Unter Verwendung der Antigen Capsid-Incorporation Strategie für die Förderung der Adenovirus-Serotyp 5-Vectored Vaccine Approaches

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Antigen-Caps-Inkorporationsstrategie für die Entwicklung von Adenovirus-Serotyp-Fünf-Vektor-Impfstoffansätzen unter Verwendung eines rekombinanten divalenten adenoviralen Vektors als Prinzipbeweis zu nutzen. Unter Verwendung der Antigen-Kapsid-Inkorporationsstrategie werden mehrere Klonierungsschritte verwendet, um das modifizierte Plasmid zu konstruieren, A D fünf R ein K-W-S-H-V-R fünf Hiss. Als nächstes der zweiwertige Adenylvirusvektor. R eins K war HVR fünf.

Hiss wird gerettet, vermehrt und gereinigt. Anschließend werden die viralen Titer und die antigene Darstellung der eingebauten Antigene auf dem viralen Kapsid charakterisiert. Schließlich wird das Potenzial des divalenten Aden-Virusvektors, die Neutralisation durch ein D mit fünf positiven Seren zu umgehen, unter Verwendung der Antigen-Kapsid-Inkorporationsstrategie bewertet.

Um das modifizierte Plasmid zu konstruieren, werden mehrere Klonierungsschritte verwendet: A, D, fünf R, eins K-W-A-S-H-V-R, fünf Zischen. Heute werden wir die Strategie zur Inkorporation von Antigen-Kapsids demonstrieren. Diese Strategie ist im Vergleich zu anderen Strategien, wie z.B. der Transgen-Expressionsmethode, vorteilhaft, da sie nicht nur das Antigen von Interesse auf dem Adenovirus in Gefangenschaft als Protein anzeigt, sondern auch eine robuste humorale Reaktion gegen dieses Antigen ermöglicht.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zur Erzeugung des Kappenmodifizierenden Adenovirus schwer zu erlernen sind, da viele Variablen zur Entwicklung der empfohlenen viralen Vektoren beitragen, wie z. B. die Auswahl der Restriktionsenzyme, die Linse der interessierenden Energie in anderen Demonstration der Verfahren. Heute werden meine beiden Postdocs, Dr. Lin Lin Gu und Dr. Nitra Farrow, anwesend sein. Auch Alexandre Kren, der wissenschaftliche Mitarbeiter im Labor, um das Shuttle-Plasmid zu konstruieren, addiert man jeweils sechs Einheiten eines GE und eines CCC von einem auf sechs Mikrogramm des HVR ein KWA-Fragment.

Inkubieren Sie die Verdauungsreaktion drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Lösen Sie das Verdauungsfragment in einem 2%igen Agros-Gel durch Elektrophorese auf und verwenden Sie ein DNA-Gel-Extraktionskit gemäß dem Protokoll des Herstellers, um das Fragment zu reinigen. Als nächstes ligiert man 12 Nanogramm des gereinigten Fragments in die a G und ACC one Stellen der 100 Nanogramm des zuvor konstruierten Shuttle-Plasmids.

HVR fünf Zisch, sechs pH, fünf s und ein Reaktionsvolumen von 10 Mikrolitern bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Geben Sie dann einen Mikroliter der Ligationsreaktion zu 50 Mikrolitern elektrokompetenter DH-Fünf-Alpha-Zellen, einer Elektro-Acht, bevor Sie 950 Mikroliter SOC-Medium hinzufügen. Inkubieren Sie die transformierten Zellen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 200 U/min, bevor Sie 100 bis 200 Mikroliter der Kultur auf eine LB CANY-Platte verteilen.

Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Verwenden Sie jeweils sechs Einheiten Echo R one und PME eins, um drei Stunden lang sechs Mikrogramm des gereinigten Shuttle-Plasmids bei 37 Grad Celsius zu verdauen. Nach der Reinigung des Fragments, das homologe Rekombinationsarme enthält, und das duale modifizierte Exon-Fünf-Gen wird SUA eins zur Linearisierung des Rückgratplasmids verwendet, PAD fünf, delta H fünf zur Durchführung einer homologen Rekombination.

Verwenden Sie die Elektroporation, um jeweils 100 Nanogramm des gereinigten Shuttle-Fragments und des Rückgratplasmids in 50 Mikroliter elektrokompetenter BJ 5 180 3-Zellen umzuwandeln. Wie bereits in diesem Video gezeigt, pflücken Sie am nächsten Tag etwa 10 Kolonien in drei Milliliter flüssiges LB, das Dosenmycin enthält, und wachsen Sie über Nacht, bevor Sie gemäß dem Textprotokoll screenen. Wandeln Sie dann 100 Nanogramm gereinigtes Plasmid in DH-Fünf-Alpha-Zellen um, wie zuvor gezeigt, um den viralen Vektor zu retten.

Beginnen Sie mit PAC one, um 15 Mikroliter des Vektors in einem Volumen von 100 Mikrolitern zu linearisieren. Nach der Verdauung drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Zur Extraktion des linearisierten Plasmids unter einem Abzug.

Geben Sie ein gleiches Volumen an Phenolchloroform, Isoamylalkohol bei 10.000 g für eine Minute in die Reaktionszentrifuge und sammeln Sie den Überstand, bevor Sie die Extraktion wiederholen und auf das extrahierte Volumen schleudern. Fügen Sie 300 Mikroliter 100%iges Ethanol und 10 Mikroliter Acetatspin bei 10.000 g für 10 Minuten hinzu. Nach dem Verwerfen des Überstands werden 700 Mikroliter 70%iges Ethanol hinzugefügt, bevor Sie erneut schleudern.

Sobald das Pellet resuspendiert und die DNA quantifiziert wurde, transfizieren Sie drei Mikrogramm des linearisierten Plasmids zusammen mit einem handelsüblichen liposomalen Transfektionsreagenz in einen zuvor vorbereiteten T25-Kolben mit 80 % konfluenten HEK 2 93-Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nach sechsstündiger Inkubation wird das Transfektionsmedium durch vollständiges Medium ersetzt, bevor der Kolben wieder in den Inkubator gestellt wird. Wenn Plaques unter einer sterilen Haube eine vollständige zytopathische Wirkung oder CPE entwickeln, kratzen Sie die verbleibenden Zellen vom Kolben ab und zentrifugieren Sie die Kultur 10 Minuten lang bei 300 g und vier Grad Celsius.

Verwenden Sie dann einen Milliliter Medium mit 2 % FBS, um das Zellpellet zu resuspendieren. Brechen Sie anschließend die Zellen, indem Sie vier Runden Gefriertauen durchführen, und zentrifugieren Sie das Lysat dann 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie den S-Überstand, der das gerettete Virus enthält, um den viralen Vektor in einer groß angelegten Kultur zu vermehren.

Ein Drittel des gesamten viralen Lysats aus dem T-25-Kolben in einen T-75-Kolben mit HEK-2-93-Zellen. Nachdem Sie das vollständige CPE entwickelt und das Supinat wie zuvor gezeigt geerntet haben, vermehren Sie die Hälfte des gesamten Virus in einem oder mehreren. T 1 75 Kolben mit HK 2 93 Zellen vermehren dann das aus den T 1 75 Kolben isolierte Virus in einem Dutzend oder mehr.

T 1 75 Kolben mit Zellen nach Herstellung einer Spitze von 33 g pro Milliliter und 1,45 g pro Milliliter. Cäsiumchlorid-Lösungen geben vier Milliliter, 1,33 Gramm pro Milliliter, Cäsiumchlorid in ein Ultrazentrifugenröhrchen und fügen vier Milliliter, 1,45 Gramm pro Milliliter, Cäsiumchlorid gegen den Boden desselben Röhrchens hinzu. Geben Sie vier Milliliter virales Lysatsupinat an die Oberseite desselben Röhrchens und zentrifugieren Sie das Röhrchen dann drei Stunden lang bei 110.000 g und vier Grad Celsius.

Dadurch wird die ausgereifte untere Virenbande von der defekten höheren Virusbande unter der Haube getrennt. Verwenden Sie eine 33-Gauge-Nadel, die an einer Drei-Milliliter-Spritze befestigt ist, um das untere Band zu sammeln. Dann verwenden Sie fünf Hippies, um die Lösung auf vier Milliliter zu bringen.

Nachdem Sie zwei weitere Cäsiumchlorid-Gradienten vorbereitet haben, laden Sie das verdünnte Virus darauf und zentrifugieren Sie die Gradienten über Nacht bei 110.000 g und vier Grad Celsius. Unter der Haube. Sammeln Sie die virale Bande wie gerade gezeigt.

Verwenden Sie dann eine 33-Gauge-Nadel und eine Drei-Milliliter-Spritze, um die Viruslösung in eine Dialysekassette zu injizieren. Legen Sie eine Kassette in 700 Milliliter eines x Dialysepuffers, der gemäß dem Textprotokoll vorbereitet wurde, und tauschen Sie den Puffer viermal alle drei Stunden aus. Dann mit Nadel und Spritze.

Sammeln Sie die Viruslösung aus der Kassette, um den physikalischen Virustiter zu bestimmen. Verwenden Sie einen Viruslysepuffer, um sowohl das Virus als auch den Dialysepuffer, der als Hintergrundkontrolle verwendet wird, bei eins bis 10 und eins bis 20 zu verdünnen, und inkubieren Sie alle Röhrchen 10 Minuten lang bei 56 Grad Celsius. Schalten Sie ein Biophotometer ein und stellen Sie den Absorptionsmodus auf eine optische Dichte von 260 Nanometern ein.

Verwenden Sie den Dialysepuffer auf eins bis 10 verdünnt, um das Hintergrundsignal auszugleichen, indem Sie auf die leere Schaltfläche klicken. Geben Sie 10 plus 90 auf dem Bildschirm des Biophotometers ein. Ersetzen Sie das Röhrchen durch ein Röhrchen mit dem auf eins bis 10 verdünnten Virus und lesen Sie das Signal des auf eins bis 10 verdünnten Virus ab.

Um die Verdünnung von eins bis 20 zu messen, verwenden Sie den auf eins bis 20 verdünnten Dialysepuffer, um die Hintergrundtypisierung von fünf plus 95 auf dem Bildschirm auszugleichen, bevor Sie das Pufferröhrchen durch ein verdünntes Virusröhrchen von eins bis 20 ersetzen und das Signal ablesen. Multiplizieren Sie die beiden Virusauslesezahlen mit 1,1 mal 10 hoch 12 und berechnen Sie den durchschnittlichen Titer mit Einheiten von VP pro Milliliter basierend auf den beiden Einzeltitern aus den beiden Dilu. Bewerten Sie das Virus an Mäusen gemäß dem Textprotokoll, um zu zeigen, ob das gerettete Virus das antigene HIV-Antigen und den Hist-Tag auf der Oberfläche des viralen Kapsids aufweist.

Hauptprotein Heon fünf. Eliza wurde mit den beiden humanen monoklonalen F-Fünf-Antikörpern und dem monoklonalen Anti-Hiss-Tag-Antikörper der Maus durchgeführt, wie hier gezeigt, sowohl mit den beiden menschlichen F-Fünf-Antikörpern als auch mit dem Anti-Hiss-Antikörper der Maus, die an das divalente Add-Fünf-Viruspartikel gebunden waren, während keine Bindung an die Negativkontrolle bestand. Eine westliche Blutanalyse mit fünf Vektoren wurde verwendet, um die Etiza-Daten zu bestätigen, da sowohl der Mensch mit zwei F-Fünf-Antikörpern als auch der Maus-Anti-Hiss-Antikörper nur spezifische Banden um 117 Kilodalton aufwiesen.

Im DIVALENT fügen Sie fünf Viren hinzu, was der Größe von Heon fünf Protein entspricht. Um das Potenzial des konstruierten Add-Five-Virus zur Umgehung der Neutralisation durch Add-Five-Positive zu bewerten, wurde ein Neutralisationsassay durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass die relativen lumineszierenden Einheiten oder rlu 12-mal höher waren, wenn der Kontrollvektor ohne zusätzliches Fünf-Serum behandelt wurde, als wenn er mit Serum behandelt wurde, was darauf hindeutet, dass das Virus neutralisiert wurde.

Im Gegensatz dazu gab es kaum einen Unterschied in der R-Verwendung für das konstruierte divalente AD-Fünf-Virus zwischen behandelten und unbehandelten Proben, was darauf hindeutet, dass das konstruierte Virus der Neutralisation entging. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein besseres Verständnis für den Ansatz der Antigen-Kapsid-Inkorporation für die Entwicklung von Add-Five-Vektor-Impfstoffen haben. Derzeit verwenden wir diese Strategie in Kombination mit seltenen Serotypvektoren.

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