Verfahren zur Kultivierung humaner Femur Gewebeexplantaten an Brustkrebs Zellbesiedlung des metastasierten Niche Studieren

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Proliferation, Kolonisation und Migration von Brustkrebszellen in einem humanen Knochengewebsexplant-Modellsystem zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem trabekuläre Knochengewebefragmente aus operativen Femurkopfproben isoliert und mit Brustkrebszellen kultiviert werden, die Luciferase und grün fluoreszierendes Protein exprimieren. Mithilfe der Biolumineszenzbildgebung wird die Zellproliferation gemessen und die Kolonisation der Brustkrebszellen in den Knochengewebefragmenten überprüft.

Die Kolonisationsmuster von Brustkrebszellen werden mittels Fluoreszenzmikroskopie abgebildet. Das Markkompartiment kann zur Analyse mittels Durchflusszytometrie, Lumineszenz- und Färbeassays aus den Fragmenten ausgewaschen werden. Die Migration von Brustkrebszellen hin zu Gewebekultur, Überständen und Knochenfragmente wird in Transwell-Migrationskammern gemessen. Mit biolumineszenzbasierten Bildgebungsverfahren lässt sich der Knochen als häufigster Ort von Brustkrebsmetastasen untersuchen, und letztlich eröffnet dieses Modell einen neuen Ansatz zur Untersuchung von Brustkrebszellen im metastatischen Knochenmilieu.

Ein großer Vorteil dieses Modells besteht darin, dass es direkten Zugang zum Mikroumfeld menschlicher Knochenfragmente bietet, wodurch wir das Verhalten von Brustkrebszellen während kurzzeitiger Ko-Kultur-Experimente leicht beobachten und analysieren können. Diese Methode kann verwendet werden, um zentrale Fragen zu den Mechanismen zugrunde liegenden Brustkrebs-Metastasierung in den Knochen zu untersuchen, mit dem Ziel, therapeutische Strategien zur wirksamen Prävention und Behandlung zu identifizieren. Obwohl dieses Modell Einblicke in die Brustkrebs-Metastasierung ermöglicht, kann es auch zur Untersuchung anderer knochensuchender Malignitäten wie beispielsweise Prostatakrebs eingesetzt werden.

Knochentissuefragmente müssen zu verschiedenen Zeitpunkten in jedem Assay gewonnen werden. Dies beginnt mit dem Sammeln und Transportieren einer femoralen Probe in Kochsalzlösung und der Vorbereitung der Arbeitsstation in einem Biosicherheitsschrank unter Tragen eines chirurgischen Handschuhs. Halten Sie den Femurkopf mit einer Hand fest und verwenden Sie einen chirurgischen Rohrer, um trabekuläres Knochengewebe zu entnehmen.

Die Fragmente sind etwa zwei bis fünf Millimeter groß. Pinzetten eignen sich für diesen Schritt nicht. Sie benötigen eine chirurgische Rohrzange von guter Qualität.

Bereiten Sie für dieses Experiment eine Brustkrebszell-Suspension mit 100.000 Zellen pro 50 µL DMEM plus 10 % FBS vor. Bereiten Sie außerdem Stopfen aus Knochenwachs vor, um die Knochenfragmente zu mobilisieren, indem Sie die abgeschnittenen Enden einer Mikropipettenspitze verwenden, und lagern Sie die Stopfen in einer Petrischale. Übertragen Sie die Stopfen dann mit einer Pinzette in eine sechslochige Platte und drücken Sie sie mit einem sterilen Handschuh an die Position „12 Uhr“.

Pipettieren Sie anschließend 50 Mikroliter der Zellsuspension in die Mitte jedes Wells. Stellen Sie die Platte 45 Minuten lang in einen Zellkultur-Inkubator, um die Zellanheftung zu fördern. Während die Platte inkubiert wird, extrahieren Sie die Knochenfragmente mit den an der Platte haftenden Zellen. Legen Sie ein Knochengewebefragment auf das Bienenwachs in drei Wells und drücken Sie jedes mit dem GER nieder; die drei Wells ohne Fragmente dienen als Kontrollen.

Fügen Sie anschließend langsam fünf Milliliter DMEM mit 10 % FBS an die Wand jedes Wells hinzu. Das Knochenwachs und die Knochenfragmente dürfen nicht gelöst werden. Inkubieren Sie die Kultur danach 20 bis 24 Stunden lang.

Am nächsten Tag zuerst die Zellen abbilden. Geben Sie 300 Mikrogramm pro Milliliter Luciferin in jede Vertiefung und bilden Sie die Platte anschließend unverzüglich mit einer Ivis-Bildgebungsplattform ab. Für dieses Experiment wird eine Brustkrebszell-Suspension wie zuvor benötigt.

Nach der Extraktion der Knochenfragmente jedes Fragment mit einer Pinzette in eine leere Vertiefung einer 24-Loch-Platte überführen, anschließend 50 Mikroliter Zellsuspension direkt auf jeden Knochenfragment pipettieren und die Platte 45 Minuten lang in einen Inkubator stellen, um die Zellanheftung zu fördern. Sobald die Zellen angeheftet sind, vorsichtig ein bis zwei Milliliter Medium in jede Vertiefung geben, sodass das Knochenfragment vollständig bedeckt ist. Danach die Platte 20 bis 24 Stunden lang in den Zellkultur-Inkubator stellen.

Zur Vorbereitung auf die Ivis-Bildgebung, die Fluoreszenzbildgebung oder das Sammeln von Markzellen zur Analyse für die Ivis-Bildgebung überführen Sie die Knochenfragmente in eine 24-Loch-Platte mit je einem Milliliter frischem Medium pro Loch. Geben Sie 300 Mikrogramm pro Milliliter Lucifer pro Loch hinzu und verfahren Sie wie zuvor für die Fluoreszenzmikroskopie beschrieben. Pipettieren Sie fünf Mikroliter fluoreszierende Bisphosphat-Markierungslösung in jedes Loch, um die knöchernen Bälkchen der Knochenfragmente zu markieren, und inkubieren Sie die Platte weitere 24 Stunden.

24 Stunden später die Fragmente mit einer Pinzette auf Platten mit phenolrotfreiem Medium übertragen. Anschließend die Platten mit einem Fluoreszenzmikroskop, das für die Bildgebung bei 485 Nanometern zur Lokalisierung kolonisierender GFP-exprimierender Brustkrebszellen und bei 680 Nanometern zur Identifizierung von Bisphosphat-markierten Knochenspikulen konfiguriert ist, untersuchen, um das Knochenmarkkompartiment zu spülen und die Zellzahlen oder -eigenschaften zu analysieren.

Überführen Sie ein Fragment in einen 70-Mikron-Filter über einem 50-Milliliter-Chronikgefäß. Verwenden Sie dann eine 10-Milliliter-Spritze mit einer 25-Gauge-Nadel, um das Fragment kräftig mit 10 Millilitern PBS zu spülen. Zentrifugieren Sie die Suspension drei Minuten bei Raumtemperatur mit 300 × g, um die Zellen zu pelletieren. Aspirieren und entsorgen Sie anschließend den Überstand.

Biegen Sie das Pellet aus Markzellen in PBS oder einer anderen gewünschten Lösung je nach Durchflusszytometrie- oder Vitalitätsassays. Beginnen Sie mit der Erzeugung eines Knochengewebenetzes. Geben Sie Knochenfragmente in die Vertiefungen einer 12.

Platte mit 2,2 Milliliter DMEM mit 10 % FBS pro Vertiefung, wobei einige Kontrollvertiefungen ohne Knochenfragmente belassen werden. Die Platte 24 Stunden lang kultivieren. Danach das Medium abpipettieren und ersetzen und die Kultivierung weitere 24 Stunden fortsetzen. Nach 48 Stunden Kultur 0,9 Milliliter Überstand in eine Empfängerplatte überführen, während die Empfängerplatte vorübergehend inkubiert wird.

Transwell-Einsätze in eine leere 24-Loch-Platte geben. Anschließend 100.000 Brustkrebszellen in 350 Mikroliter auf jeden Einsatz impfieren. Danach die Platten 45 Minuten lang kultivieren, um die Zellanheftung zu fördern. Nach 45 Minuten die Einsätze mit einer Pinzette auf eine Empfängerplatte übertragen.

Stellen Sie sicher, dass Sie die Inserts schräg in den Empfänger einführen. Gute Supination, damit sich keine Blasen bilden. Inkubieren Sie die Platte mit den Inserts anschließend am nächsten Tag 20 Stunden bei 37 Grad Celsius.

Entfernen Sie die Inserts mit einer Pinzette und geben Sie 300 Mikrogramm pro Milliliter Luciferin in jedes hinzu. Führen Sie die Biolumineszenz-Bildgebung auf der Empfängerplatte durch, um Brustkrebszellen nachzuweisen, die durch die Membranen migriert und sich an der Unterseite der Vertiefungen der Empfängerplatte angeheftet haben. Zunächst befüllen Sie eine Empfängerplatte mit Medium und stellen sie in den Zellkultur-Inkubator.

Um die Inserts zu besiedeln, stellen Sie diese umgekehrt in eine leere Mikrofusionsröhrchenbox mit Deckel. Geben Sie dann 100.000 Zellen in 50 µL auf die äußere untere Oberfläche jeder Insert-Membran.

Decken Sie die Box ab, lassen Sie den Deckel jedoch leicht geöffnet, und inkubieren Sie die Inserts 45 Minuten im Zellkultur-Inkubator. Anschließend invertieren Sie die Inserts mit einer Pinzette und überführen sie, indem Sie die Vertiefungen einer Receiver-Platte in jede Insert-Schale geben, jeweils mit 0,45 Milliliter DMEM mit 10 % FBS. Danach geben Sie je ein drei Millimeter großes Knochenfragment oder eine Glaskugel in jedes Insert und inkubieren sie 20 Stunden lang.

Überführen Sie am nächsten Tag die Fragmente und Perlen mithilfe einer Pinzette in eine Platte mit Vertiefungen, die jeweils ein Milliliter frisches Medium enthalten. Fügen Sie 300 Mikrogramm pro Milliliter Lucifer pro Vertiefung hinzu und führen Sie anschließend die Biolumineszenz-Bildgebung durch. MDA MB 2 31 F.Luke EGFP.

Brustkrebszellen wurden zusammen mit immobilisierten Knochenfragmenten kultiviert, um die Proliferation der Brustzellen zu messen. Die Biolumineszenz-Bildgebung nach 24-stündiger Kultur zeigte eine verstärkte Proliferation von Brustkrebszellen in Gegenwart von Knochenfragmenten in den oberen drei Vertiefungen im Vergleich zur Abwesenheit von Knochenfragmenten in den unteren drei Vertiefungen. Die Ergebnisse von Experimenten mit Fragmenten aus drei verschiedenen chirurgischen Proben zeigten eine erhöhte Proliferation in Gegenwart im Vergleich zur Abwesenheit von Knochengewebe.

In allen drei Fällen wurde nach 24 Stunden mittels Biolumineszenzbildgebung eine Kolonisation der direkt unter Knochenfragments stehenden MCF-7-F-Luke-EGFP-Zellen beobachtet. Eine verminderte Signalintensität ging mit einer abnehmenden Aussaatdichte nach 48 Stunden einher. Direkt besiedelte, mit Bisphosphonat-Reagenz markierte Fragmente zeigten eine Kolonisation der GFP-positiven Brustkrebszellen innerhalb der mineralisierten und Markräume.

Die Migration der Brustkrebszellen durch die poröse Migrationsmembran hinweg zum Knochengewebskulturüberstand war in den oberen drei Vertiefungen im Vergleich zur Migration in die Kontrolle deutlich stärker ausgeprägt. Medium war in den unteren drei Vertiefungen sichtbar. Es wurde ebenfalls Migration in drei Knochenfragmente aus einer gegebenen THR-Probe beobachtet, während keine Migration auf die Kügelchen festgestellt wurde.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie menschliche Knochenfragmente aus einer Femurkopfprobe gewonnen und in Koinkubationsassays eingesetzt werden können, um das Verhalten von Brustkrebszellen hinsichtlich Migration, Kolonisation und Proliferation zu untersuchen.