Name: Perforated-Patch-Clamp-Aufzeichnung der Maus Riechzellen in Intact Neuroepithel: Funktionelle Analyse von Neuronen, die eine bestimmte Geruchsrezeptor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Erfahren Sie die perforated-patch-clamp-Technik zur Aufzeichnung von Riechzellen in intaktem Neuroepithel bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht die funktionelle Analyse spezifischer Geruchsrezeptoren und liefert wertvolle Einblicke in die Membraneigenschaften olfaktorischer Neuronen.

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Die Autoren möchten Peter Mombaerts für das großzügige Geschenk von OR-GFP-Mäusen danken; Anne Lefranc und die Tieranlage CSGA für eine hervorragende Tierpflege. Die Finanzierung erfolgte durch das CNRS in Form von ATIP- und ATIP-Plus-Stipendien, durch den Conseil Régional de Bourgogne (FABER- und PARI-Stipendien) und durch die Université de Bourgogne (BQR-Programm).

Dieses Protokoll folgt den Tierpflege Richtlinien der Université de Bourgogne und wurde von der Université de Bourgogne Ethikkommission genehmigt. 1. Tiere <ol><li> Verwenden gentechnisch OR-IRES-tauGFP Mäuse verfügbar am Jackson Laboratory. Diese Mäuse wurden in Dr. Peter Mombaerts &#39;Labor, um Axon-Targeting und Entwicklung des olfaktorischen Systems 19 Analyse entwickelt. ZB die MOR23-IRES-tauGFP Linie, Fahrzeugnummer 006643, trägt den offiziellen Namen Stamm B6; 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ; Auch die SR1-IRES-tauGFP Linie, Fahrzeugnummer 6717 trägt den offiziellen Namen B6; 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ. </li><li> In Bezug auf das Alter der Tiere: für ein besseres Ergebnis der Protokoll verwenden Tieren zwischen 2 und 4 Wochen alt sind. In dieser Altersgruppe ist die Präparation leichter (weicher Knochen, festere Riechepithel) und die dendritischen Knöpfe sind bigger Vergleich zu älteren Tieren. </li></ol> 2. Herstellung von Elektroden und Lösungen <ol><li> Für die anregende Pipetten: Kauf prepulled anregende Pipetten. Andernfalls manuell vorzubereiten. <ol><li> Unter Verwendung einer Flamme, biegen sechs 1 mm Glaspipetten bei etwa 1 cm von der Spitze. Legen Sie diese sechs Pipetten sowie eine gerade 7. in 1,5 cm Schrumpfschlauch zu stärken durch eine Öse. </li><li> Schrumpf den Schlauch, um die Fässer miteinander verbunden zu halten. Bringen Sie eine zusätzliche Schrumpfschlauch, um das andere Ende der Fässer. Ziehen Sie diese anregende Pipette mit einem Multi-Barrel Magnet. </li><li> Fügen Sie etwas weiß Flüssigkleber rund um die Öse, um die gebogenen Spitzen zu stärken. Trocknen lassen O / N. </li></ol></li><li> Vorbereitung 1 oder 2 L normaler Ringer- extrazelluläre Lösung (in mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO 4 1.3, CaCl 2 2, NaHCO 3 26, NaH 2 PO 4 1,25, Glucose 15, pH 7,6 und 305 mOsm). Halten bei 4 ° Cbis zur Verwendung. </li><li> Vorbereitung intrazellulärem Stammlösung (in mM): KCl 70, KOH 53, Methansulfonsäure 30, EGTA 5, HEPES 10, Saccharose 70; pH 7,2 (KOH) und 310 mOsm. Halten bei 4 ° C bis zur Verwendung. Gut für mehrere Wochen. </li><li> Bereiten intrazellulären Recording-Lösung mit Nystatin aus dem Stegreif (in letzter Minute), bevor Experiment. <ol><li> Wiegen 3 mg Nystatin, fügen Sie 50 ul DMSO; Wirbel 20 sec beschallen dann 2-3 Minuten, bis vollständig verdünnt. </li><li> Mit 20 &amp; mgr; l DMSO-Nystatin-Lösung in 5 ml Stammlösung intrazellulär. Vortex 20 sec, dann 3 min beschallen. Diese Lösung wird bei 4 ° C und vor direktem Licht schützen, ist Nystatin lichtempfindlich. Diese Lösung kann für einige Stunden verwendet werden. Jeden Tag zu ersetzen. </li><li> Sobald das Riechepithel Präparat unter dem Mikroskop, nehmen Sie etwas von dieser Lösung in einer 1-ml-Spritze mit einer Flamme und gedehnten gelber Spitze, um die Elektroden zu füllen; vor direktem Licht schützen. Sobald bei RT, der Nystatin-Lösungnicht stabil ist; ersetzen Sie die Lösung in der 1 ml Spritze jede Stunde oder halten Sie es in Eis. </li></ol></li><li> Ziehen Aufzeichnungselektroden mit einer Abziehvorrichtung langen Hals und kleine Spitze (~ 2 &amp; mgr; m) mit einem Widerstand von 15-20 MOhm mit dem internen Nystatin-Lösung zu erhalten. </li><li> Bereiten Geruchsstoff-Lösung mit 0,5 M in DMSO unter Abzug; aliquoten bringen und -20 ° C bis zur Verwendung. Verdünnte Riechstoff in Ringer-Lösung, bis die gewünschte Konzentration. Füllen Sie den stimulierenden Pipette. </li></ol> 3. Herstellung von Riechepithel Hinweis: oder-IRES-tauGFP Mäuse exprimieren das tauGFP unter der Steuerung der ODER-Promotor. Bei diesen Mäusen werden alle Neuronen, die oder von Interesse mit GFP markiert. Dieses Protokoll wird für die Regionen in äußerster Rand in allen Zonen ausgedrückt angepasst. Allerdings sind Dissektionen und Aufnahmen einfacher für OPs im Rückenbereich ausgedrückt. <ol><li> Betäuben das Tier durch Injektion einer Mischung aus Ketamin und Xylazin (150 mg / kg und 10 mg / kg BODy Gewicht, respectively). Enthauptung kann mit einer scharfen Schere für junge Mäuse oder mit einem ordnungsgemäß gewartet Nagetier Guillotine für ältere Mäuse durchgeführt werden. <ol><li> Verwendung Ring Präparierscheren einen mittleren Längsschnitt durch die Rückenhaut. Entfernen Sie die Haut, indem Sie sie auseinander. Mit der Schere, schneiden Sie die Unterkiefer im Kiefergelenk. Entfernen Sie die oberen Frontzähne durch einen koronalen Schnitt parallel zu den Zähnen. </li><li> Machen Sie einen koronalen Schnitt des Kopfes hinter den Augen, und nur den vorderen Teil des Kopfes zu halten. Tauchen sie in eiskaltes Ringer-Lösung für die Präparation in den Geltungsbereich. </li></ol></li><li> Sezieren in den Anwendungsbereich: in der Bauchseite, stellen einen Längsschnitt entlang der Oberkiefer / Zähne. Schneiden Sie die dorsalen Knochen in Längsrichtung nach der dorsolateralen Seite der Nasenhöhle. Entfernen Sie die meisten Knochen und Gaumen; übertragen die Scheidewand und das Epithel mit ihm verbunden in Sauerstoff angereichert Ringer bei RT. </li><li> Für die endgültige Präparation: Kurz vor Beginn der AufzeichnungSitzung, abziehen der Epithel von der zugrunde liegenden Septum mit einer Pinzette. Nehmen Sie das Epithel mit einer Pinzette und mit zwei 4-5 mm Scherenschnitte (Verwendung microvannas Schere) auf den vorderen Teil der Nasenscheidewand, wo die Haftung ist stärker. <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig die Vomeronasalorgans durch Ausschneiden entlang der dorsalen Verbindung zum Septum-Epithel. Übertragen Sie das Epithel zu einer Aufzeichnungskammer, die mit der Schleimschicht nach oben; halten Sie es flach in der Kammer mit einer Harfe. </li></ol></li><li> Installieren Kammer unter einem aufrechten Mikroskop mit Fluoreszenzoptik und einer empfindlichen Kamera ausgestattet. Visualisieren Sie die Vorbereitung auf dem Computerbildschirm bei hoher Vergrößerung durch ein 40-fach Wasserimmersionsobjektiv (numerische Apertur 0,8) und ein extra 2X oder 4X Vergrößerung durch eine Vergrößerungslinse erreicht. Perfundieren kontinuierlich mit Sauerstoff angereichert Ringer bei RT (1-2 ml / min). </li></ol> 4. Recording Session <ol><li> Suchen Sie für fluoreszierende Zelle: regen die Herstellung bei 480nm für EGFP, die Licht im Bereich 530-550 nm emittiert; Ziel einer dendritischen Knopf, der in der Fluoreszenz und unter Hellfeld zuverlässig sichtbar ist. </li><li> Füllen Elektrode mit intrazellulären Lösung mit Nystatin; entfernen Luftblasen durch leichtes Antippen auf der Elektrode. </li><li> Einfügen Elektrode auf Elektrodenhalter, gelten positive Druck in der Pipette; Widerstand sollte 15-20 MOhm sein. </li><li> Bringen Elektrode in der Nähe der Zelle; einmal Widerstand erreicht ~ 40 MOhm, lassen Druck und mit leichtem Unterdruck wird eine undurchlässige erreichen. </li><li> Sobald Dichtung erreicht ist, setzen Sie das Membranpotential von etwa -75 mV; </li><li> Sobald die Zelle geöffnet wird, fahren Sie mit Stimulationsprotokolle, pharmakologische Behandlungen. Um die Antwort auf eine einzelne Riechstoff Stimulation Rekord 200-500 ms von spontaner Aktivität zu messen, zu stimulieren für 500 ms und messen die Antwort der Zelle bis zu 10 sec 13. Für pharmakologische Behandlungen, durchströmen die pharmakologischen Mitteln andie gewünschte Konzentration 20. </li></ol> 5. Datenanalyse <ol><li> Analysieren von Geruchsstoffströme Stimulation ausgelöst wie folgt: die maximale Amplitude, die Anstiegszeit (Zeit notwendig, 90% der Maximalamplitude erreichen, in msec), dem Gesamtstrom (Fläche unter der Kurve in PAS), die Zeit, zu 50% (Zeit zwischen dem Beginn und dem Versatz der Reaktion bei 50% der maximalen Amplitude in ms). <ol><li> Mit den Spitzenübertragungsströme (maximale Amplitude erreicht) in unterschiedlichen Konzentrationen, ziehen und passen eine Dosis-Wirkungs-Kurve mit der Hill-Gleichung: I = Imax / (1 ​​+ (K 1/2 / C) n), wobei I den Spitzenstrom Imax die maximale Antwort bei sättigenden Konzentrationen, K1 / 2 die Konzentration, bei der die Hälfte der maximalen Reaktion erreicht war, C die Konzentration des Geruchsstoffs und n der Hill-Koeffizient. </li></ol></li><li> Analysieren Sie Aufnahmen von Membranpotential in Stromzange für die maximale Depolarisation, die total Potential ausgelöst (Fläche unter der Kurve in mVsec); Rekord spontane spiking Aktivität über 30 sec bis 1 min-Aufnahmen; Rekord Erregbarkeit durch Spikes durch Injektion von Strömen (5-10 pA) ausgelöst. </li></ol>

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</ol>

Die Verfasser erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die Fähigkeit dieses Protokoll, um die Eigenschaften der gesunden OSNs korrekt überwachen hängt stark von der Qualität der Vorbereitung. Daher sind die Dissektion Schritte kritisch. Zunächst ist es wichtig, auf die Qualität (pH, Osmolarität), Sauerstoffzufuhr und Temperatur (eiskalten, aber nicht gefroren) der Dissektion Medium zu zahlen. Zweitens müssen die Manipulation der Epithel mit Präparierbesteck so begrenzt wie möglich ist, Schäden zu vermeiden. Schließlich ist es wichtig, eine Zubereitung so flach wie möglich, ...

Riechzellen (OSN) stellen den ersten Schritt der Geruchswahrnehmung. Das Hotel liegt im Riechepithel Auskleidung der Nasenhöhle in Nagetieren, verwandeln sie die chemische Informationen von Geruchsstoffen in Aktionspotentiale durch ihre Axon an das Gehirn gesendet. Die Duftverarbeitung Mechanismen besser zu verstehen, ist es notwendig, die Transduktion und Membraneigenschaften OSNs charakterisieren. Bis vor kurzem waren die meisten Techniken verwendet werden, um die Eigenschaften von Säugetier OSNs charakterisieren wurden an dissoziierten OSNs 1-4 durchgeführt. Die Dissoziation Verfahren verwendet verschiedene mechanische und chemische (dh Enzyme) Prozesse, die OSNs aus ihrer Umgebung zu befreien. Diese Prozesse führen zu einer geringen Anzahl von verfügbaren Zellen für Aufzeichnungen. Diese geringe Zahl kann im Fall von GFP markierten Zellen noch kritisch. Dissoziation entfernt auch die lokale Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen OSNs und anderen Zellen des olfaktorischen Epithels surviv erhöhen kannal und Modulation OSNs &#39;Eigenschaften. Um die Dissoziation Verfahren umgehen, wurde ein intaktes Präparat 5 entwickelt. Jedes OSN drückt eine Geruchsrezeptor (OR), die aus einer großen Multigenfamilie 6. Es gibt ~ 1.000 OPs im Haupt Riechepithel in der Maus zum Ausdruck gebracht. Aufgrund der großen Anzahl von OR in Wildtyp-Tiere, die Chancen zu OSNs exprimieren denselben Datensatz oder sehr gering sind. Um diese Einschränkungen zu überwinden, sind Gen gerichtet Mäusen vorhanden, in der alle OSNs exprimieren eine bestimmte oder mit einem fluoreszierenden Protein, 7-9 bezeichnet. Diese markierten OSNs wurden verwendet, um Funktionsanalyse in dissoziierten Vorbereitungen 7,10,11 mit den bereits erwähnten Nachteilen zu tun. Ein intaktes Epithel Vorbereitung 5 aus genetisch markierten Mäusen umgeht daher diese Fragen. Es erlaubt die Überwachung der Aktivität des OSNs exprimieren genau definierten ORs in einer Umgebung so dicht in vivo wie möglich. Außerdem Patch-Clamp-Aufnahmen von OSNs erlauben auch genaue Analyse der Membraneigenschaften, Übertragungsweg Pharmakologie, Ligand / oder Wechselwirkungen. Alle diese Themen kaum mit extrazellulären Aufnahmen analysiert werden. Wir nutzten diese Technik, um die Reaktionen der OSNs Expression der Geruchsrezeptoren SR1 und MOR23 12,13 überwachen. Die Machbarkeit der Technik wurde von anderen Gruppen auf MOR23 ausdrücken OSNs 14 sowie auf andere Regionen in äußerster Rand exprimierenden Neuronen 15,16 bestätigt. Die Überwachung eines definierten Population von OSNs können zur Analyse ihrer Eigenschaften in vielen verschiedenen Zusammenhängen wie Entwicklung 14 führen, Alterung 17, Geruchsstoff induzierter Plastizität 18, und die Rolle der Veränderungen in Folge der Geruchsrezeptor in Duftkodierung 15. Dieses Protokoll stellt somit ein leistungsfähiges Werkzeug, um die funktionellen Eigenschaften definiert OSNs an der Membranebene zu überwachen.

<table><tbody><tr><td>Vibrationstisch mit Faradayscher Käfig</td><td>TMC</td><td>63-500 SERIE</td><td>erforderlich: isoliert das Aufzeichnungssystem von Vibrationen, die durch die Umgebung hervorgerufen werden (Bewegungen des Experimentators, Vibrationen von Geräten wie Lüftern zur Kühlung von Computern usw.); kann auch mit einem Faradayschen Käfig gekauft oder mit einem speziell angefertigten Faradayschen Käfig ausgestattet werden; dieser Käfig wird empfohlen, um elektrisches Rauschen durch die</td></tr><tr><td>Umgebungsoptik</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>zu vermeidenMikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>aufrechtes Mikroskop mit Epifluoreszenz; fester oder beweglicher Tisch, je nach Vorliebe des Benutzers Objektive</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>LUMPLFL40XW</td><td>mindestens 2 Objektive erforderlich: ein 4X oder 10X für die grobe Annäherung an die Zelle; und ein 40X Immersionsmikroskop für große Entfernungen Beispiel Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3,3 MM</td></tr><tr><td>Lupe</td><td>Olympus</td><td>U-TVCAC</td><td>UNBEDINGT ERFORDERLICH: im Strahlengang zwischen Objektiv und Kamera platziert; ermöglicht die Vergrößerung des Bildes auf dem Bildschirm, um den Knopf genau zu erreichen. Mit der</td></tr><tr><td>Aufnahmeelektrodenkamera</td><td>Olympus</td><td>DP72</td><td>ist eine gute Kamera erforderlich, um die Neuronen sowohl in der Fluoreszenz als auch im Hellfeld zu sehen; die Steuerungssoftware ist einfach und ermöglicht das Aufnehmen von Bildern und das Erstellen von Live-Kamerabildern, um die Annäherung der Elektrode an die Zelle zu überwachen. Eine hochempfindliche Kamera ist nicht notwendig</td></tr><tr><td>filtert</td><td>Olympus/Chroma</td><td></td><td>in Abhängigkeit von dem in den Mäusen verwendeten fluoreszierenden Protein; Beispiel für GFP: Anregung: BP460-490: Emission: HQ530/50m</td></tr><tr><td>Verstärker</td><td>HEKA</td><td>EPC10 USB</td><td>überwacht die durch die Aufnahmeelektrode fließenden Ströme und steuert auch das Puffen, indem es ein TTL-Signal an die Schorle sendet; der EPC10-Aufbau wird über eine Computersoftware gesteuert</td></tr><tr><td></td><td>HEKA</td><td>Patchmaster</td><td>steuert den Verstärker während des Experiments</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sutter</td><td>MP225</td><td>Präzisions-Mikromanipulator, ermöglicht präzise Bewegungen bis zu 1/10 Mikrometer; dieses Modell ist sehr stabil; vermeiden Sie hydraulische Manipulatoren, die abdriften können</td></tr><tr><td>Elektrodenabzieher</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>mit einem FT345-B Filament mit breiter Mulde; &nbsp; zur Vorbereitung von Aufnahmepipetten von ca. 2&micro; m Durchmesser mit einer langen Spitze, um die Zellen zu erreichen; Der Widerstand sollte 15 bis 20 MOhm mit perforiertem Patch Clamp</td></tr><tr><td>Solution Glas</td><td>Sutter</td><td>BF120-69-10</td><td>betragen Unter unseren Aufnahmebedingungen ist dieses Glas ideal für die Aufnahme von Pipetten</td></tr><tr><td>Aufnahmekammer</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td><td>eine Kammer wird benötigt, um die Vorbereitung unter dem Mikroskop einzustellen. Um die Präparation in der Mitte der Kammer zu halten, sollte ein Netz/Anker verwendet werden.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Stimulationsglas</td></tr><tr><td></td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td>in Gruppen von 7 angebracht, diese Pipetten werden verwendet, um vorgezogene stimulierende Pipetten</td></tr> vorzubereiten <tr><td>Mehrzylinder-Abzieher</td><td>MDI</td><td>PMP-107-Z</td><td>durch Assoziation von Ziehen und Drehen, dieser Abzieher ermöglicht es uns, Puff-Elektroden mit 7 Fässern</td></tr><tr><td>Präzisions-Druckinjektor vorzubereiten &nbsp;</td><td>Toohey Company</td><td>P/N T25-1-900 Einkanal&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Dieser Präzisions-Druckinjektor steuert den im Mehrzylinderabzieher abgegebenen Druck; er wird manuell oder vom Verstärker über einen 5V&nbsp gesteuert; TTLs</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>YOU-1</td><td>ein grober Manipulator reicht aus, um die Puffelektrode in die Nähe der Aufnahmestelle zu bringen</td></tr><tr><td>Schläuche</td><td>N/A</td><td></td><td>Tygonschlauch, um den Druck vom Puffer auf die Puffpipette zu bringen</td></tr><tr><td>Lösungen/Perfusion/Chemikalien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vakuumpumpe</td><td>Gardner Denver</td><td>300 Serie</td><td>eine vibrierende Membranpumpe ist leiser und effizienter als andere Pumpentypen</td></tr><tr><td>Perfusionssystem</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Schwerkraftperfusionssystem mit Polyethylenschlauch zum Ein- und Ausbringen der externen Lösung aus der Aufnahmekammer</td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3503</td><td>obligatorisch zur Perpation der internen Lösung für perforierte Patch-Klemme</td></tr><tr><td>DIMETHYL SULFOXIDE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td>Wird verwendet, um Nystatin für die interne Lösung für perforierte Pflaster aufzulösen&nbsp;</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td>extrazelluläre Lösung</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td>intrazelluläre/extrazelluläre Lösung</td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>extrazelluläre Lösung</td></tr><tr><td>Monobasisches Natriumphosphat-Monohydrat (NaH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>extrazelluläre Lösung</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO4 7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td>extrazelluläre Lösung</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>extrazelluläre Lösung</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>extrazelluläre Lösung</td></tr><tr><td>EGTA (Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&prime;,N&prime;-tetraessigsäure)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>innere Lösung</td></tr><tr><td>Kaliumhydroxyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767</td><td>innere Lösung</td></tr><tr><td>Methylsulfoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W387509</td><td>intrazelluläre Lösung</td></tr><tr><td>Hepes-Na</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006</td><td>intrazelluläre Lösung</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>intrazelluläre Lösung</td></tr></tbody></table>

perforated-patch-clamp-aufzeichnung der maus riechzellen in intact neuroepithel: funktionelle analyse von neuronen, die eine bestimmte geruchsrezeptor

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analysieren der physiologischen Reaktionen von Riechzellen (OSN), wenn sie mit spezifischen Liganden stimuliert ist kritisch, um die Basis der olfaktorischen getriebenen Verhaltensweisen und deren Modulation zu verstehen. Diese Codierungseigenschaften hängen stark von der anfänglichen Interaktion zwischen Geruchsmolekülen und der Geruchsrezeptor (OR), ausgedrückt in der OSN. Die Identität, Spezifität und Ligandenspektrum der ausdrücklich oder kritisch sind. Die Wahrscheinlichkeit, den Liganden des OR finden Ausdruck in einer nach dem Zufallsprinzip im Epithel gewählt OSN ist sehr gering. Um dieser Herausforderung zu begegnen, wird in diesem Protokoll genetisch tagged Mäusen das fluoreszierende Protein GFP unter der Kontrolle des Promotors des definierten Randlage zum Ausdruck. OSNs sind in einer engen und organisierte Epithel der Nasenhöhle gelegen, mit Nachbarzellen zu beeinflussen ihre Reifung und Funktion. Hier beschreiben wir eine Methode, um eine intakte Riechepithel zu isolieren und durch Patch-Clamp-Aufnahmen erfassen die Eigenschaften OSNs expressing definierten Geruchsrezeptoren. Das Protokoll kann eine OSN Membraneigenschaften zu charakterisieren, während der Einfluss der benachbarten Gewebe. Analyse der Patch-Clamp-Ergebnisse ergibt eine präzise Quantifizierung der Ligand / oder Wechselwirkungen, Übertragungswege und Pharmakologie, OSNs &quot;Kodierungseigenschaften und deren Modulation an der Membranebene.

Das Ergebnis dieses Protokolls ist abhängig von der Qualität der Präparation. Diese Dissektion Schritte müssen kurz (weniger als 10 bis 15 min) und präzise (dh auf Schäden des Epithels zu vermeiden) sein. Die 1 veranschaulicht, wie eine ideale Vorbereitung sieht aus wie bei verschiedenen Vergrößerungsstufen. Bei einer niedrigen Vergrößerung unter Hellfeld die verschiedenen Zelltypen (wie Knöpfe OSNs, Stützzellen) sind zu unterscheiden (Abbildung 1A). Bei der höchsten Vergrößeru...

Die Analyse der physiologischen Eigenschaften von olfaktorischen sensorischen Neuronen stößt immer noch an technische Grenzen. Hier erfassen wir sie durch perforierte Patch-Clamp in einer intakten Präparation des olfaktorischen Epithels bei gengesteuerten Mäusen. Diese Technik ermöglicht die Charakterisierung von Membraneigenschaften und Reaktionen auf spezifische Liganden von Neuronen, die definierte Geruchsrezeptoren exprimieren.

Perforated-Patch-Clamp-Aufzeichnung der Maus Riechzellen in Intact Neuroepithel: Funktionelle Analyse von Neuronen, die eine bestimmte Geruchsrezeptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Änderungen der Membraneigenschaften olfaktorischer Sinnesneuronen als Reaktion auf Duftstoffe zu messen. Dies wird erreicht, indem zuerst das olfaktorische Epithel präpariert und in eine perfundierte Kammer überführt wird. Der zweite Schritt besteht darin, mithilfe des Mikroskops ein OSN von Interesse zu lokalisieren und auszuwählen.Der dendritische Zapfen des ausgewählten olfaktorischen Sinnesneurons (OSN) wird anschließend angezapft und analysiert, während er mit Duftstoffen stimuliert wird. Letztendlich ermöglicht das Perforations-Anzapfen der dendritischen Zapfen von OSNs die Charakterisierung funktioneller Eigenschaften von OSNs auf Membranebene. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Olfaktion zu beantworten, beispielsweise die Ableitung olfaktorischer Sinnesneuronen, die definierte Geruchsstoff-Rezeptoren exprimieren, sowie auch Anzapf-Ableitungen.Geben Sie Informationen über die Membraneigenschaften dieser Neuronen an. Bereiten Sie die stimulierenden Pipetten aus einem Millimeter-Glas vor oder kaufen Sie sie vorgezogen mit Hilfe einer Flamme. Biegen Sie sechs Pipetten etwa einen Zentimeter von der Spitze entfernt in einem Winkel von 45 Grad.Ordnen Sie dann die sechs gebogenen Pipettenspitzen um eine siebte gerade Pipette herum an, verwenden Sie dazu eine Öse als Führung, und wickeln Sie sie mit Schrumpfschlauch ein. Erwärmen Sie den Schrumpfschlauch am anderen Ende der Pipetten. Bringen Sie weiteren Schrumpfschlauch an.Dadurch entsteht eine siebenfach bestückte Reizpipette. Verwenden Sie nun einen Multiblock-Polar, um die siebenfach bestückte Reizpipette zu ziehen. Stärken Sie die Apparatur nach dem Ziehen durch Auftragen etwas weißer Klebstoffes um die Öse.Anschließend das Kleber über Nacht trocknen lassen. Die Nystatin-Lösung muss frisch zubereitet werden, kurz bevor sie verwendet wird. Bei Bedarf drei Milligramm Nystatin abwiegen und zu 50 Mikrolitern DMSO hinzufügen.Danach das Gemisch 20 Sekunden lang vortexen. Anschließend das Gemisch zwei bis drei Minuten lang beschallen, um eine vollständige Verdünnung sicherzustellen. Nun 20 Mikroliter der Mischung zu fünf Millilitern intrazellulärer Stammlösung hinzufügen.Vortexen Sie die Mischung 20 Sekunden lang und führen Sie anschließend zwei bis drei Minuten lang eine Beschallung durch. Kühlen Sie die Arbeitslösung dann auf Eis und schützen Sie sie vor Licht. Auf diese Weise ist die Arbeitslösung einige Stunden lang haltbar.Laden Sie eine Mikrofilmspritze mit der Arbeitslösung auf. Sie ist eine Stunde lang nutzbar, bis sie verwendet wird. Bewahren Sie die beladene Spritze jedoch gekühlt auf Eis auf.Ziehen Sie nun einige Aufnahmeelektroden mit langen Halsabschnitten und zwei Mikrometer großen Öffnungen. Das Ziel besteht darin, nach dem Befüllen mit Nystatin-Lösung einen Widerstand von 15 bis 20 Megaohm zu erreichen. Füllen Sie schließlich die stimulierende Pipette mit dem in Ringer-Lösung verdünnten Duftstoff.Für dieses Protokoll sollten Mäuse im Alter von zwei bis vier Wochen bereitstehen. In dieser Darstellung werden Mäuse verwendet, die or IRES tau GFP exprimieren, indem or IS tau GFP-Mäuse eingesetzt werden. Alle Neuronen, die das Gen or von Interesse exprimieren, werden mit GFP markiert.Diese Methode kann für oder in allen Zonen exprimierte Rezeptoren verwendet werden. Die Dissektionen und Ableitungen sind jedoch einfacher bei Rezeptoren, die in der dorsalen Zone exprimiert sind. Beginnen Sie damit, eine Maus zu betäuben und anschließend zu entköpfen.Das Ergebnis dieses Protokolls hängt von der Qualität der Dissektion ab. Diese Dissektionsschritte müssen so kurz wie möglich und präzise sein. Beginnen Sie die Operation, indem Sie mit einer Präzisionsschere einen Längsschnitt entlang des Dorsals durchführen.Ziehen Sie die Haut auseinander, um sie zu entfernen. Schneiden Sie dann entlang des Unterkiefers und führen Sie einen koronalen Schnitt parallel zu den Zähnen durch. Entfernen Sie auf diese Weise die oberen Schneidezähne.Führen Sie nun einen koronalen Schnitt um den Kopf hinter den Augen durch, entsorgen Sie den hinteren Kopfteil und übertragen Sie den vorderen Teil in eiskaltes Ringer-Lösung. Isolieren Sie nun unter einem Dissektionsmikroskop innerhalb von fünf bis zehn Minuten das Septum. Beginnen Sie mit einem Längsschnitt entlang der ventralen Seite.Schneiden Sie dann die dorsalen Knochen entlang der dorsolateralen Seite der Nasenhöhle longitudinal aus. Entfernen Sie anschließend den größten Teil der Knochen und des Gaumens. Überführen Sie das isolierte Septum zusammen mit dem anhängenden Epithel in einen Behälter mit oxygeniertem Ringer-Lösung bei Raumtemperatur.Bereiten Sie innerhalb von fünf Minuten die endgültigen Vorbereitungen vor der Aufnahme vor. Die Lösung darf nicht zu warm sein, da sonst die Präparation beschädigt erscheint. Um Zugang zum Neuroepithel für die Ableitung zu erhalten.Zuerst wird das Epithel mit einer Pinzette vom darunterliegenden Septum abgezogen. Anschließend schneidet man mit einer mikrochirurgischen Vannaschere das vordere Ende des Septums durch, um das Epithel freizugeben. Entfernen Sie nun vorsichtig das Vomeronasalorgan.Schneiden Sie es an der dorsalen Befestigungsstelle ab. Das isolierte Epithel kann nun mit der Schleimseite nach oben in die Ableitungskammer überführt werden. Sobald es richtig positioniert ist, verwenden Sie eine Harfe, um das Gewebe zu glätten.Überführen Sie dann die Kammer auf ein aufrechtes Mikroskop. Visualisieren Sie das Neuroepithel unter einem 40x-Wasserimmersionsobjektiv, während kontinuierlich frische Ringer-Lösung bei Raumtemperatur zugeführt wird. Um mit der Suche nach den Zellen von Interesse zu beginnen, die in diesem Fall EGFP exprimieren, wird Licht mit einer Wellenlänge von 480 Nanometern verwendet, um Zellen zu identifizieren, die Licht im Bereich von 530 bis 550 Nanometern emittieren.Die gezielten dendritischen Zapfen und Osn sollten bei einer Überprüfung unter Hellfeldmikroskopie mit 80- bis 160-facher Vergrößerung deutlich von den Stützzellen unterscheidbar sein. Füllen Sie nun die Elektrode mit einer S-Statin-Lösung. Schlagen Sie eventuell entstandene Blasen aus und befestigen Sie die Elektrode am Halter.Üben Sie nun etwas positiven Druck aus. Der erwartete Widerstand liegt zwischen 15 und 20 Megaohm. Bringen Sie dann die Elektrode unter Aufrechterhaltung des positiven Drucks an die Zelle heran.Wenn der Widerstand auf etwa 40 Megaohm ansteigt, lassen Sie den Druck ab und geben Sie einen leichten negativen Druck auf. Wenn eine Giga-Seal gebildet wird, sollte das Membranpotenzial bei etwa minus 75 Millivolt gehalten werden. Da die Zelle nun geöffnet ist, fahren Sie mit dem Experiment fort.Wenden Sie Stimulationen und Protokolle an und perfundieren Sie bei Bedarf mit pharmakologischen Behandlungen, um mit einem einzelnen Duftstoff zu testen. Nehmen Sie 200 bis 500 Millisekunden spontaner Aktivität auf. Geben Sie den Duftstoff 500 Millisekunden lang zu und messen Sie anschließend die Antworten bis zu 10 Sekunden lang unter Verwendung des beschriebenen Protokolls.MOR 23, exprimierende Neuronen, die mit EGFP markiert waren, wurden gepatcht und mit unterschiedlichen Konzentrationen von al stimuliert. Im Strom-Klemm-Modus ist Lyal ein Ligand für MOR 23. Alternativ wurden die Zellen im Spannungs-Klemm-Modus stimuliert.Bei Aufzeichnungen im Spannungs-Klemm-Modus wurden verschiedene Eigenschaften überwacht. Um die Antwort klassisch, wie in der Elektrophysiologie üblich, anhand der maximalen Amplitudenantwort zu quantifizieren, wurde die Dosis-Wirkungs-Kurve unter Verwendung der Hill-Gleichung dargestellt. Diese Ergebnisse liefern Informationen über die Kodierungseigenschaften jedes einzelnen OSN, zu denen die Nachweisgrenze, die zeitliche Dynamik, der dynamische Bereich und das Sättigungsniveau gehören.Wenn der Umgang mit der Technik einmal beherrscht ist, kann der Dissektionsvorgang innerhalb von 10 bis 15 Minuten durchgeführt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die funktionellen Eigenschaften von olfaktorischen Sinnesneuronen untersucht, die definierte Duftstoffrezeptoren in Mäusen exprimieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Die electroolfactogram (EOG) Aufnahme ist eine informative, leicht zu führen und zuverlässige Methode zur Beurteilung Riechfunktion auf der Ebene des olfaktorischen Epithels. Dieses Protokoll beschreibt eine Aufnahme-Setup, Maus Gewebe Vorbereitung, Datenerfassung und grundlegende Analyse der Daten.

Analysieren Antworten der Maus Riechzellen Mit der Air-Phase Electroolfactogram Recording

Olfaktorische Rezeptor-Neuronen (ORN) zu konvertieren Geruchs-Signale zunächst in einem Rezeptor Strom, wiederum löst Aktionspotentiale, die bis zur zweiten Ordnung Neuronen im Riechkolben gefördert werden. Hier beschreiben wir die Saugpipette Technik gleichzeitig aufzeichnen Duftstoff-induzierte Rezeptor-Strom-und Aktionspotentiale aus Maus ORN.

Odorant-induzierten Reaktionen aus olfaktorischen Rezeptor-Neuronen mit der Saugpipette Technik aufgenommen

Dieses Video zeigt die elektrophysiologische Aufzeichnung von olfaktorischen sensorischen Neuronen (OSNs) bei Mäusen mit einer perforierten Patch-Clamp-Technik. Das olfaktorische Epithel, das OSNs mit Fluorophor-markierten Geruchsrezeptoren enthält, wird von einer Maus isoliert und in einer Aufzeichnungskammer gesichert. Eine Aufzeichnungspipette wird an den dendritischen Knopf eines OSN geklemmt, und Nystatin in der Pipette perforiert die Membran, um eine elektrische Verbindung mit der Zelle...

Perforierte Patch-Clamp-Aufzeichnung von olfaktorischen sensorischen Neuronen bei Mäusen

Das Protokollvideo beschreibt die Etablierung einer Ganzzell-Patch-Klemme für die elektrophysiologische Aufzeichnung von den sensorischen Neuronen des vomeronasalen Organs (VNO) in Mäusen. Ein koronaler VNO-Schnitt mit fluoreszenzmarkierten sensorischen Neuronen wird in einem Aufnahmeaufbau platziert. Ein markiertes Neuron wird mit einer Aufzeichnungspipette in einer Ganzzellkonfiguration gepflastert, um die elektrophysiologische Aufzeichnung als Reaktion auf chemische Reize zu ermöglichen.

Etablierung einer Ganzzell-Patch-Klemme für die elektrophysiologische Aufzeichnung von vomeronasalen sensorischen Neuronen

Wir zeigen Varianten der extrazellulären Multi-Unit-Aufnahmetechnik, um Geruch hervorgerufenen Reaktionen in den ersten drei Stufen der wirbellosen olfaktorischen charakterisieren. Diese Techniken können leicht an ensemble Aktivität in anderen neuronalen Systemen sowie zu untersuchen.

Multi-unit Recording Methoden zur neuronalen Aktivität in der Locust Charakterisieren (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktorische Circuits

Eine effektive Methode, um Manuelle Zerlege Intact Maus Nasengewebe mit erhaltener Anatomische Organisation vorbereiten

Zilien olfaktorischer sensorischer Neuronen enthalten Proteine der Signaltransduktionskaskade, aber eine detaillierte räumliche Analyse ihrer Verteilung ist in Kryosektionen schwierig. Wir beschreiben hier einen optimierten Ansatz für die Markierung von  Ganzbetten und die Visualisierung von ziliären Proteinen.

Ganze Berge Kennzeichnung von Cilia im Hauptriechsystem der Mäuse

Hier beschreiben wir einen physiologischen Ansatz, der die Identifizierung und eingehende Analyse einer definierten Population von sensorischen Neuronen in akuten koronalen Gewebeschnitten des vomeronasalen Organs der Maus unter Verwendung von Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen ermöglicht.

In eingehenden Physiologische Analyse definierter Zellpopulationen bei der akuten Gewebeschnitten der Maus Vomeronasalorgans

Charakterisierung der Funktion der Geruchsstoff Rezeptoren dient einen unverzichtbaren Bestandteil in der Deorphanization-Prozess. Wir beschreiben eine Methode zur Messung der Aktivierung des Duftstoff-Rezeptoren in Echtzeit über einen cAMP-Assay.

Leben-Zelle Messung der Geruchsstoff Rezeptor Aktivierung mit einem Echtzeit-cAMP-Assay

Olfaktorische sensorische Neuronen exprimieren eine Vielzahl von Axon-sortierenden Molekülen, um eine korrekte neuronale Schaltung zu etablieren. Dieses Protokoll beschreibt eine immunhistochemische Färbemethode, um kombinatorische Ausdrücke von Axon-sortierenden Molekülen an den Axon-Termini von olfaktorischen sensorischen Neuronen zu visualisieren.

Quadruple Immunfärbung der olfaktorischen Glühbirne zur Visualisierung von olfaktorischen sensorischen Axon Molecular Identity Codes

Erfahren Sie die perforated-patch-clamp-Technik zur Aufzeichnung von Riechzellen in intaktem Neuroepithel bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht die funktionelle Analyse spezifischer Geruchsrezeptoren und liefert wertvolle Einblicke in die Membraneigenschaften olfaktorischer Neuronen.

Perforated-Patch-Clamp-Aufzeichnung der Maus Riechzellen in Intact Neuroepithel: Funktionelle Analyse von Neuronen, die eine bestimmte Geruchsrezeptor (Video) | JoVE Journal

Perforated-Patch-Clamp-Aufzeichnung der Maus Riechzellen in Intact Neuroepithel: Funktionelle Analyse von Neuronen, die eine bestimmte Geruchsrezeptor

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