Anwenden Stereotaktische Injektionstechnik zu genetischen Auswirkungen auf die Tier Behaviors Studie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu beurteilen, wie sich die Modulation der Expression eines Gens in einem Zielbereich auf das Verhalten von Tieren auswirkt. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Lentivirus erzeugt wird, um die Expression des Zielgens zu modulieren. Der zweite Schritt besteht darin, das Lentivirus durch stereotaktische Injektion in einen bestimmten Gehirnbereich des ER-Nagetiers zu injizieren.

Folgende Verhaltensweisen wie Angstzustände und Depressionen können mit Hilfe etablierter Verhaltensparadigmen quantitativ gemessen werden. Der letzte Schritt besteht darin, eine Histologie durchzuführen, um die richtige Injektionsstelle zu bestätigen. Letztendlich kann die stereotaktische Injektion in Kombination mit der Verhaltensbewertung zeigen, wie ein bestimmtes Gen in einem Zielbereich das Verhalten von Mäusen beeinflussen kann.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass Wissenschaftler die Expression eines einzelnen Gens in einem kleinen Zielbereich verändern und dann Verhaltensänderungen bei Mäusen bewerten können. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, setzen Sie eine betäubte Maus in das stereotaktische Gerät ein, befestigen Sie die Frontzähne an der Frontzahnklemme und sichern Sie den Kiefer. Führen Sie dann die Ohrbügel in die Gehörgänge ein, um den Kopf vollständig zu stabilisieren.

Legen Sie anschließend ein Heizkissen unter die Maus, um die Körpertemperatur zu regulieren. Legen Sie während des gesamten Eingriffs künstliche Tränen auf die Augen des Nagetiers, um ein Austrocknen zu verhindern. Reinigen Sie danach das Operationsgebiet gründlich, indem Sie zunächst 10%iges Povidon-Jod mit einem Wattestäbchen in kreisenden Bewegungen verreiben.

Reiben Sie anschließend auf die gleiche Weise 70%igen Ethylalkohol auf die Operationsstelle. Wiederholen Sie diesen Reinigungsvorgang noch zwei weitere Male. Sobald die Maus vorbereitet ist, öffnen Sie den sterilen Gerätebeutel.

Wechseln Sie die Handschuhe, bevor Sie die Instrumente berühren. Nehmen Sie dann das sterile Tuch heraus und legen Sie die Instrumente auf das Tuch. Fassen Sie nun die Haut der Maus vorsichtig mit der Blutendzange und machen Sie mit einem Skalpell einen Schnitt.

Beginnen Sie den Schnitt etwa 1,5 Zentimeter über den Ohren und erstrecken Sie sich bis etwa 0,5 Zentimeter unter den Ohren, um das BGMA freizulegen. Sobald das BGMA sichtbar ist, verwenden Sie ein steriles Wattestäbchen, um vorsichtig das Blut zu entfernen, das die Oberfläche des Schädels bedeckt. Schiebe dann mit zwei Wattespitzen die Haut zu den Seiten des Kopfes.

Füllen Sie anschließend in den Abzug eine Spritze mit dem zu injizierenden Virus. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen im Inneren eingeschlossen sind. Legen Sie dann eine Spritze in das stereotaktische Gerät und stellen Sie sicher, dass sie vollständig gesichert ist.

Senken Sie danach die Spritze langsam ab, bis sie sich direkt über der Schädeloberfläche befindet. Bewegen Sie dann die Spitze der sterilen Spritzennadel bis zum Schnittpunkt von B bgma und der interländlichen Linie. Legen Sie diesen Punkt auf Null fest.

Legen Sie anschließend die Koordinaten des Interessenbereichs fest. Bewegen Sie die Nadel der Spritze an die Zielstelle, die gebohrt werden soll. Platzieren Sie dann den Bohrer direkt über der Zielstelle in einem 45-Grad-Winkel zum Schädel und beginnen Sie mit dem Bohren.

Achte darauf, dass du nicht in das Gehirn bohrst, um kortikale Schäden zu vermeiden. Reinigen Sie danach das Loch mit einem sterilen Wattestäbchen. Senken Sie die Spritze so ab, dass die Spitze direkt auf der Oberfläche des Gehirns sitzt.

Stellen Sie die DV-Koordinate auf Null und senken Sie die Spritze dann auf die gewünschte Tiefe ab. Beginnen Sie nun mit der Injektion mit einer Geschwindigkeit von 0,2 Mikrolitern pro Minute. Warten Sie nach Beendigung der Injektion etwa zwei Minuten, um sicherzustellen, dass alle Virusreste absorbiert wurden.

Heben Sie dann langsam eine Spritze an. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um Flüssigkeit von der Injektionsstelle zu entfernen. Nahen Sie anschließend die Haut und entfernen Sie das Tier aus dem stereotaktischen System.

Lassen Sie die Maus bis zum Aufwachen auf dem Heizkissen und verabreichen Sie bei Bedarf ein zusätzliches Analgetikum. Besorge dir bei diesem Verfahren eine quadratische Arena aus Kunststoff. Reinigen Sie die Arena vor dem Experiment mit 70%igem Ethylalkohol.

Stellen Sie dann die Arena auf den Boden und stellen Sie sicher, dass die Beleuchtung so eingestellt ist, dass Schatten und Blendung minimiert werden. Passen Sie als Nächstes die Erkennungseinstellungen so an, dass die Maus auf dem Bildschirm sichtbar ist. Schalten Sie danach die Kamera ein, um die Verhaltensaufgabe aufzuzeichnen, und platzieren Sie die Maus in Richtung der mittleren Vorderseite der Arena, sodass die Maus zur Wand zeigt.

Stelle den Timer auf fünf Minuten und verlasse die Arena oder verlasse den Raum. Setzen Sie die Maus nach fünf Minuten wieder in den Käfig um. Verwenden Sie 70%igen Ethylalkohol, um das Feld gründlich zu reinigen, bevor Sie zum nächsten Tier übergehen.

Füllen Sie nun einen zwei Liter langen durchsichtigen Eimer mit 22 Grad heißem Wasser. Stellen Sie den Eimer auf den Boden und stellen Sie sicher, dass die Beleuchtung so eingestellt ist, dass Schatten und Blendung minimiert werden. Wenn Sie eine Tracking-Software verwenden, positionieren Sie die Kamera direkt über der Schaufel.

Passen Sie die Softwareeinstellungen so an, dass die Maus auf dem Bildschirm gut sichtbar ist. Schalten Sie dann die Kamera ein, um die Verhaltensaufgabe aufzuzeichnen. Platzieren Sie die Maus vorsichtig in der Mitte des Wassereimers, so dass ihre Vorderfüße stehen.

Berühren Sie zuerst das Wasser und verhindern Sie, dass der Kopf untertaucht. Stellen Sie danach den Timer auf sechs Minuten, bevor Sie den Verhaltensbereich verlassen. Nehmen Sie die Maus nach sechs Minuten aus dem Eimer, wischen Sie überschüssiges Wasser ab, bevor Sie sie wieder in den Käfig legen.

Hier ist ein repräsentativer Hirnschnitt, der die erfolgreiche Injektion von Viren in den Gyrus dentatus veranschaulicht. Diese Abbildung zeigt die Zeit, die die Kontroll- und Versuchsmäuse im Zentrum eines neuen offenen Feldes verbrachten. Die Versuchsmäuse verbrachten signifikant weniger Zeit in der Mitte der Arena, was auf einen Phänotyp von Angst hinweist, und diese Abbildung zeigt die Zeit, die die Kontroll- und Versuchsmäuse im erzwungenen Schwimmtest unbeweglich sind.

Die Versuchsmäuse unterschieden sich nicht signifikant von den Kontrollen, was die Zeit anging, die sie immobil verbrachten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten die Zuschauer eine gute Vorstellung davon haben, wie stereotaktische Injektionen verwendet werden können, um das Verhalten von Nagetieren zu beurteilen.