Name: Generierung von lymphatische Mikropartikel und Nachweis ihrer pro-apoptotische Wirkung auf die Epithelzellen der Atemwege (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Lernen Sie die in-vitro-Produktion lymphatischer Mikropartikel aus T-Lymphozyten-Zelllinien und deren pro-apoptotische Wirkung auf Atemwegsepithelzellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellulärer Interaktionen in der Immunforschung.

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Vision-Health Research Network - Diese Arbeit wird durch Zuschüsse aus dem kanadischen Institutes of Health Research (178.918), Fonds de recherche en santé du Québec unterstützt.

HINWEIS: Männliche C57BL / 6-Mäuse (5-7 Wochen alt) werden von Charles River Laboratories International, Inc. (St-Constant, Quebec, Kanada.) Und nach Protokollen von der CHU Sainte-Justine Animal Care Committee genehmigt manipuliert. Maus Bronchialgewebe Explantate eine gute Quelle von Primär bronchialen Epithelzellen zur Untersuchung der proapoptotischen Wirkung von LMPs auf Epithelzellen. Dieses Protokoll beschreibt die synthetische Entwicklung LMPs sowie ein Verfahren zum Nachweis apoptotischer Epithelzellen auf LMPs behandelten bronchiale Gewebeexplantaten. Dieses Protokoll besteht aus drei Abschnitten. 1. LMPs Herstellung und Charakterisierung HINWEIS: Um eine Kontamination zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass alle in diesem Experiment verwendeten Materialien sind steril und autoklaviert. Alle Schritte bei Raumtemperatur in einem biologischen Sicherheitsschrank unter sterilen Bedingungen, sofern nicht anders angegeben. 1.1) Stimulation und Sammlung von Abgeordneten9 <ol><li> Auftauen ein Aliquot von 10 Millionen CEM-T-Zellen in einem 37 ° C Wasserbad. Verdünne in 10 ml vorgewärmten serumfreien hämatopoetischen Medium wie X-VIVO, in einem 15 ml sterilen Röhrchen und zentrifugiert bei 200 g × 5 min. Saugen Sie den Überstand und resuspendieren Zellen in 5 ml vorgewärmten Medium. </li><li> Übertragungszellen in einen T75-Gewebekulturkolben (für Suspensionskulturen) mit 15 ml vorgewärmten hämatopoetischen Medium wie X-VIVO und Inkubation für 4 Tage in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC mit 5% CO 2. </li><li> Nach 4 Tagen übertragen alle Kulturmedium und Zellen in einen T175 Gewebekulturflasche mit 100 ml frischem Medium. Weiter Inkubieren der Zellen für ungefähr 72 Stunden unter den gleichen Bedingungen, bis sie zu einer Dichte von 2 Mio Zellen / ml gezüchtet. </li><li> Gleichmäßig auf vier T175-Flaschen, die jeweils 150 ml frischem Medium und weiterhin Zellkultur, bis Zellen (etwa 48 h Inkubation) zu einer Dichte von 2 Millionen / ml gezüchtet Teilen von Zellen. </li><li&gt; Sammeln Zellen aus jedem Kolben durch Zentrifugation bei 200 xg für 5 Minuten und Resuspendieren 300 x 10 6 Zellen in ein neues T175-Kolben, der 150 ml frisches Medium, um den 2 Millionen / ml Zelldichte aufrechtzuerhalten. </li><li> Hinzufügen Actinomycin D (gelöst in DMSO bei 2 mg / ml) zu dem Medium in einer Endkonzentration von 0,5 ug / ml und Inkubation für 24 Std. </li><li> Lassen Sie das gesamte Kulturmedium in 50 ml konischen Röhrchen und Spin-down werden die Zellen bei 750 g für 5 min. Den Überstand in 50 ml konische Röhrchen und zentrifugieren bei 1.500 g für 15 Minuten, um große Zellbruchstücke zu entfernen. </li><li> Den Überstand in einen 250 ml-Flasche und Ultrazentrifuge bei 12.000 × g für 50 min. Überstand verwerfen und sammeln Pellets. </li><li> Wasch LMPs angereicherten Pellets mit 40 ml sterilem PBS in ein 50 ml Röhrchen durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 50 min. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. </li><li> Sammeln Sie die letzten Waschüberstand; wird sie als Fahrzeugsteuerung verwendet werden. Suspend die LMPs Pellets in 1ml PBS und Übertragung in einem 1,5 ml sterilen Mikroröhrchen. Aliquotieren und Speicher isoliert LMPs bei -80 ° C (um mehrere freie und Auftauen zu vermeiden). </li></ol> 1.2) Charakterisierung der Abgeordneten über FACS-Analyse 4 <ol><li> Planen 2 Proben von Annexin Puffer, 1 mit und andere ohne CaCl 2: Hepes 10 mM, NaCl 140 mM, plus oder minus 5 mM CaCl 2. </li><li> Filtern Annexin Puffer und FACS Strömungs Hüllfluid mit einem 0,22 um Filter, um Partikel zu entfernen. </li><li> Verdünnen Sie 1 ul LMPs in 44 ul von Annexin-Puffer mit 5 mM CaCl 2 in einer FACS-Röhrchen. Bereiten anderes Rohr mit 1 ul LMPs in 44 ul Annexin Puffer ohne CaCl 2 (Negativkontrolle). </li><li> In 5 ul der Annexin-Cy5 in jeder Röhre und gut mischen. Inkubieren für 15 min bei RT im Dunkeln. Die Reaktion durch Verdünnen der Mischung mit 400 ul FACS Fluss Mantelfluid in jedem Röhrchen. </li><li> In 10 ul (200.000 Kügelchen) von 7 um das Zählen beads Suspension als interner Standard in jedem Röhrchen, um eine absolute Anzahl ermitteln. </li><li> Stellen Toren der relativen Größe (FSC-H, PMT E00, logarithmischer Maßstab) und die relative Granularität (SSC-H, PMT 325, logarithmischer Maßstab) Dot-Plot auf dem Durchflusszytometer mit Größe kalibriert fluoreszierende Kügelchen von 1 um (Tor 1) und Zählen Perlen Tor bei 7 um (Tor 2). </li><li> Analysieren Sie den LMPs Probe auf FSC-H / SSC-H Grundstück mit den etablierten Toren und FL-4-Kanal für Annexin (PMT 765, logarithmischer Maßstab) Dot-Plot, durch Erfassen eines Signals, bis 20.000 Zählen Perlen sind in Tor 2 erreicht. </li><li> Ermitteln Sie die positive Annexin Ereignisse LMPs in Annexin-Puffer, der CaCl 2, und dann die Ereignisse des LMPs in Annexin Puffer subtrahieren ohne CaCl 2 (Negativkontrolle). </li><li> Berechnung der absoluten Anzahl der MPs basierend auf der folgenden Gleichung: <img alt="Gleichung 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52651/52651eq1.jpg" /></li></ol> 1.3) Bestimmung des MP Protein Konzentration (Bradford-Assay) <ol><li> Bereiten 5 Reihenverdünnungen eines Proteinstandard 1,25-20 ug / ml. Pipette 800 ul jeder Standard- und Probenlösung in ein sauberes Reagenzglas in zweifacher Ausfertigung. Gib 200 ul Brad Farbstoffreagens zu jedem Röhrchen. Gut mischen, dann bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Messung der Extinktion bei 595 nm. Bestimmung der Proteinkonzentration von LMPs der linearen Regression der Standardkurve. </li></ol> 2. Bronchial Gewebeexplantaten und LMPs Behandlung HINWEIS: Achten Sie besonders auf die sterile Arbeitsumgebung, und aseptisch bereiten die Lösungen und mittel folgenden Experimenten verwendet. Um die vollständige Heilung Medium vorbereiten, 1 ml der Gewebeheilung Mittelergänzung mit Serum (auf Eis aufgetaut) auf 100 ml Gewebeheilung Medium und gut mischen. 2.1) Herstellung von Bronchialgewebe Explantate <ol><li> Vor dem Kultivieren zerkratzen 6 Bereiche von 1 cm 2jeweils an der Kante der Fläche von je 100 mm Gewebekulturschale mit einem Skalpell. Coat jeweils zerkratzt 100 mm Gewebekulturschale mit 2 ml der Kulturschale Beschichtungslösung und Inkubation wird die Schale in einem befeuchteten CO 2 -Inkubator O / N bei 37 ° C. Vakuum saugen Sie den Überschusslösung und füllen Sie die Schale mit 15 ml Gewebewaschmedium. </li><li> Euthanize C57BL / 6-Mäuse (5-7 Wochen alt) durch CO 2 Inhalation nach Protokollen, die von der Tierpflege Ethik-Kommission genehmigt. </li><li> Aseptisch sezieren Lungengewebe mit Skalpell, Dumont superfeinen Pinzette und chirurgische Schere. Parenchym und Blutgefäße vorsichtig entfernen. Zeigen Lungengewebe in eiskaltes Gewebewasch Medium für den Transport ins Labor, falls zutreffend. </li><li> Ferner sezieren Bronchus im Tissue Waschmedium getaucht und trenne die Bronchien mit einem Durchmesser von 1 bis 2,5 mm vom peripheren Lungengeweben. Scheibe Bronchialgewebe in ca. 5 mm dick Bronchien Ringe mit einem Skalpell. </li&gt; <li> Verwenden Sie einen Schöpfbewegung mit den sterilen gebogenen microdissecting Pinzette zu holen die bronchiale Fragmente und legen Sie sie auf die verkratzten Stellen der Gerichte. </li><li> Entfernen Sie die Gewebewaschmedium und bebrüten die Fragmente bei RT ~ 5 Minuten, damit sie an die Gerichte zu halten. </li><li> 10 ml komplette Heilung Medium zu jeder Schale und legen Sie sie in einer kontrollierten Atmosphäre modulare Inkubatorkammer. Spülen Sie die Kammer mit hoher O 2 Gasgemisch (70% O 2, 25% N 2 und 5% CO 2). Legen Sie die Kammer in einem Benchtop Orbital-Inkubator und schütteln Sie sie bei 37 ° C. Schüttle die Kammer für 24 h bei 10 Zyklen pro Minute, bis das Medium, um intermittierend über die Fragmente fließen. </li><li> Nach 24 Stunden Inkubation, beachten Sie Gewebeexplantaten unter einem Phasenkontrast-invertierten Lichtmikroskop. Wählen bronchiale Explantate mit kompletter, feines Haar Bewegung und lebendige Bronchialepithel für nachfolgende LMPs Behandlung. </li></ol>2.2) LMPs Behandlung <ol><li> Bereiten komplette Wachstumsmedium wie folgt: Tau-Wachstumsmedium ergänzt mit Serum und Fibroblasten-Inhibitor auf Eis. 1 ml des Wachstumsmediums ergänzt mit Serum und 200 ul Fibroblasteninhibitor zu 100 ml des Wachstumsmediums; gründlich mischen. Erwärmen die vollständige Wachstumsmedium bei 37 ° C für 10 min vor der Verwendung. </li><li> Verdünne isoliert LMPs in ein neues steriles Eppendorf-Röhrchen mit PBS auf eine LMPs Lager in einer Konzentration von 800 ug / ml herzustellen. </li><li> Mit 0,5 ml vollständigem Wachstumsmedium in jede Vertiefung einer 12-Well-Gewebekulturplatte. </li><li> Übertragung der gewählten bronchiale Explantate mit den gekrümmten microdissecting Pinzette aus dem vorherigen Protokoll (Abschnitt 2.1) in jede Vertiefung der Gewebekulturplatte. </li><li> Beschriften Sie die Kulturplatte angemessen auf LMPs Behandlung Brunnen und Kontrollvertiefungen zu identifizieren. In 25 ul LMPs Lager ineinander LMPs Behandlung gut (für eine Endkonzentration von 40 ug / ml) und 25 ul Kontrollfahrzeug (siehe LMP<html> s-Produktion) zu den Kontrollvertiefungen. </li><li> Fortsetzung der Inkubation in einer kontrollierten Atmosphäre modularen Inkubatorkammer bei 37 ° C unter leichtem Schütteln. </li><li> Nach 24 Stunden, waschen Explantate 3-mal mit PBS und fahren Sie mit dem nächsten Schritt (4% Paraformaldehyd [PFA] Fixierung). </li></ol> 3. Histopathologische Untersuchung 3.1) die folgenden Lösungen an, bevor Sie den nächsten Schritte <ol><li> Bereiten 1x PBS-Puffer hergestellt, indem 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,76 mM KH 2 PO 4, pH 7,4. </li><li> Die Herstellung von 4% PFA, aufzulösen 20 g PFA in 400 ml Wasser, bei 60 ° C unter Rühren erhitzt; ein paar Tropfen von 10 M NaOH, um die Lösung zu löschen. Next hinzufügen 1x PBS-Puffer und die Lautstärke auf 500 ml und pH-Wert auf 7,4. Filter und aliquoten; bei -20 ° C. </li><li> Bereiten Sie die folgenden Austrocknung oder Rehydrierung Reagenzien; 100%, 90%, 70%, 50% Ethanol und Xylol. </li></ol>e_step &quot;&gt; 3.2) Explantation Fixierung und Gewebeschnitten Entparaffinierung <ol><li> Legen Sie jedes Explantat in einem markierten Mikrozentrifugenröhrchen mit 1,5 ml 4% PFA und Inkubation O / N bei 4 ° C. Zweimal Spülen Sie die Explantate mit 1x PBS. </li><li> Entwässern Explantate durch eine Alkoholreihe (70% Ethanol: jeder 3-mal 30 Minuten, 90% Ethanol: je 2 mal 30 min; 100% Ethanol: 3 mal 30 Minuten jeweils, dann Xylol: 3 mal 20 Minuten jede). Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur in einem Abzug. </li><li> Imbed Gewebeexplantate in Paraffin bei 58 ° C in einem Ofen. Bereiten Sie 5 um dicken Gewebeschnitten unter Verwendung eines Rotationsmikrotoms. </li><li> Schweben Sie die Abschnitte in einem 56 ° C Wasserbad, und montieren Sie die Schnitte auf beschriftet histologischen Präparaten. Objektträger in manuelle Färbung Racks und trocken bei 65 ° C für 1 Stunde. Die Objektträger bei Raumtemperatur abkühlen lassen. </li><li> Tauchen Sie die Racks in 4 aufeinander folgenden Fleckenschalen mit Xylol 10 min je nach Paraffin zu entfernen. Tauchen die Racks mit einer Ethanolserie Entfernung von Xylol: 100%, dann 95%, then 80%, dann 70%, dann 50% Ethanol (5 Minuten für jeden Schritt). Spülen Sie die Ständer mit Leitungswasser für 5 Minuten, um Ethanol zu entfernen. </li></ol> 3.3) Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) Färbung <ol><li> Weiterhin mit den Gewebeschnitten; legen die Zahnstange in einen Färbetrog mit Mayers Hämatoxylin gefüllt für 15 min. Spülen Sie das Rack mit Leitungswasser auf Hämatoxylin für 20 Minuten zu entfernen. </li><li> Platzieren in destilliertem Wasser für 30 sec.Place in 95% Ethanol für 30 sec. Platzieren Sie in Eosin G Färbelösung Gericht für 1 min. Dehydratisieren durch 2 Änderungen von 95% Ethanol, 100% Ethanol und Xylol, jeweils 2 min. </li><li> Führen Sie eine schnelle Überprüfung unter dem Mikroskop, damit überschüssiges Eosin wird entfernt. Zeigen 2-3 Tropfen Eindeckmedium (Fisher SP15-100) auf jeder Folie, dann decken mit einem Deckglas. </li></ol> 3.4) In-situ-Cell Death Detection: TUNEL Assay <ol><li> Bevor Sie beginnen, bereiten Proteinase K Arbeitslösung: 20 ug / ml in10 mM Tris / HCl, pH 7,4. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1 bis 5 von Ziffer 3.2 (Explantation Fixierung und Gewebeschnitt Entparaffinierung). Spülen Sie die Folien mit deionisiertem H 2 O </li><li> Tauchen Sie die Objektträger mit 1x PBS für 10 min. Lassen Sie das überschüssige PBS. Inkubieren Gewebeschnitten 30 min bei RT mit Proteinase K-Arbeitslösung. Rinse gleitet zweimal mit 1 × PBS. </li><li> Führen Sie die TUNEL-Assay, wie in der Bedienungsanleitung der Zelltod-Nachweis-Kit beschrieben. Montieren Sie mit Eindeckmedium und Deckglas von Hand mit Deckgläsern. </li><li> Analysieren Sie die Proben unter einem Lichtmikroskop. Verwenden Sie Image Pro 4.5, um die apoptotischen Zellen in der braunen Farbe analysieren. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Abgeordnete sind aktive Vermittler der interzellulären Übersprechen und deren Studie ist in vielen Bereichen der Wissenschaft verspricht. 11 Diese Studie präsentiert ein detailliertes Protokoll für die in-vitro-Groß Generation LMPs von einem apoptotischen T-Zelllinie abgeleitet. Diese Abgeordneten zum Ausdruck bringen ein großes Repertoire an Lymphozyten-Molekülen und sind biologisch in der Regulation von Zell- und Gewebe Homöostase beteiligt ist. Jedoch kann LMPs aus verschiedenen Quellen abgeleitet...

Mikropartikel (MPs) sind biologisch aktive Submikron-Membranvesikel, die nach Zellaktivierung oder Apoptose freigesetzt werden. MP stammen sowohl aus gesunden als auch aus geschädigten Zellen und sind an vielen physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt. 1 MP wurden nicht nur im menschlichen Plasma, sondern auch in entzündlichem und apoptotischem Gewebe nachgewiesen. Der biologische Nutzen von aus Zellmembranen gewonnenen MP wurde in verschiedenen Umgebungen nachgewiesen, einschließlich zellulärer Signalmodelle und als pharmakologisches Werkzeug. 2,3 Wir haben bereits gezeigt, dass LMPs, die aus T-Lymphozyten gewonnen werden, nach Actinomycin-D-Stimulation (zur Induktion der Apoptose) die Angiogenese unterdrücken und das Überleben und die Proliferation von Endothelzellen hemmen. 4,5 Die antiangiogene Wirkung von LMPs kann je nach den Stimuli, die zur Aktivierung von T-Lymphozyten in vitro verwendet werden, erheblich variieren. 6
Das Epithel der Atemwege fungiert als schützende physikalische und funktionelle Barriere. Eine erhöhte Anzahl von T-Lymphozyten in den Atemwegen kann zu Zellschäden und Entzündungen der Atemwege beitragen. 7 Wir haben gezeigt, dass LMPs die Apoptose menschlicher Bronchialepithelzellen induzieren,8 was darauf hindeutet, dass LMPs die Barrierefunktion des Bronchialepithels in vivo verändern können. Apoptotische Zellen können mit der TUNEL-Methode identifiziert werden, die eine in situ DNA-Fragmentierung nachweist. 
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die in vitro Produktion von LMPs aus einer T-Lymphozyten-Zelllinie zu veranschaulichen und ihre proapoptotische Wirkung auf Epithelzellen der Atemwege zu demonstrieren. Die In-situ-Zelltoddetektion zeigte, dass LMPs den Zelltod des bronchialen Epithels der Atemwege stark induzieren, was darauf hindeutet, dass eine LMPs-vermittelte Verletzung des Atemwegsepithels die Barrierefunktion des geschädigten Epithels beeinträchtigen kann.

<table><tbody><tr><td>Herstellung und Charakterisierung</td><td></td><td></td><td></td>von LMPs</tr><tr><td>CEM T-Zellen</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CCL-119</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 mittelgroß</td><td>Cambrex, Walkersville</td><td>04-744Q</td><td></td></tr><tr><td>Kolben T75</td><td>Sarstedt</td><td>83.1813.502</td><td></td></tr><tr><td>Kolben T175</td><td>Sarstedt</td><td>83.1812.502</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycin&nbsp; D&nbsp;</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>A9415-2mg</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lifetechnologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0,22 & Mikro; m Filter</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Annexin-VCy5</td><td>BD Pharmagen&nbsp;</td><td></td><td></td>559933</tr><tr><td>FACS-Fließlösung</td><td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszierende Mikrokügelchen (1 & Mikro; m)</td><td>Molekulare Sonden&nbsp;</td><td>T8880</td><td></td></tr><tr><td>Zählperlen aus Polystyrol (7 & Mikro; m)</td><td>Bangs laboratories</td><td>PS06N/6994</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylen FACS Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Pipette</td><td>Fisher</td><td>13-678-11B</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Pipette</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Pipette</td><td>Ultident</td><td>DL-357551</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml konisches Mikroröhrchen aus Polypropylen</td><td>Sarstedt</td><td>72.690</td><td></td></tr><tr><td>15 ml konisches Polypropylen-Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konisches Polypropylen-Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.205</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Hochgeschwindigkeits-Polypropylen-Copolymer-Röhrchen</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Hochgeschwindigkeits-Polypropylen-Röhrchen</td><td>Beckman</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>Protein-Assay (Bradford-Assay)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Protein-Assay Standard II</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>500-0007</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzglas 16 x 100</td><td>VWR</td><td>47729-576</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzglas 12 x 75</td><td>Ultident</td><td>170-14100005B</td><td></td></tr><tr><td>Zell-Inkubator&nbsp;</td><td>Mandel</td><td>Heracell 150</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge mit niedriger Drehzahl</td><td>IEC</td><td>Centra8R</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge mit hoher</td> Geschwindigkeit <td>Beckman</td><td>Avanti J8</td><td></td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeitsrotor für 250ml Flasche</td><td>Beckman</td><td>JLA16.250</td><td></td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeitsrotor für 50ml Röhrchen</td><td>Beckman</td><td>JA30.50</td><td></td></tr><tr><td>Fow Zytometrie&nbsp;</td><td>BD Bio-sciences</td><td>FACS Calibur</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Beckman</td><td>Serie 600</td><td></td></tr><tr><td>Explantate und Schnitte aus Bronchialgewebe&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 Mäuse (5-7 Wochen alt)&nbsp; &nbsp;</td><td>Charles River Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maus Atemwege PrimaCell&trade; System:</td><td>CHI Scientific, Inc.</td><td>2-82001</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Rib-Back Skalpellklingen aus Kohlenstoffstahl</td><td>Becton Dickinson AcuteCare</td><td>371310</td><td>#10</td></tr><tr><td>Skalpellgriff</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp;</td><td>10003-12</td><td>#7</td></tr><tr><td>Phasenkontrast-Inverses Mikroskop</td><td>Olympus Optical CO., LTD.&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>CK2</td><td></td></tr><tr><td>Gasgemisch mit hohem O2</td><td>VitalAire Canada Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>modulare Inkubatorkammer</td><td>Billups-Rothenberg Inc.</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4000 inkubierter Orbitalschüttler</td><td>Barnstead Lab-Line,&nbsp;</td><td>SHKA4000-7</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Gewebekulturplatte</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Plastische Gewebekulturschalen (100 mm)</td><td>Sarstedt, Inc.</td><td>83.1802</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schere</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp;</td><td>14060-09</td><td>Gerade, scharf, 9cm lang</td></tr><tr><td>Halb gebogene Graefe Pinzette</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp;</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>befeuchteter CO2-Inkubator</td><td>Mandel Scientific Company Inc.&nbsp;</td><td>SVH-51023421</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Histopathologische Untersuchung&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formalin-Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>HT5011</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Fisher wissenschaftlich&nbsp; International, Inc.</td><td>T555</td><td></td></tr><tr><td>Ethylalkohol</td><td>Merck KGaA, Darmstadt</td><td>EX0278-1</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Glutaraldehyd&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>G6403</td><td></td></tr><tr><td>Cacodylat</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>31533</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>VWR Scientific Inc.&nbsp;</td><td>48300-025</td><td>25x75 mm</td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Fisher wissenschaftlich&nbsp; International, Inc.</td><td>X5-4</td><td></td></tr><tr><td>Mayer-Hämatoxylin</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>MHS16</td><td>Trichter mit Filterpapier &nbsp;</td></tr><tr><td>HCl&nbsp;</td><td>Fisher wissenschaftlich&nbsp; International, Inc.&nbsp; &nbsp;</td><td>A144s-500</td><td></td></tr><tr><td>eosin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>HT110116</td><td>Trichter mit Filterpapier&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Permount&Handel; Eindeckmedium</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.&nbsp;</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Glasdeckglas</td><td>Surgipath Medical Industries, Inc.</td><td>84503</td><td>24 Mal; 24&nbsp;#1&nbsp;</td></tr><tr><td>TUNEL Detektionskit</td><td>In-situ Zelltoderkennung, POD</td><td>11 684 817 910</td><td></td></tr><tr><td>Ofen</td><td>Despatch Industries Inc.</td><td>LEB-1-20</td><td></td></tr><tr><td>Rotationsmikrotom</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td>RM2145</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Whatman International Ltd.</td><td>1003150</td><td>#3</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon Imaging Japan Inc.</td><td>E800</td><td></td></tr><tr><td>Färbeschale komplett</td><td>Wheaton Industries, Inc.</td><td>900200</td><td>inkl. Schale, Rost, Deckel</td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorf Tube</td><td>Sarstedt Inc.&nbsp;</td><td>72.69</td><td>39x10 mm</td></tr><tr><td>Orbital- und reziprokes Wasserbad</td><td>ExpotechUSA</td><td>ORS200</td><td></td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung&nbsp; &nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Abzug</td><td>Nicram RD Service</td><td>3707E</td><td></td></tr></tbody></table>

generierung von lymphatische mikropartikel und nachweis ihrer pro-apoptotische wirkung auf die epithelzellen der atemwege

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

Das Interesse an der biologischen Rolle von Zellmembranen abgeleiteten Vesikeln in Zell-Zell-Kommunikation in den letzten Jahren erhöht. Mikroteilchen (MPs) sind eine solche Art der Bläschen, deren Durchmesser von 0,1 um bis 1 um und typischerweise von der Plasmamembran von eukaryotischen Zellen, die Aktivierung oder die Apoptose zu vergießen. Hier beschreiben wir die Erzeugung von T-Lymphozyten abgeleiteten Mikroteilchen (LMPs) von apoptotischen CEM T-Zellen mit Actinomycin D. LMPs werden durch einen mehrstufigen Differenz Zentrifugationsverfahren isoliert und mittels Durchflusszytometrie stimuliert. Dieses Protokoll stellt auch eine in situ Zelltod Nachweismethode für den Nachweis der proapoptotischen Wirkung LMPs auf bronchialen Epithelzellen aus Maus primären Atem bronchiale Gewebeexplantaten abgeleitet. Hierin beschriebene Verfahren eine reproduzierbare Verfahren zur Isolierung reichliche Mengen von LMPs apoptotische Lymphozyten in vitro. LMPs abgeleitetin dieser Weise verwendet werden, um die Eigenschaften der verschiedenen Krankheitsmodellen zu bewerten und für pharmakologische und toxikologische Prüfung. Da das Atemwegsepithel bietet eine Schutz physische und funktionelle Barriere zwischen der äußeren Umgebung und der darunter liegenden Gewebe, stellt die Verwendung von Bronchialgewebe Explantate nicht immortalisierte Epithelzellen Linien ein effektives Modell für Untersuchungen Atemwegstrakt Gewebe erfordern.

LMPs wurden mit Annexin V-Färbung 10 durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) Analyse und gated mit 1 &amp; mgr; m-Perlen, in dem 97% der Abgeordneten (≤1 um) waren Annexin-V-positiven Cy5 gekennzeichnet (Abbildung 1A und 1B). Typischerweise wurden etwa 2,5 mg LMPs nach diesem Protokoll erhalten. Bronchialgewebe Explantaten aus C57BL / 6-Mäuse wurden zum Träger und LMPs Behandlung unterworfen. Histopathologische Analyse Bronchialsegmente zeigte die Wirkung von LMPs auf die strukturel...

Zellmembran-Schuppen-Mikropartikel (MP) aktiv biologischen Vesikel, die isoliert werden können und deren pathophysiologische Effekte in verschiedenen Modellen untersucht. Hier beschreiben wir ein Verfahren zum Erzeugen MPs von T-Lymphozyten (LMPs) abgeleitet und zur Demonstration ihrer proapoptotischen Effekt auf Epithelzellen der Luftwege.

Generierung von lymphatische Mikropartikel und Nachweis ihrer pro-apoptotische Wirkung auf die Epithelzellen der Atemwege

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die in vitro-Produktion lymphozytärer Mikropartikel oder LMPs aus einer T-Lymphozyten-Zelllinie zu veranschaulichen und deren pro-apoptotische Wirkung auf Atemwegsepithelzellen nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem zunächst die LMPs hergestellt werden. Anschließend werden die isolierten LMPs mittels FACS-Analyse charakterisiert. Anschließend werden die Bronchialgewebe-Explantate kultiviert. Schließlich erfolgt die LMP-Behandlung an den Bronchial-Explantaten. Letztendlich kommen histopathologische Untersuchungen wie Hämatoxylin-Eosin-Färbung und die Detektion von Zelltod mittels NC zwei zum Einsatz, um die durch LMP induzierten Schäden der bronchialen Epithelschicht sowie die Apoptose epithelialer Zellen nachzuweisen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Isolierung von Mikropartikeln aus menschlichem peripherem Blut liegt darin, dass wir eine großskalige Erzeugung von aus einer Zelllinie stammenden Mikropartikeln in vitro durchführen können. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die kritischen Schritte der Bronchien-Explantat-Kultur nicht leicht herzu

generation-lymphocytic-microparticles-detection-their-proapoptotic

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Hier beschreiben wir Protokolle zum Ernten von murinen Alveolarmakrophagen, die ihren Sitz angeborenen Immunsystems Zellen in der Lunge und Prüfung ihrer Aktivierung in Reaktion auf Co-Kultur mit Polyanhydrid Nanopartikel.

Ernte Murine Alveolarmakrophagen und Auswerten zelluläre Aktivierung von Polyanhydrid Nanopartikel Induced

Dieses Video zeigt die Erzeugung und Isolierung von T-Lymphozyten-abgeleiteten Mikropartikeln, LMPs, aus T-Lymphozyten nach der Behandlung mit Actinomycin-D.

Isolierung von Mikropartikeln aus apoptotischen T-Lymphozyten in vitro

Wir beschreiben ein Verfahren zur Erzeugung von Precision-cut Lung Slices (PCLS) und immunostaining sie die Lokalisierung verschiedenen Immunzelltypen in der Lunge sichtbar zu machen. Unser Protokoll kann erweitert werden, um die Position und Funktion vieler verschiedenen Zelltypen unter einer Vielzahl von Bedingungen zu visualisieren.

Precision-cut Maus Lung Slices Live-Pulmonary Dendritische Zellen sichtbar zu machen

Neue Protokolle werden hier beschrieben, zu isolieren und zu charakterisieren Mikropartikel abgeleitet von Mensch und Maus Neutrophile. Diese Protokolle nutzen Ultrazentrifugation, Durchflusszytometrie und Immunoblotting Techniken Mikropartikel Inhalte zu analysieren, und sie können zur Untersuchung der Rolle von Mikropartikeln aus verschiedenen Zelltypen in zelluläre Funktion abgeleitet.

Isolierung und Charakterisierung von Neutrophilen abgeleitet Mikropartikel für funktionelle Studien

Wir beschreiben die Erkennung des NLRP3-Inflammasome-Aktivierung auf zellulärer Basis mit Fluoreszenz-Mikroskopie und Färbung für aktive Caspase-1 und den Adapter, ASC. Ein Laktat-Dehydrogenase-Release-Assay wird vorgestellt, um Pyroptotic Lyse auf Basis einer Bevölkerung zu erkennen. Diese Techniken können angepasst werden, um viele Aspekte der Inflammasome Biologie zu studieren.

Erkennung von Inflammasome Aktivierung und Pyroptotic Zelltod in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet

Die hier vorgestellte Protokoll ermöglicht Charakterisierung von homing Lungenkapazität von primären menschlichen Lymphozyten unter in-vivo entzündlichen Erkrankungen. Pulmonale Infiltration der adoptively übertragenen menschlichen Immunzellen in einem Mausmodell der allergische Entzündung kann abgebildet und durch Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie von chemisch ausgeglichenen Lungengewebe quantifiziert werden.

Erweiterte Bildgebung der Lunge Homing menschlichen Lymphozyten in einem experimentellen In Vivo Modell der allergische Entzündung basierend auf Licht-Blatt Mikroskopie

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Bestimmung, ob die Exposition gegenüber Ozon, einem Kriterium des Luftschadstoffs, die Alveolarmakrophagen-Efferozytose in vivo beeinträchtigt. Dieses Protokoll verwendet häufig verwendete Reagenzien und Techniken und kann an mehrere Modelle von Lungenverletzungen angepasst werden, um Die Auswirkungen auf die Alveolar-Makrophagen-Efferozytose zu bestimmen.

In Vivo Bewertung der Alveolar Makrophagen-Efferozytose nach Ozon-Exposition

Wir beschreiben ein Protokoll für ein dreidimensionales Co-Kultur-Modell infizierter Atemwege, mit CFBE41o- Zellen, THP-1 Makrophagen und Pseudomonas aeruginosa, die an der Luft-Flüssig-Schnittstelle eingerichtet wurden. Dieses Modell bietet eine neue Plattform, um gleichzeitig die Wirksamkeit von Antibiotika, die Epithelbarrierefunktion und entzündungshemmende Marker zu testen.

P. aeruginosa Infizierte 3D-Co-Kultur von Bronchialepithelzellen und Makrophagen an der Luft-Flüssig-Schnittstelle zur präklinischen Bewertung von Anti-Infektivika

Kombinierte Ozon- und bakterielle Endotoxin-exponierte Mäuse zeigen einen weit verbreiteten Zelltod, einschließlich des von Neutrophilen. Wir beobachteten zelluläre Anpassungen wie die Störung der zytoskelettalen Lamellipodie, eine erhöhte zelluläre Expression der komplexen V-ATP-Synthase-Untereinheit β und Angiostatin in der broncho-alveolären Lavage, die Unterdrückung der Lungenimmunantwort und eine verzögerte Neutrophilenrekrutierung.

Visualisierung von lungenzellulären Anpassungen während kombinierter Ozon- und LPS-induzierter akuter Lungenverletzungen bei Der Maus

In dieser Arbeit wird eine reproduzierbare, kostengünstige und robuste Methode zur Isolierung und Expansion von primären Bronchialepithelzellen für das langfristige Biobanking und die Erzeugung differenzierter Epithelzellen durch Kultur an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche vorgestellt.

Isolierung von Bronchialepithelzellen aus reseziertem Lungengewebe für Biobanken und Etablierung gut differenzierter Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen

Lernen Sie die in-vitro-Produktion lymphatischer Mikropartikel aus T-Lymphozyten-Zelllinien und deren pro-apoptotische Wirkung auf Atemwegsepithelzellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellulärer Interaktionen in der Immunforschung.

Generierung von lymphatische Mikropartikel und Nachweis ihrer pro-apoptotische Wirkung auf die Epithelzellen der Atemwege

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