Perforated-Patch-Clamp-Aufzeichnung der Maus Riechzellen in Intact Neuroepithel: Funktionelle Analyse von Neuronen, die eine bestimmte Geruchsrezeptor

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Veränderungen der Membraneigenschaften von olfaktorischen sensorischen Neuronen als Reaktion auf Geruchsstimulanzien zu messen. Dazu wird zunächst das Riechepithel präpariert und in eine durchblutete Kammer überführt. Der zweite Schritt besteht darin, eine OSN von Interesse unter dem Mikroskop zu lokalisieren und auszuwählen.

Der dendritische Knopf des gewählten OSN wird dann gepatchklemmt und analysiert, während er mit Odoriermitteln stimuliert wird. Letztendlich charakterisiert die perforierte Patch-Klemmung von dendritischen OSN-Noppen die funktionellen Eigenschaften von OSN auf Membranebene. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Geruchsbereich zu beantworten, wie z. B. die Aufzeichnung von olfaktorischen, sensorischen Neuronen, die Expression definierter Geruchsrezeptoren und auch Patch-Clamp-Aufnahmen.

Geben Sie Auskunft über die Membraneigenschaften dieser Neuronen. Bereiten Sie die stimulierenden Pipetten aus einem Millimeter Glas vor oder kaufen Sie sie vorgezogen mit einer Flamme. Biegen Sie sechs Pipetten etwa einen Zentimeter von der Spitze entfernt in einen 45-Grad-Winkel.

Ordnen Sie dann die sechs Pipetten mit gebogener Spitze um eine siebte gerade Pipette an, nehmen Sie eine Öse als Führung und wickeln Sie sie in einen Schrumpfschlauch. Erhitze die Schrumpffolie am anderen Ende der Pipetten. Tragen Sie mehr Schrumpffolie auf.

Dies ergibt eine Prepo Stimulationspipette mit sieben Zylindern. Ziehen Sie nun mit einer Polpipette mit mehreren Zylindern an der Stimulationspipette mit sieben Zylindern. Nach dem Ziehen verstärken Sie die Baugruppe mit etwas weißem Kleber um die Öse.

Lassen Sie dann den Kleber über Nacht von den gewünschten Lösungen trocknen. Die Nystatin-Lösung muss kurz vor ihrer Verwendung frisch gemacht werden. Wiegen Sie bei Bedarf drei Milligramm Nystatin ab und fügen Sie es zu 50 Mikrolitern DMSO hinzu.

Dann die Mischung 20 Sekunden lang vortexen. Anschließend beschallen Sie die Mischung zwei bis drei Minuten lang, um eine vollständige Verdünnung zu gewährleisten. Geben Sie nun 20 Mikroliter der Mischung auf fünf Milliliter intrazelluläre Stammlösung.

Mixen Sie 20 Sekunden lang, gefolgt von zwei bis drei Minuten Beschallung. Dann die Arbeitslösung auf Eis abkühlen und lichtgeschützt vorbereiten. Auf diese Weise ist die funktionierende Lösung einige Stunden lang gut.

Legen Sie eine mit Mikrofilm bestückte Spritze mit Arbeitslösung ein. Es ist eine Stunde lang gültig, bis es verwendet wird. Bewahren Sie die geladene Spritze jedoch auf, indem Sie sie auf Eis legen.

Ziehen Sie nun einige Aufzeichnungselektroden mit langen Hälsen und zwei Mikrometeröffnungen. Ziel ist es, einen Widerstand von 15 bis 20 Megaohm zu erreichen, sobald er mit Nystatin-Lösung geladen ist. Zum Schluss befüllen Sie die stimulierende Pipette mit einem im Ringer verdünnten Odoriermittel. Lösung.

Für dieses Protokoll sollten Sie Mäuse im Alter von zwei bis vier Wochen zur Verfügung haben. In dieser Präsentation werden Mäuse, die oder IRES tau GFP exprimieren, unter Verwendung von oder IS tau GFP Mäusen verwendet. Alle Neuronen, die das oder von Interesse exprimieren, werden mit GFP markiert.

Diese Methode kann für alle Zonen verwendet oder in diesen ausgedrückt werden. Präparierungen und Aufzeichnungen sind jedoch für OPs, die in der dorsalen Zone exprimiert werden, einfacher. Beginnen Sie damit, eine Maus zu betäuben und dann zu enthaupten.

Das Ergebnis dieses Protokolls hängt von der Qualität der Dissektion ab. Diese Präparierschritte müssen so kurz wie möglich und präzise sein. Um die Operation zu beginnen, verwenden Sie eine Präparierschere, um einen Längsschnitt entlang des Rückens zu machen.

Ziehe die Haut auseinander, um sie zu entfernen. Schneiden Sie dann entlang des Unterkiefers und machen Sie einen koronalen Schnitt parallel zu den Zähnen. Entfernen Sie also die oberen Schneidezähne.

Machen Sie nun einen koronalen Schnitt um den Kopf hinter den Augen, entsorgen Sie den hinteren Kopf und übertragen Sie den vorderen Teil in eiskalte Ringer. Isolieren Sie nun unter einem Präpariermikroskop das Septum innerhalb von fünf bis 10 Minuten. Beginnen Sie mit einem Längsschnitt entlang der Bauchseite.

Schneiden Sie dann die dorsalen Knochen in Längsrichtung entlang der dorsalen lateralen Seite der Nasenhöhle ab. Als nächstes entfernen Sie die meisten Knochen und den Gaumen. Übertragen Sie das isolierte Septum und befestigen Sie das Epithel an einem Behälter mit sauerstoffhaltigen Ringern bei Raumtemperatur.

Treffen Sie innerhalb von fünf Minuten die letzten Vorbereitungen vor der Aufnahme. Die Lösung darf nicht zu warm sein, sonst sieht die Zubereitung beschädigt aus. Um auf das Neuroepithel für die Aufzeichnung zuzugreifen.

Zuerst schälen Sie das Epithel mit einer Pinzette aus dem darunterliegenden Septum. Schneiden Sie dann mit einer Mikro-Vanna-Schere das vordere Ende des Septums ab, um das Epithel freizusetzen. Entferne nun vorsichtig das Nasenorgan des Vomers.

Schneiden Sie es an der Stelle ab, an der es dorsal befestigt ist. Das isolierte Epithel kann nun mit der Schleimseite nach oben in die Aufnahmekammer verschoben werden. Sobald es an Ort und Stelle ist, verwenden Sie eine Harfe, um das Gewebe zu glätten.

Übertragen Sie dann die Kammer in ein aufrechtes Mikroskop. Visualisieren Sie das Neuroepithel unter einem 40-fachen Wasserimmersionsobjektiv, während Sie es kontinuierlich mit frischen Ringern bei Raumtemperatur durchbluten. Um mit der Suche nach den interessierenden Zellen zu beginnen, die in diesem Fall EGFP exprimieren, wird also 480-Nanometer-Licht verwendet, um nach Zellen zu suchen, die Licht im Bereich von 530 bis 550 Nanometern emittieren.

Die anvisierten dendritischen Knöpfe und osn sollten bei einer Überprüfung bei 80 bis 160 x im Hellfeld deutlich von den Stützzellen unterscheidbar sein. Beladen Sie nun die Elektrode mit einer S-Statinlösung. Klopfen Sie die entstehenden Blasen aus und befestigen Sie die Elektrode an der Halterung.

Üben Sie nun etwas Überdruck aus. Der erwartete Widerstand liegt zwischen 15 und 20 Megaohm. Bringen Sie dann die Elektrode unter Beibehaltung des Überdrucks zur Zelle.

Wenn der Widerstand auf etwa 40 Megaohm ansteigt, lassen Sie den Druck ab und üben Sie einen leichten Unterdruck aus. Wenn eine Giga-Dichtung hergestellt wird, sollte das Membranpotential bei etwa minus 75 Millivolt eingespannt werden. Nachdem die Zelle geöffnet ist, fahren Sie mit dem Experiment fort.

Wenden Sie bei Bedarf Stimulation, Protokolle und Perfusion mit pharmakologischen Behandlungen an, um mit einem einzigen Odorant zu testen. Zeichnen Sie 200 bis 500 Millisekunden spontaner Aktivität auf. Tragen Sie das Odormittel 500 Millisekunden lang auf und messen Sie dann die Reaktionen bis zu 10 Sekunden lang unter Verwendung des beschriebenen Protokolls.

MOR 23, exprimierende Neuronen, die mit EGFP markiert sind, wurden gepatcht und mit unterschiedlichen Konzentrationen von al stimuliert. Im Strom-Clamp-Modus ist Lyal ein Ligand für MOR 23. Alternativ wurden die Zellen im Voltage-Clamp-Modus simuliert.

Bei Aufzeichnungen im Spannungsklemmenmodus wurden unterschiedliche Charakteristika überwacht. Um die Reaktion, wie sie klassisch in der Elektrophysiologie durchgeführt wird, unter Verwendung des maximalen Amplitudengangs zu quantifizieren, wurde die Dosis-Wirkungs-Beziehung unter Verwendung der Hill-Gleichung aufgetragen. Diese Ergebnisse liefern Informationen über die Codierungseigenschaften der einzelnen OSNs, einschließlich der Erkennungsschwelle, des zeitlichen, dynamischen, dynamischen Bereichs und des Sättigungsniveaus.

Sobald Sie diese Technik beherrschen, kann der Sezierteil dieser Technik innerhalb von 10 bis 15 Minuten durchgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die funktionellen Eigenschaften von olfaktorischen sensorischen Neuronen untersuchen können, die definierte Geruchsrezeptoren bei Mäusen exprimieren.