Generierung von lymphatische Mikropartikel und Nachweis ihrer pro-apoptotische Wirkung auf die Epithelzellen der Atemwege

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die in vitro Produktion von lymphozytären Mikropartikeln oder LMPs aus einer T-Lymphozyten-Zelllinie zu veranschaulichen und ihre pro-apoptotische Wirkung auf Epithelzellen der Atemwege zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die LMPs hergestellt werden. Anschließend werden die isolierten LMPs durch Faxanalyse charakterisiert.

Dann werden die Explantate des Bronchialgewebes kultiviert. Schließlich wird eine LMP-Behandlung an Bronchialexplantaten durchgeführt. Letztendlich werden histopathologische Untersuchungen wie Hämat-, Toin- und Eosin- und NC-Zwei-Zelltod-Detektion verwendet, um eine LMP-induzierte Schädigung der bronchialen Epithelschicht und eine Apoptose der Epithelzellen nachzuweisen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Isolierung von Mikropartikeln aus menschlichem peripherem Blut besteht darin, dass wir in der Lage sind, in vitro Mikropartikel aus einer Zelllinie in großem Maßstab zu erzeugen. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da kritische Schritte der Bronchia-Explan-Kultur nicht einfach vorzubereiten sind. Um mit der Kultur zu beginnen.

CEMT-Zellen werden in vier T 1 75-Kolben mit je 150 Millilitern Frisch- und Mediumkolben gebildet und bei 37 Grad Celsius zu einer Dichte von 2 Millionen Zellen pro Milliliter inkubiert. Die Zellen aus jedem Kolben werden durch Zentrifugation bei 200 mal G für fünf Minuten gesammelt und dann 300 mal 10 bis zu den sechs Zellen in einen neuen T 1 75-Kolben mit 150 Millilitern frischem Medium gebogen. Um die Dichte von 2 Millionen Zellen pro Milliliter aufrechtzuerhalten, geben Sie 37,5 Mikroliter Aktin Mycin D in das Medium in einer Endkonzentration von 0,5 Mikrogramm pro Milliliter und inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Das gesamte Kulturmedium wird in konische 50-Milliliter-Röhrchen überführt und die Zellen fünf Minuten lang bei 750-fachem G heruntergeschleudert. Dann den Überstand in konische 50-Milliliter-Röhrchen überführen und 15 Minuten lang bei 1500 mal G zentrifugieren, um große Zellfragmente zu entfernen. Als nächstes wird der Überstand in eine 250-Milliliter-Flasche umgefüllt und 50 Minuten lang bei 12.000 G ultrazentrifugiert.

Entsorgen Sie dann den Überstand und sammeln Sie die Pellets. Verwenden Sie 40 Milliliter steriles PBS, um die mit LMP angereicherten Pellets in einem 50-Milliliter-Röhrchen zu waschen, und zentrifugieren Sie sie 50 Minuten lang bei 12.000 mal G. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.

Sammeln Sie den Überstand aus der letzten Wäsche, um ihn mit einem Milliliter PBS als Fahrzeugkontrolle zu verwenden. Die Pellets werden suspendiert und in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen aliquotiert und isolierte LMPs bei minus 80 Grad Celsius gelagert. Um Mikropartikel durch Faxanalyse zu charakterisieren, bereiten Sie zunächst zwei Proben eines Nexin-Puffers vor, eine mit Calciumchlorid und eine ohne Calcium.

Verdünnen Sie in einem Faxrohr einen Mikroliter LMPs in 44 Mikrolitern eines Nexinpuffers mit Calciumchlorid. Bereiten Sie ein weiteres Röhrchen mit einem Nexinpuffer ohne Calciumchlorid vor. Als nächstes fügen Sie fünf Mikroliter eines X und V sci fünf in jedes Röhrchen hinzu und mischen Sie gut, inkubieren Sie es 15 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur.

Verwenden Sie nach der Inkubation 400 Mikroliter Fax-Grippescheidenflüssigkeit. Um die Reaktionen zu stoppen, fügen Sie 10 Mikroliter Suspension mit sieben Mikron Zählperlen als internen Standard in jedes Röhrchen hinzu. Um eine absolute Zählung zu erhalten, werden Gates für relative Größe, FSCH und relative Granularität SSCH und Punktdiagramm auf dem Durchflusszytometer festgelegt.

Verwendung von größenkalibrierten fluoreszierenden Kügelchen von einem Mikrometer für das erste Gate und Zählbeads von sieben Mikrometern. Für Gate zwei wird die LMP-Probe in einem F-S-C-H-S-S-C-H-Plot unter Verwendung der etablierten Gates und des FL-Vierkanals für das Annexin-Dot-Plot analysiert, indem ein Signal erfasst wird, bis 10.000 Zählkügelchen im zweiten Gang erreicht sind, die positiven in ex NV-Ereignisse von LMPs in Nexinpuffer mit Calciumchlorid bestimmt und die Ereignisse von LMPs in Nexinpuffer ohne Calciumchlorid subtrahiert. Berechnen Sie die absolute Anzahl der AMPs basierend auf der folgenden Gleichung.

Verwendet die superfeine Pinzette Scalpel Dumont und eine chirurgische Schere, um Lungengewebe aseptisch zu präparieren. Entfernen Sie vorsichtig das Parenchym und die Blutgefäße. Präparieren Sie den Bronchus weiter in das Gewebewaschmedium und trennen Sie den Bronchus mit einem Durchmesser von einem bis 2,5 Millimeter vom peripheren Lungengewebe

Schneiden Sie das Bronchialgewebe mit einem Skalpell in etwa fünf Millimeter dicke Bronchialreihen, indem Sie mit der steril gebogenen Mikro-Präparierzange eine Löffelbewegung ausführen. Heben Sie die Bronchialfragmente auf und legen Sie sie auf die zerkratzten Stellen der zuvor zubereiteten Gerichte. Entfernen Sie gemäß dem Textprotokoll das Waschmedium und inkubieren Sie die Fragmente etwa fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, damit sie am Geschirr haften können.

Geben Sie 10 Milliliter vollständiges Heilmedium in jede Schale und stellen Sie sie in eine modulare Inkubatorkammer mit kontrollierter Atmosphäre mit einem sauerstoffreichen Gasgemisch, spülen Sie die Kammer, stellen Sie sie dann in einen Tischorbital-Inkubator und schütteln Sie sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 10 Zyklen pro Minute, damit das Medium intermittierend über die Fragmente fließen kann. Beobachten Sie nach der Inkubation die Gewebeexkonstruktion unter einem Phasenkontrast- und Inverslichtmikroskop. Select bronchial explan mit vollständiger feiner Haarbewegung und lebhaftem Bronchialepithel für die anschließende LMP-Behandlung.

Zur Behandlung von LMPs zählen Sie den gerade ausgewählten Bronchial-Explan und markieren Sie jede Vertiefung einer 12-Well-Gewebekulturplatte. Für jeden Explan werden 0,5 Milliliter des vollständigen Wachstumsmediums in ein steriles Einor-Röhrchen überführt. Fügen Sie dann 25 Mikroliter L- und P-Vorrat pro Behandlungsplan hinzu oder fügen Sie 25 Mikroliter Kontrollvehikel hinzu.

Für die Kontrolle der Explantate gut mischen, indem Sie vorsichtig auf die Tube klopfen. Übertragen Sie das Mischmedium mit einer gebogenen Mikro-Präparierzange in jede Vertiefung einer markierten 12-Well-Gewebekulturplatte. Übertragen Sie jedes ausgewählte bronchiale x explan in jede Vertiefung der Gewebekulturplatte.

Setzen Sie die Inkubation in einer modularen Inkubatorkammer mit kontrollierter Atmosphäre bei 37 Grad Celsius unter leichtem Schütteln nach 24 Stunden fort. Verwenden Sie PBS, um den EXPLAN dreimal zu waschen, und fahren Sie mit der Fixierung h und e, der Färbung und dem Tunnelassay fort. Gemäß dem hier gezeigten Textprotokoll wurden LMPs mittels Faxanalyse mit einer Nexin-V-Färbung charakterisiert und mit Ein-Mikrometer-Kügelchen gatediert, wobei 97% der mps in Nexin V Sci-Fi-positiv waren.

In der Regel wurden nach diesem Protokoll etwa 2,5 Milligramm LMPs erhalten. Bronchialgewebe explan von C 57 schwarzen sechs Mäusen wurde einer Vehikel- und LMP-Behandlung unterzogen. In dieser Abbildung zeigt die histopathologische Analyse von Bronchialschnitten die Wirkung von LMPs auf die strukturelle Integrität des Bronchialepithels.

Unter Kontrolle. Explan war das Bronchialepithel weitgehend unbeschädigt. Bei LMP-behandelten Explantaten wurde jedoch die oberflächliche Epithelzellschicht beschädigt oder ging verloren, und es kam zu einer signifikanten Abnahme der Epithelzellhöhe und -dichte, wie hier zu sehen ist.

Die tunnelpositive Färbung eines Markers für Apoptose war bei LMP-behandeltem Bronchialepithel im Vergleich zu Kontrollgewebe ausgeprägter. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, bei der Herstellung von Mikropartikeln und der Durchführung von Gewebeexplankulturen unter sterilen Bedingungen zu arbeiten.