Unter Verwendung der Antigen Capsid-Incorporation Strategie für die Förderung der Adenovirus-Serotyp 5-Vectored Vaccine Approaches

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Strategie der Antigenkapsid-Inkorporation für die Entwicklung von Impfstoffansätzen basierend auf einem Adenovirus-Serotyp-fünf-Vektor zu nutzen, wobei ein rekombinanter divalenter Adenovirusvektor als Beweis des Prinzips dient. Mithilfe der Antigenkapsid-Inkorporationsstrategie werden mehrere Klonierungsschritte durchgeführt, um das modifizierte Plasmid A D fünf R eins K-W-S-H-V-R fünf hiss zu konstruieren. Anschließend der divalente Adenovirusvektor. R eins K war HVR fünf.

Hiss wird gewonnen, vermehrt und gereinigt. Anschließend werden die viralen Titer und die antigenische Darstellung der eingebauten Antigene auf der viralen Kapsidhülle charakterisiert. Schließlich wird das Potenzial des divalenten Aden-Virusvektors, einer Neutralisierung durch D5-positive Sera zu entgehen, mithilfe der Strategie der Antigen-Kapsid-Einlagerung evaluiert.

Mehrere Klonierungsschritte werden zur Konstruktion des modifizierten Plasmids, A D five R one K-W-A-S-H-V-R five hiss, verwendet. Heute werden wir die Strategie der Antigen-Kapsid-Inkorporation demonstrieren. Diese Strategie ist im Vergleich zu anderen Strategien, wie beispielsweise der Transgen-Expressionsmethode, vorteilhaft, da sie nicht nur das Antigen der Wahl als Protein auf dem Adenovirus-Kapsid darstellt, sondern auch eine starke humoralen Immunantwort gegen dieses Antigen ermöglicht.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte zur Herstellung des kap-modifizierenden Adenovirus schwer zu erlernen sind, da viele Variablen zur Entwicklung der empfohlenen viralen Vektoren beitragen, wie beispielsweise die Auswahl der Restriktionsenzyme, das Interesse an der Energie anderer Faktoren bei der Demonstration der Verfahren. Heute werden meine beiden Postdocs, Dr. Lin Lin Gu und Dr. Nitra Farrow, sowie Alexandre Kren, der wissenschaftliche Mitarbeiter im Labor, dabei sein. Um das Shuttle-Plasmid herzustellen, geben Sie jeweils sechs Einheiten von GE eins und CCC eins zu sechs Mikrogramm des HVR eins KWA-Fragments hinzu.

Die Verdauungsreaktion drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Das Verdauungsfragment durch Elektrophorese in einem 2%igen Agarosegel auftrennen und mithilfe eines DNA-Gel-Extraktionskits gemäß Herstellervorschrift reinigen. Anschließend 12 Nanogramm des gereinigten Fragments in die G1- und ACC1-Stellen von 100 Nanogramm des zuvor konstruierten Shuttle-Plasmids ligieren.

HVR fünf hiss sechs pH fünf s und ein 10-Mikroliter-Reaktionsvolumen bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Anschließend ein Mikroliter der Ligationsreaktion zu 50 Mikrolitern elektrokompententen DH5α-Zellen hinzufügen, elektroporieren und danach 950 Mikroliter SOC-Medium zugeben. Die transformierten Zellen bei 37 Grad Celsius und 200 U/min eine Stunde lang inkubieren, bevor 100 bis 200 Mikroliter der Kultur auf eine LB-CAN-Platte aufgebracht werden.

Inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie sechs Einheiten jeweils von Echo R ein und PME ein, um sechs Mikrogramm des gereinigten Shuttle-Plasmids bei 37 Grad Celsius drei Stunden lang zu verdauen. Nach der Reinigung des Fragments, das homologe Rekombinationsarme und das doppelt modifizierte Exon-fünf-Gen enthält, verwenden Sie SUA ein, um das Rückgratplasmid PAD fünf, delta H fünf, zu linearisieren, um die homologe Rekombination durchzuführen.

Verwenden Sie die Elektroporation, um jeweils 100 Nanogramm des gereinigten Shuttle-Fragments und des Backbone-Plasmids in 50 Mikroliter elektrokompetente BJ5183-Zellen zu ko-transformieren. Wie zuvor in diesem Video gezeigt, entnehmen Sie am folgenden Tag etwa 10 Kolonien und geben sie in drei Milliliter flüssiges LB-Medium mit Kanamycin, das über Nacht inkubiert wird, bevor die Kolonien gemäß dem Textprotokoll analysiert werden. Anschließend transformieren Sie 100 Nanogramm des gereinigten Plasmids in DH5α-Zellen, wie zuvor demonstriert, um den adenoviralen Vektor zu retten.

Beginnen Sie damit, mithilfe von PAC I 15 Mikroliter des Vektors in einem Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern zu linearisieren. Inkubieren Sie nach der Verdauung drei Stunden bei 37 Grad Celsius. Um das linearisierte Plasmid unter einem Abzug zu extrahieren.

Geben Sie ein gleiches Volumen Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol zu der Reaktion hinzu, zentrifugieren Sie bei 10.000 G für eine Minute und sammeln Sie den Überstand, bevor Sie die Extraktion wiederholen und erneut zentrifugieren, um das extrahierte Volumen zu erhalten. Fügen Sie 300 Mikroliter 100 % Ethanol und 10 Mikroliter Acetat hinzu und zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 10.000 G. Danach, nach dem Verwerfen des Überstandes, geben Sie 700 Mikroliter 70 % Ethanol hinzu und zentrifugieren erneut.

Nachdem das Pellet resuspendiert und die DNA quantifiziert wurde, transfizieren Sie drei Mikrogramm des linearisierten Plasmids zusammen mit einem kommerziellen liposomalen Transfektionsreagenz in eine zuvor vorbereitete T-25-Flasche mit 80 % konfluenten HEK-293-Zellen gemäß den Herstelleranweisungen. Nach einer sechsstündigen Inkubation ersetzen Sie das Transfektionsmedium durch komplettes Medium, bevor Sie die Flasche in den Inkubator zurückbringen. Wenn sich unter sterilen Bedingungen Plaques mit vollem zytopathischem Effekt (CPE) entwickelt haben, lösen Sie die verbleibenden Zellen von der Flasche ab und zentrifugieren die Kultur bei 300 ×g und vier Grad Celsius für 10 Minuten.

Verwenden Sie anschließend ein Milliliter Medium mit 2 % FBS, um das Zellpellet erneut in Suspension zu bringen. Brechen Sie danach die Zellen durch vier Zyklen von Einfrieren und Auftauen auf und zentrifugieren Sie das Lysat bei vier Grad Celsius zehn Minuten lang. Sammeln Sie das S-Supernatant, das das gewonnene Virus enthält, um den viralen Vektor in einer großskaligen Kultur zu vermehren.

Ein Drittel bis die gesamte Viruslysat aus dem T25-Fläschchen in ein T75-Fläschchen mit HEK293-Zellen geben. Nach vollständiger Entwicklung des zytopathischen Effekts (CPE) und Gewinnung des Überstandes wie zuvor beschrieben, die Hälfte des gesamten Virus in einem oder mehreren T175-Fläschchen mit HEK293-Zellen vermehren, anschließend das aus den T175-Fläschchen isolierte Virus in einem Dutzend oder mehr T175-Fläschchen vermehren.

T 1 75-Flaschen mit Zellen nach der Herstellung von 1,33 Gramm pro Milliliter und 1,45 Gramm pro Milliliter. Cäsiumchloridlösungen: Geben Sie vier Milliliter 1,33 Gramm pro Milliliter Cäsiumchlorid in eine Ultrazentrifugen-Röhrchen und fügen Sie vier Milliliter 1,45 Gramm pro Milliliter Cäsiumchlorid an den Boden desselben Röhrchens hinzu. Geben Sie vier Milliliter virales Lysat-Supernatant auf die Oberseite desselben Röhrchens, anschließend zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 110.000 × g und vier Grad Celsius für drei Stunden.

Dadurch wird im Abzug die reife untere Virusbande von der defekten oberen Virusbande getrennt. Sammeln Sie die untere Bande mit einer Nadel der Größe 33, die an eine Dreimilliliter-Spritze angeschlossen ist. Anschließend verwenden Sie fünf Hippies, um die Lösung auf vier Milliliter aufzufüllen.

Danach, nachdem zwei weitere Cäsiumchlorid-Gradienten vorbereitet wurden, das verdünnte Virus darauf auftragen und die Gradienten über Nacht bei 110.000 G und vier Grad Celsius unter dem Abzug zentrifugieren. Sammeln Sie die Virusbande, wie gerade gezeigt.

Verwenden Sie dann eine 33-Gauge-Nadel und eine 3-Milliliter-Spritze, um die Viruslösung in eine Dialyseskassette zu injizieren. Legen Sie eine Kassette in 700 Milliliter 1x Dialysepuffer, der gemäß dem Textprotokoll hergestellt wurde, und wechseln Sie den Puffer alle drei Stunden insgesamt viermal. Verwenden Sie anschließend eine Nadel und eine Spritze.

Sammeln Sie die virale Lösung aus der Kassette, um die physikalische Virus-Titer zu bestimmen. Verdünnen Sie mit Virus-Lysepuffer sowohl das Virus als auch den Dialysepuffer, der als Hintergrundkontrolle dient, im Verhältnis 1 zu 10 und 1 zu 20, und inkubieren Sie alle Röhrchen bei 56 Grad Celsius für 10 Minuten. Schalten Sie ein Biofotometer ein und stellen Sie den Absorptionsmodus auf eine optische Dichte von 260 Nanometern ein.

Verwenden Sie den Dialysepuffer, der im Verhältnis 1 zu 10 verdünnt wurde, um das Hintergrundsignal durch Anklicken der Taste „Blank“ auszugleichen. Geben Sie auf dem Biofotometer-Bildschirm 10 plus 90 ein. Ersetzen Sie das Gefäß durch ein Gefäß mit dem im Verhältnis 1 zu 10 verdünnten Virus und lesen Sie das Signal des im Verhältnis 1 zu 10 verdünnten Virus ab.

Um die Verdünnung 1:20 zu messen, verwenden Sie den Dialysepuffer, der im Verhältnis 1:20 verdünnt wurde, um die Hintergrundsignalisierung mit fünf plus 95 auf dem Bildschirm auszugleichen, bevor Sie das Pufferröhrchen durch ein Röhrchen mit 1:20 verdünntem Virus ersetzen und das Signal ablesen. Multiplizieren Sie die beiden Virusmesswerte mit 1,1 × 10¹² und berechnen Sie die durchschnittliche Titerkonzentration in Einheiten von VP pro Milliliter basierend auf den beiden individuellen Titern aus den beiden Verdünnungen. Bewerten Sie das Virus in Mäusen gemäß dem schriftlichen Protokoll, um zu demonstrieren, ob das gewonnene Virus das antigene HIV-Antigen und das His-Tag auf der Oberfläche der viralen Kapsidhülle exprimiert.

Wichtiger Protein-Heon-fünf-ELISA wurde mit dem humanen zwei-F-fünf-Monoklonalen Antikörper bzw. mit dem maus-spezifischen Anti-His-Markierung-Monoklonalen Antikörper durchgeführt, wie hier gezeigt. Sowohl der humane zwei-F-fünf-Antikörper als auch der maus-spezifische Anti-His-Antikörper banden an das divivalente Ad-fünf-Viruspartikel, wohingegen keine Bindung an die negative Kontrolle erfolgte. Eine A-fünf-Vektor-Western-Blot-Analyse wurde zur Bestätigung der ELISA-Daten verwendet, da sowohl der humane zwei-F-fünf-Antikörper als auch der maus-spezifische Anti-His-Antikörper spezifische Banden bei etwa 117 Kilodalton nachwiesen.

Im DIVALENT-Add-Fünf-Virus, das der Größe des Heon-Fünf-Proteins entspricht. Um das Potenzial des konstruierten Add-Fünf-Virus zu untersuchen, einer Neutralisation durch Add-Fünf-positives Serum zu entgehen, wurde ein Neutralisationstest durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass die relativen Lumineszenzeinheiten (rlu) 12-mal höher waren, wenn der Kontroll-Add-Fünf-Vektor ohne Add-Fünf-positives Serum behandelt wurde, im Vergleich zur Behandlung mit Serum, was darauf hindeutet, dass das Virus neutralisiert wurde.

Im Gegensatz dazu zeigte sich bei dem hergestellten divalenten AD5-Virus kaum ein Unterschied im R-Gebrauch zwischen behandelten und unbehandelten Proben, was darauf hindeutet, dass das hergestellte Virus der Neutralisierung entgangen ist. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein besseres Verständnis der Antigen-Kapsid-Inkorporationsstrategie für die Entwicklung von AD5-Vektorimpfstoffen haben. Derzeit verwenden wir diese Strategie in Kombination mit Vektoren seltener Serotypen.

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