomol (10 -12 mol) einer Sonde innerhalb der einzelnen DNA Stelle, die eine bestimmte DNA-Sequenz, die auch als Reporter bekannt repräsentiert vorhanden. Die markierten mRNA-Moleküle aus den Proben werden &quot;Ziele&quot; bezeichnet. Fluorophore verwendet werden, um Sonden-Target-Hybridisierung und Detektion von Fluorophor-markierte Targets zur Messung bestimmt die relative Häufigkeit von Nukleinsäuresequenzen in dem Ziel. Ein Mikroarray kann mehrere genetische Tests parallel zu erreichen, weil eine Anordnung kann Zehntausende von Sonden enthalten. Der Aufbau eines einfachen Mikroarray wird in Abbildung 1 gezeigt. Kürzlich konnte in unseren Laboren und anderen festgestellt, daß sich diese Anordnungen sind wiederverwendbar, die diese Technik sehr kostengünstig macht Wirksame. 8 - verschiedene RNA-Isolierung und Reinigungsverfahren sind im Laufe der Jahre, einschließlich C-TAB, SDS und GT Methoden 4 entwickelt. Darüber hinaus sind auch mehrere kommerzielle Kits zur Verfügung. Für Genexpression qualitativ hochwertige RNA ist sehr wichtig. Daher werden die RNA-Isolationsverfahren modifiziert, um eine maximale Menge an RNA zu erhalten. In ähnlicher Weise werden die Schritte für die cDNA Herstellung und Kennzeichnung von cDNA minimiert. Die Normalisierung der Daten nach dem Scanvorgang wird auch effizient durch die Verwendung in-Haus gebaut Softwarepakete und Tools 9 durchgeführt. Streptococcus pneumoniae ist ein Gram-positiven menschlichen Erreger der Nasenrachenraum besiedelt und ist die Ursache für mehrere Infektionen wie Lungenentzündung, Sepsis, Mittelohrentzündung und Meningitis 10. Das Bakterium kann eine Vielzahl der für das Wachstum und Überleben 11,12 erforderlichen Nährstoffe zu nutzen. Eine Reihe von Untersuchungen wurden an das mitgeführtePneumokokken-Stickstoff-Stoffwechsel und Regulation die Bedeutung der Aminosäuren und ihre Rolle in der Virulenz 13,14. In dieser Studie wurde die transkriptomischen Antwort S. pneumoniae an wechselnde Konzentrationen von L-Serin, einem Aminosäure reichlich im menschlichen Blutplasma vorhanden ist, wird berichtet, unter Verwendung von DNA-Mikroarrays. Das Transkriptom Antwort von S. pneumoniae in einer minimalen Konzentration von L-Serin (150 um) aufgewachsen wurde, daß sich eine maximale Konzentration (10 mM) von Serin gewachsen verglichen. Chemisch definierten Medium (CDM oder Minimalmedium) 15 wurde für diese Untersuchung verwendet, um die Konzentration von Serin zu steuern. Der Schwerpunkt dieser Studie ist es, diese Technik benutzerfreundlich zu machen und verschiedene Werkzeuge für die Datennormalisierung und Analysen. Daher wurden eine Reihe von Werkzeugen für die Analyse und die Interpretation der Daten entwickelt. FIVA (Functional Information Viewer und Analyzer) bietet eine Plattform für die Verarbeitung von Informationen in Gruppen von Genen enthalten habenähnliches Genexpressionsmuster und zum Konstruieren Funktionsprofile 16. STAATSANWALT ist ein weiteres Softwarepaket, das die Identifizierung der mutmaßlichen Funktionen und Annotationen der Gene 17 erleichtert. Durch die Verwendung von Clusterverfahren, offenbaren eine DNA-Bindungsstelle-Erkennungsalgorithmus. Cis: Rechts Motive der Gene kann durch Verwendung dieses Algorithmus 18 projiziert werden. Genome2D bietet eine Windows-basierte Plattform für die Visualisierung und Analyse von Transkriptom-Daten, indem sie verschiedene Farbpaletten, um die Veränderungen in der Genexpression Ebenen auf einem Genomkarte 19 zu charakterisieren. Der Pfeffer Webserver bietet, zusätzlich zu den all-in-one-Analyseverfahren, einem Werkzeugkasten für den Bergbau für Regulons, Promotoren und Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen 20. Voll Annotation von intergenischen Regionen in einem bakteriellen Genom kann mit diesem Paket erzielt werden. Biologen können stark von Pfeffer profitieren, da sie bietet ihnen eine Plattform für die Entwicklung Experiments, so dass der hypothetische Informationen können in vitro 20 bestätigt werden. Diese Softwarepakete tragen wesentlich zur Microarray-Analyse, wie die meisten von ihnen sind frei verfügbar und machen die Datennormalisierung und Analyse sehr zuverlässig.

<table><tbody><tr><td>Saures Phenol</td><td>SigmaAldrich</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>Roche RNA-Isolationskit</td><td>Roche Applied Science</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Glasperlen</td><td></td><td>105015</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Boom</td><td>92013505.1000.</td><td></td></tr><tr><td>IAA</td><td></td><td>106630</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Nanodrop</td><td>ND-100</td><td></td></tr><tr><td>Agilent BioAnalyser</td><td>Agilent</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III</td><td>Life-Technologien Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>AA-dUTP</td><td>Life-Technologien Invitrogen</td><td>AM8439</td><td></td></tr><tr><td>DDT</td><td>Life-Technologien Invitrogen</td><td></td><td></td>18080044</tr><tr><td>Puffer für den ersten Strang</td><td>Life-Technologien Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SigmaAldrich</td><td>S8045-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SigmaAldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>DyLight-550</td><td>Thermoscientiffic</td><td>62262</td><td></td></tr><tr><td>DyLight-650</td><td>Thermoscientiffic</td><td>62265</td><td></td></tr><tr><td>SHY Puffer</td><td>SigmaAldrich</td><td>H7033-125ML</td><td></td></tr><tr><td>Speedvac Kühler</td><td>Eppendorf</td><td>RUGNE3140</td><td>Speedvac Konzentrator plus</td></tr><tr><td>Hybridisierungsofen</td><td>Grant Boekel</td><td>Iso-20</td><td></td></tr><tr><td>Lifter-Slips</td><td>Erie Scientific</td><td>25x60I-M-5439</td><td></td></tr><tr><td>Wipe</td><td>KIMTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>SigmaAldrich</td><td>L3771-100g</td><td></td></tr><tr><td>SSC</td><td>SigmaAldrich</td><td>W302600-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>Genpix Autoloader 4200A1</td><td>MSD Analysetechnologien</td><td></td><td>Microarray Scanner</td></tr><tr><td>Natriumbikarbonat</td><td>SigmaAldrich</td><td>104766</td><td></td></tr></tbody></table>

eine schnelle und zuverlässige pipeline für bakterielle transkriptomanalyse fallstudie: serin-abhängige genregulation in<em&gt; streptococcus pneumoniae</em

A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

Genexpression und ihre Regulation sind sehr wichtig, um das Verhalten von Zellen unter verschiedenen Bedingungen zu verstehen. Verschiedene Techniken werden heute verwendet werden, um Genexpression zu untersuchen, aber die meisten sind in Bezug auf die Bereitstellung einen allgemeinen Überblick über die Expression des gesamten Transkriptoms begrenzt. DNA-Microarrays bieten eine schnelle und Wirtschaftsforschung-Technologie, die einen vollständigen Überblick über globale Genexpression gibt und haben eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Identifizierung neuer Gene und Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen, Charakterisierung der Transkriptionsaktivität der Zellen und auch dazu beitragen, bei der Analyse von tausenden von Genen (in einem einzigen Experiment). In der vorliegenden Studie, die Bedingungen für bakterielle Transkriptomanalyse von Zellernte auf DNA-Microarray-Analyse optimiert. Unter Berücksichtigung der Zeit, Kosten und Genauigkeit der Experimente, erweist sich diese Technologie-Plattform als sehr nützlich und universell applicabale zur Untersuchung bakterieller transcriptomes. Hier führen wir DNA-Microarray-Analyse mit Streptococcus pneumoniae als Fallstudie durch Vergleich der Transkriptionsreaktionen S. pneumoniae in Gegenwart von variierenden Konzentrationen von L-Serin in dem Medium gezüchtet. Gesamt-RNA wurde unter Verwendung eines Macaloid Verfahren unter Verwendung eines RNA-Extraktions-Kit und die Qualität der RNA isoliert wurde unter Verwendung eines RNA-Qualitätskontrollsatz geprüft. cDNA wurde unter Verwendung von reverser Transkriptase hergestellt, und die cDNA-Proben wurden unter Verwendung eines von zwei Amin-reaktive Farbstoff trägt. Selbst gemachte DNA Microarray-Slides wurden für die Hybridisierung der markierten cDNA-Proben und Mikroarray-Daten verwendet wurden unter Verwendung eines cDNA-Mikro Datenvorverarbeitung Rahmen (Microprep) analysiert. Schließlich Cyber-T verwendet wurde, um die erzeugten Verwendung Microprep zur Identifizierung statistisch signifikant unterschiedlich exprimierten Genen Daten zu analysieren. Außerdem im Haus eingebaute Software-Pakete (Pfeffer, FIVA, offenbaren, Staatsanwalt, Genome2D) wurden verwendet, um zu analysierenDaten.

RNA, cDNA-Isolationen und Analyse L-Serin ist eine der essentiellen Aminosäuren, und seine Konzentration im menschlichen Blutplasma variiert von 60 bis 150 &amp; mgr; M bei Kindern und Erwachsenen. Seine Rolle bei der Biosynthese von Purinen und Pyrimidinen hebt seine Bedeutung im Stoffwechsel und es ist ein Vorläufer von verschiedenen Aminosäuren (Glycin, Cystein und Tryptophan). Um die Wirkung von L-Serin auf die gesamte Transkriptom S. studieren pneumoniae</e...

Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung modernster Technologie durch DNA-Microarrays. Microarrays geben einen Überblick über die transkriptomischen Veränderungen in Bakterien, die unter einer bestimmten Bedingung auftreten. Darüber hinaus heben wir hervor, wie einfach es ist, große Datenmengen mit Hilfe von komfortablen, eigens entwickelten Softwarepaketen zu analysieren.

Eine schnelle und zuverlässige Pipeline für bakterielle Transkriptomanalyse Fallstudie: Serin-abhängige Genregulation in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

Gene expression and its regulation are very important to understand the behavior of cells under different conditions. Various techniques are used nowadays ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen Überblick über die transkriptomischen Veränderungen bei Bakterien unter einer bestimmten Bedingung zu geben. Dies wird erreicht, indem zunächst bakterielle Zellen unter einer spezifischen Bedingung kultiviert und geerntet werden. Anschließend wird die gesamte RNA aus den geernteten Zellen isoliert und cDNA aus der RNA hergestellt.Dann werden die cDNAs markiert und auf hausinternen Mikroarray-Slides hybridisiert. Abschließend wird der Slide gewaschen, anschließend werden die Slides gescannt und analysiert. Letztendlich dient der Microarray dazu, die transkriptomischen Veränderungen in bakteriellen Zellen unter der spezifischen Bedingung darzustellen.Der Hauptvorteil der DNA-Microarray-Technologie gegenüber anderen bestehenden Methoden zur Untersuchung der Genexpression wie QPCR oder Northern Blotting besteht darin, dass sie einen globalen Überblick über alle transkriptomischen Veränderungen unter einer bestimmten Bedingung bietet. Sie ist schnell, zuverlässig und vergleichsweise kostengünstig. Die Durchführung der Prozedur übernehmen Mohammed Sal und Airon Manzu, PSD-Studenten aus meinem Labor für molekulare Genetik. Nach dem Auftauen von s pmo, ED 39 Zellpellets und deren Resuspension in 400 Mikrolitern TE gemäß dem Textprotokoll bereiten Sie Folgendes in RNA-freien Schraubkappenröhrchen vor: 0,5 Gramm Glaskügelchen, 50 Mikroliter 10 %iger SDS, 500 Mikroliter zuvor hergestelltes Phenol-Chloroform und die resuspendierten Zellpellets.Um die Zellen zu lysieren, setzen Sie die Röhrchen in einen Bead-Beater und homogenisieren zweimal je 60 Sekunden lang, wobei Sie zwischen den Impulsen eine Minute auf Eis legen. Zentrifugieren Sie die Proben anschließend bei 10.000 G und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Überführen Sie die obere Phase in ein neues Röhrchen und geben Sie 500 Mikroliter Chloroform zu. Zentrifugieren Sie erneut für fünf Minuten. Pipettieren Sie 500 Mikroliter der oberen Phase in frische Röhrchen.Geben Sie zwei Volumina Lysierpuffer hinzu und mischen Sie durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Isolieren Sie anschließend mithilfe eines RNA-Isolationskits die Gesamt-RNA gemäß der Herstelleranleitung, um kontaminierende DNA aus der RNA zu entfernen. Fügen Sie 100 Mikroliter D's-eins-Mix hinzu und inkubieren Sie bei 15 bis 25 Grad Celsius für 20 bis 30 Minuten.Verwenden Sie das RN a's-Kit, um die gereinigte RNA zu waschen, und eluieren Sie in einem Volumen von 50 Mikrolitern, um die an kneeling-Reaktion in 300-Mikroliter-PCR-Röhrchen durchzuführen. Mischen Sie die gesamte RNA mit zwei Mikrolitern zufälliger Monomere und verwenden Sie gegebenenfalls nukleasefreies Wasser, um das Volumen auf 18 Mikroliter aufzufüllen. Inkubieren Sie das an kneeling-Gemisch bei 70 Grad Celsius für fünf Minuten.Kühlen Sie die Reaktionen anschließend 10 Minuten bei Raumtemperatur ab und zentrifugieren Sie sie kurz, bevor Sie die Röhrchen mindestens eine Minute lang auf Eis stellen. Um cDNA umzuschreiben, bereiten Sie die Reverse-Transkriptionsmischung vor, geben 18 Mikroliter der Mischung zu 12 Mikrolitern der Mastermischung hinzu und inkubieren die Reaktion zwei bis 16 Stunden bei 42 Grad Celsius. Degradieren Sie die mRNA aus der Reaktion, indem Sie drei Mikroliter einer 2,5-molaren NaOH-Lösung hinzufügen, und stellen Sie sie etwa 15 Minuten bei 37 Grad Celsius ein.Dann 15 Mikroliter zweimolares hepesfreie Säure hinzufügen, um das NaOH zu neutralisieren. Danach die cDNA mit PCR-Reinigungssäulen reinigen und mit einem Spektrophotometer die cDNA-Konzentration bestimmen, um die cDNA zu markieren. Fügen Sie fünf Mikroliter eines amino-reaktiven Farbstoffs zu 20 bis 60 Nanogramm pro Mikroliter cDNA hinzu.Stellen Sie die Mischung im Dunkeln bei Raumtemperatur 60 bis 90 Minuten lang inkubieren, bevor Sie PR-Reinigungssäulen verwenden, um die mit Farbstoff markierte cDNA aufzubereiten, die in 50 Mikroliter Elutionspuffer eluiert wird. Mit einem Spektrophotometer sicherstellen, dass die Konzentration der markierten cDNA mindestens 0,5 Pikomol pro Mikroliter in einem Gesamtvolumen von 50 Mikroliter beträgt. Nach der Zubereitung des Hybridisierungspuffers gemäß dem Textprotokoll den Puffer mindestens 30 Minuten lang auf 68 Grad Celsius vorheizen. Zum Probenvorbereiten gleiche Mengen der markierten cDNAs kombinieren und anschließend Vakuumkonzentratoren bei hoher Temperatur verwenden, um das Volumen auf sieben Mikroliter oder weniger zu reduzieren.Unterdessen, um die Lifter-Slips zu reinigen und das Hintergrundsignal zu verringern, verwenden Sie Seife und viel Leitungswasser, gefolgt von 100 % Ethanol, nachdem Sie die Lifter-Slips abgetrocknet haben. Platzieren Sie einen Slip mit der weißen Teflon-Beschichtung nach unten auf einem Objektträger. Lösen Sie anschließend die getrockneten Farbstoffproben in sieben Mikrolitern H2O auf und inkubieren Sie zwei Minuten bei 94 Grad Celsius. Geben Sie danach sofort 35 Mikroliter vorgewärmten shy-Puffer hinzu, mischen Sie vorsichtig und zentrifugieren Sie eine Minute bei maximaler Geschwindigkeit.Um die Niederschläge zu pelletieren, den Probengefäß vorheizen, indem es etwa fünf Minuten lang auf 68 Grad Celsius erwärmt wird, bevor es beladen wird. Um den Objektträger und den Heberzettel zusammenzubauen, den Hybridisierungs-Objektträgerhalter auf einen Heizblock bei 50 Grad Celsius stellen. Die DNA-Microarray-Objektträger mit dem Heberzettel auf den beheizten Hybridisierungs-Objektträgerhalter legen und den Objektträger mit dem Heberzettel eine Minute lang vorheizen.Danach so schnell wie möglich 40 Mikroliter des Probenziels an das Ende des Objektträgers geben. Das Fluid durch Kapillarkraft zwischen den Glasoberflächen fließen lassen. Nun die vorgewärmte Hybridisierungskassette aus dem Hybridisierungsbrutschrank nehmen und das Gerät schließen.Danach Filterpapier, das mit drei Milliliter 2x SSC getränkt ist, in die Hybridisierungskassette legen. Den Hybridisierungsschieber mit den Objektträgern vorsichtig in die Hybridisierungskassette geben. Die Hybridisierungskassette schließen und zurück in den Hybridisierungsofen stellen, anschließend 16 bis 18 Stunden inkubieren.Zur Wäsche der Objektträger bereiten Sie frische Waschpuffer eins, zwei und drei vor und bringen Sie auf 30 Grad Celsius. Um sicherzustellen, dass das SDS sich auflöst, sobald die Inkubation abgeschlossen ist, tauchen Sie die Objektträger so schnell wie möglich vorsichtig in ein Falcon-Röhrchen, das mit 50 Milliliter Waschpuffer eins gefüllt ist, bis das Glas den Boden des Röhrchens erreicht. Sobald der Heber abrutscht und ohne das Array zu beschädigen auf den Boden des Röhrchens sinkt, entfernen Sie den Objektträger mit einer Pinzette und legen ihn in das Gestell der Waschstation.Verwenden Sie unmittelbar 500 Milliliter Waschpuffer eins, um die Objektträger fünf Minuten lang zu waschen. Anschließend überführen Sie die Objektträger in Waschpuffer zwei für 20 bis 30 Minuten, bevor Sie sie in 500 Milliliter Waschpuffer drei für fünf Minuten überführen. Trocknen Sie die Objektträger abschließend bei 2000 U/min für zwei Minuten, bevor Sie die Mikroarray-Analyse durchführen.Entsprechend dem Textprotokoll zur Untersuchung der Wirkung von L-Serin auf das gesamte Transkriptom von S. pneumoniae wurde eine Microarray-Analyse des D39-Wildtyp-Stamms durchgeführt, der in CDM mit 150 Mikromolar L-Serin im Vergleich zu 10 Millimolar L-Serin im gleichen Medium kultiviert wurde. Diese Tabelle listet die Konzentrationen der aus jeder Kultur isolierten Gesamt-RNA auf, wie in dieser Abbildung dargestellt. Nach Entfernung der DNA wurde die Qualität der RNA überprüft.Diese beiden Bahnen repräsentieren RNA aus 150 Mikromolar Seine und diese beiden Bahnen stammen aus Kulturen, die mit 10 Millimolar Seine gezüchtet wurden. Das Vorhandensein von zwei deutlichen Banden weist auf hochwertige RNA hin. Die Konzentrationen von cDNA, die aus Gesamt-RNA synthetisiert wurde, sind in dieser Spalte verzeichnet, und die der AM-Mean-Reaktionsfarbstoff-markierten Proben sind hier aufgelistet.Eine Streudiagrammanalyse des mittleren reaktiven Verhältnisses der AM-Farbstoffe ist in dieser Abbildung dargestellt, und die Daten wurden weiter analysiert, um Rauschen zu reduzieren. Diese Tabelle fasst die Ergebnisse der Microarray-Studien zusammen, nachdem die Kriterien einer mehr als oder gleich zweifachen Differenz und eines P-Werts von weniger als 0,001 angewendet wurden. Wie hier zu sehen ist, wurden eine Reihe von Genen unterschiedlich exprimiert, wenn minimales L-Serin im Vergleich zum maximalen vorhanden war, nachdem dieses Verfahren angewendet wurde.Andere Methoden wie beag, Elektrozyten-Assays, QPCR, Knockout- und Expressionsstärkenanalysen können verwendet werden, um die nachfolgenden Fragen nach der Entwicklung zu beantworten. Diese Technik ermöglichte es den VFR-Forschern im Bereich der Molekular- und Zellbiologie, die regulatorischen Netzwerke und Mechanismen in RAM-positiven Systemen zu untersuchen.

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Research

Forschung

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Biology

Biologie

Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Verfahren, um einzelne Zelle Verhalten verschiedener Bakterien in der Zeit mit Hilfe automatisierter Fluoreszenz-Zeitraffer-Mikroskopie zu überwachen. Darüber hinaus bieten wir Richtlinien, wie die Mikroskopie-Aufnahmen zu analysieren.

Live Cell Imaging von Bacillus subtilis Und Streptococcus pneumoniae Verwendung von Automated Zeitraffer-Mikroskopie

Dieses Video zeigt die differentielle radiale Kapillarwirkung des Ligandenassays — eine Technik zum systematischen Hochdurchsatz-Screening von intrazellulären Nukleotid-Second-Messenger-bindenden Proteinen. Diese Technik ermöglicht eine direkte Bindung der Botenstoffe an das überexprimierte Zielprotein im Zelllysat – unter Umgehung der Notwendigkeit einer Proteinreinigung.

Differentielle radiale Kapillarwirkung des Liganden-Assays: Eine Hochdurchsatztechnik zur Identifizierung von bakteriellen Nukleotid-Second-Messenger-bindenden intrazellulären Proteinen

Dieses Video zeigt einen in vivo Assay in Bakterien, um die Interaktion von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) mit RNA zu untersuchen. Die Bakterienzellen werden mit zwei Plasmidkonstrukten transformiert – einem Plasmid an der Bindungsstelle, das für eine mRNA kodiert, die ein fluoreszierendes Reportergen stromabwärts einer RBP-Bindungsstelle enthält –, während ein RBP-Plasmid die RBP-Proteine unter der Kontrolle eines Induktors exprimiert. Bei einer durch Induktoren vermittelten Erhöhung der...

Reportergen-Repressionsassay zur Untersuchung der translationalen Regulation eines Zielgens

Hier präsentieren wir phänomische Ansätze zur funktionellen Charakterisierung von mutmaßlichen Phagengenen. Zu den Techniken gehören ein entwickelter Assay, der in der Lage ist, den anabolen Metabolismus des Wirts zu überwachen, die Multi-Phenotype Assay Plates (MAPs), zusätzlich zu der etablierten Methode der Metabolomik, die in der Lage ist, Auswirkungen auf den katabolen Metabolismus zu messen.

Phage Phenomics: Physiologische Ansätze zur Charakterisierung Novel virale Proteine

Hier beschrieben ist eine Methode zur Analyse von bakteriellen Genexpression in tierischem Gewebe auf zellulärer Ebene. Diese Methode bietet eine Ressource für das Studium der phänotypische Vielfalt innerhalb einer Bakterienpopulation in Reaktion auf die Umwelt Gewebe während einer Infektion auftreten.

Eine Fluoreszenz basierende Methode, bakterielle Genregulation in infizierten Gewebe zu studieren

Chromatin-Immunpräzipitation in Verbindung mit der Sequenzierung der nächsten Generation (ChIP-seq) ist eine Methode, die verwendet wird, um Wechselwirkungen zwischen Transkriptionsfaktoren und den von ihnen kontrollierten genomischen Sequenzen herzustellen. Dieses Protokoll skizziert Techniken zur Durchführung von ChIP-seq mit bakteriellen Biofilmen, wobei Salmonella enterica serovar Typhimurium bakterieller Biofilm als Beispiel verwendet wird.

Entdeckung von CsgD-Regulierungszielen im Salmonellen-Biofilm mit Chromatin-Immunpräzipitation und Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

Wir beschreiben eine Methode zur Generierung von sättigungsverstärkenden Mutationsbibliotheken in gramnegativen Bakterien und der anschließenden Herstellung von DNA-Amplikonbibliotheken für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz. Als Beispiel konzentrieren wir uns auf den ESKAPE-Erreger Acinetobacter baumannii, aber dieses Protokoll ist für eine Vielzahl von Gram-negativen Organismen zugänglich.

Generieren von Transposon-Einfügungsbibliotheken in gramnegativen Bakterien für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz

Die MAPS-Technologie wurde entwickelt, um das Targetom einer bestimmten regulatorischen RNA in vivo zu untersuchen. Die sRNA von Interesse ist mit einem MS2-Aptamer gekennzeichnet, das die Co-Reinigung ihrer RNA-Partner und deren Identifizierung durch RNA-Sequenzierung ermöglicht. Dieses modifizierte Protokoll eignet sich besonders für grampositive Bakterien.

MS2-Affinitätsreinigung gekoppelt mit RNA-Sequenzierung in grampositiven Bakterien

Hier beschreiben wir die Phasen der Probenentnahme und Vorbereitung für RIBO-seq in Bakterien. Die Sequenzierung der nach diesen Richtlinien erstellten Bibliotheken liefert ausreichende Daten für eine umfassende bioinformatische Analyse. Das Protokoll, das wir präsentieren, ist einfach, verwendet Standard-Laborgeräte und dauert sieben Tage von der Lyse bis zur Beschaffung von Bibliotheken.

RIBO-seq in Bakterien: ein Probensammlungs- und Bibliotheksvorbereitungsprotokoll für die NGS-Sequenzierung

Dieses Protokoll beschreibt eine verbesserte Methode zur Synthese hoher Ausbeuten rekombinanter Proteine aus einem zellfreien Transkriptionstranslationssystem (TX-TL) von Streptomyces venezuelae .

Ein ertragreiches Streptomyces-Transkriptions-Translation-Toolkit für synthetische Biologie und Naturstoffanwendungen

Erfahren Sie die bakterielle Transkriptomanalyse mit DNA-Microarrays und maßgeschneiderter Software. Diese Methode ermöglicht globale Genexpressionsstudien in Streptococcus pneumoniae unter spezifischen Bedingungen.

Eine schnelle und zuverlässige Pipeline für bakterielle Transkriptomanalyse Fallstudie: Serin-abhängige Genregulation in Streptococcus pneumoniae (Video) | JoVE Journal

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