Elektroretinogramm Analyse der Sicht Antwort in Zebrafisch-Larven

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die zur Durchführung einer elektrografischen Analyse an Zebrafischlarven erforderlichen Schritte zu veranschaulichen. Dies wird zunächst durch die Herstellung von Glas-Mikropipetten mit der geeigneten Form und Größe erreicht. Der zweite Schritt besteht darin, sorgfältig die für das Experiment entscheidende Ausrüstung, wie Referenz- und Ableitelektroden, einzurichten.

Als Nächstes wird der larvale Zebrafisch anästhesiert und korrekt relativ zur Stimulations- und Aufnahmeeinrichtung ausgerichtet. Der letzte Schritt besteht in der korrekten Platzierung der gläsernen Mikroelektrode auf der Hornhaut des larvalen Zebrafischs. Letztendlich larvaler Zebrafisch.

Die ERG-Analyse eignet sich zur Untersuchung der Zapfen-Sehleistung in der vollständig aus Zapfen bestehenden Netzhaut von Wirbeltieren in vivo. Diese Methode ist äußerst nützlich, um zentrale Fragen im Bereich der Sehforschung zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung von Signalwegen, die zur visuellen Empfindlichkeit und Lichtanpassung in Zapfen beitragen. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da das korrekte Positionieren der Aufnahmeelektrode am Präparat aufgrund der geringen Größe des Auges von Zebrafischlarven schwer zu erlernen ist.

Um dieses Verfahren zu beginnen, ziehen Sie mehrere Mikropipetten aus feuerpolierten Borosilikatglas-Kapillaren mit Filament. Überprüfen Sie jede Mikropipette unter einem Mikroskop mit einem geeigneten Messlineal, um sicherzustellen, dass der Durchmesser der Spitze 10 bis 15 Mikrometer beträgt und gleichmäßig aussieht. Stellen Sie am Tag des Experiments eine Arbeitslösung her, indem Sie die 10-fach-Ringer-Lösung auf die 1-fache Konzentration verdünnen.

Mit einem Filter aus entionisiertem destilliertem Wasser die Lösung sterilisieren, um sicherzustellen, dass Partikel die Mikropipettenspitze nicht verstopfen. Anschließend 10 Minuten lang mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid anreichern. Danach die Lösung fest verschließen, um sicherzustellen, dass sie weiterhin mit Sauerstoff angereichert bleibt.

Platzieren Sie nun eine bewegliche Kunststoffplattform mit einer viskoelastischen, stoßdämpfenden Urethanpolymer-Bodenfläche auf dem Anti-Vibrations-Tisch unterhalb der Lichtquelle. Positionieren Sie anschließend die Kamera mit einem magnetischen Stativ und richten Sie sie auf die bewegliche Kunststoffplattform aus. Danach platzieren Sie den Mikromanipulator der Aufnahmeelektrode auf einem zweiten magnetischen Stativ.

Stellen Sie sicher, dass die Kamera und der Mikromanipulator nicht durch die Bewegung anderer Geräte beeinträchtigt werden und dass die Beleuchtung von der Lichtquelle nicht blockiert wird. Anschließend schließen Sie die Kamera an einen Videomonitor an und richten Sie sie auf die Plattform aus. Vergewissern Sie sich, dass die Aufbauten ordnungsgemäß mit Kupferdraht geerdet sind.

In diesem Schritt schneiden Sie mit einem sauberen Rasiermesser ein kleines Rechteck aus trockenem PVA-Schwamm zu, das passgenau in eine 35-Millimeter-Petri-Schale passt. Führen Sie einen zusätzlichen Schnitt in den Schwamm ein, um die Platzierung der Referenzelektrode zu ermöglichen. Markieren Sie anschließend mit einem chemikalienbeständigen Stift einen kleinen Punkt auf dem Schwamm an der Stelle, an der die Larve platziert wird.

Anschließend den PVA-Schwamm in Ringer-Lösung einweichen, bis er gesättigt ist. Herausnehmen und schnell zwei- bis dreimal auf einem Papierhandtuch abtupfen, bevor er in eine saubere 35-Millimeter-Petrischale gegeben wird. Danach die Petrischale mit dem Schwamm auf eine Kunststoffplattform stellen, sodass die Markierung durch die Kamera sichtbar ist.

Als Nächstes chloridieren Sie die Elektroden, indem Sie sie sechs bis neun Prozent in Natriumchlorid einweichen. Anschließend trocknen Sie sie fünf Minuten lang auf einem Kim-Tuch an der Luft. Setzen Sie das Silber-Silberchlorid-Pellet der Referenzelektrode je nach Art des Schnitts in oder unter den Schwamm und verbinden Sie die Leitung der Referenzelektrode mit dem Aufnahmesystem.

Befestigen Sie anschließend etwa 40 Zentimeter Schlauch an einer fünf Milliliter-Non-Lure-Lock-Spritze und füllen Sie die Spritze mit Ringer-Lösung. Danach füllen Sie eine ein-Milliliter-Non-Lure-Lock-Spritze mit Ringer-Lösung. Füllen Sie mithilfe eines Microfill vorsichtig den Mikroelektrodenhalter und vermeiden Sie die Bildung von Blasen.

Danach die Fünf-Milliliter-Spritze mit dem Druckanschluss des Mikroelektrodenhalters über einen Schlauch unter Verwendung des Microfill und einer mit Ringer-Lösung gefüllten Ein-Milliliter-Spritze verbinden. Die Glas-Mikropipette von der Spitze her füllen und sicherstellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind. Anschließend die Glas-Mikropipette am Mikroelektrodenhalter befestigen und darauf achten, dass der Elektrodendraht gerade bleibt.

Wenn die Befestigung erfolgt ist, verwenden Sie die Fünf-Milliliter-Spritze, um die Ringer-Lösung vorsichtig durch die Mikroelektrode zu pressen, bis eine winzige Menge der Lösung an der Spitze sichtbar ist. Setzen Sie nun die Ableitmikroelektrode vorsichtig in den Mikromanipulator ein und verbinden Sie die Leitung mit dem Ableitsystem, um das Systemrauschen zu überprüfen. Stellen Sie die Referenzelektrode und die Spitze der Ableitmikroelektrode in eine 35-Millimeter-Petri-Schale, die mit Ringer-Lösung gefüllt ist.

Überprüfen Sie die elektrischen Rauschpegel der Aufbauten mit einem Oszilloskop oder einer integrierten Funktion des ERG-Geräts. Die Rauschpegel sollten nicht mehr als plus oder minus 10 Mikrovolt von der Grundlinie abweichen. Schneiden Sie in diesem Verfahren mehrere quadratische Papiertuchstücke mit einer Fläche von je einem Quadratzentimeter zu, betäuben Sie drei bis fünf Larven in einer 35-Millimeter-Petri-Schale, indem Sie Trica auf eine Endkonzentration von 0,02 % hinzufügen und eine bis zwei Minuten warten.

Danach eine einzelne Larve vorsichtig unter einem Auflichtstereomikroskop mit minimaler Beleuchtung auf ein Papiertuchquadrat überführen. Die Position der Larven überprüfen und ein Exemplar auswählen, das mit der dorsalen Seite nach oben liegt und ein verdecktes Auge aufweist, für Aufnahmesitzungen, die länger als 30 Minuten dauern. Die Larve feucht halten, indem der Körper mit 3% Methylcellulose mittels eines feinen Pinsels aus Kamelhaar bestrichen wird.

Überführen Sie dann das mit der Larve versehene Papiertuchquadrat auf den feuchten PVA-Schwamm. Anschließend leiten Sie einen kontinuierlichen Strom aus Wasser gesättigten 100 %igen Sauerstoffs über die Larven, indem Sie das Gas durch einen Luftsstein in einem Seitenhalskolben mit destilliertem Wasser blubbern lassen. Führen Sie den aus dem Seitenhals des Kolbens kommenden befeuchteten Sauerstoff mit Hilfe eines Schlauchs in geringer Beleuchtung nahe zum Kopf der Larve.

Verwenden Sie den Mikromanipulator und die Kamera, um die Mikroelektrode in der Mitte zwischen der Nasen- und Hinterseite des Auges zu positionieren, und drücken Sie vorsichtig an die dorsale Grenze der Hornhaut. Lassen Sie die Larven sich fünf bis zehn Minuten lang an die Dunkelheit anpassen. Nehmen Sie dann die Reaktionen auf Testblitze auf, die von einer LED-Lichtquelle oder einem optischen Stimulator bereitgestellt werden.

Diese Abbildung zeigt eine typische ERG-Aufzeichnung bei einem fünf Tage alten Zebrafisch-Larven. Die an die Dunkelheit angepassten Fische wurden weißen LED-Lichtreizen von 20 Millisekunden Dauer ausgesetzt, deren Intensität zwischen ein und 5.000 Candela pro Quadratmeter variierte, wobei der Lichtreiz zum Zeitpunkt null Sekunden begann. Das negative Potential, die A-Welle, ist schwer zu erkennen, während das positive Potential, die B-Welle, der dominierende Peak der Wellenform ist.

Diese Einlage zeigt die gemittelten B-Wellen-Amplituden, die mithilfe der NACA-rush-Gleichung angepasst wurden. Diese Abbildung zeigt eine typische ERG-Aufzeichnung bei einem im Dunkeln adaptierten fünf Tage post Befruchtung (DPF) alten Zebrafischlarven, die mit einem PB behandelt wurden. Die Fische wurden 20 Millisekunden lang LED-Weißlicht mit Intensitäten von eins bis 5.000 Candela pro Quadratmeter ausgesetzt, und das isolierte Konusmasserezeptorpotential stellt das dominierende Element der Wellenform dar. Diese Einlage zeigt die gemittelten Antwortamplituden eines mit PB behandelten Zebrafischlarven, die mithilfe der NACA-rush-Gleichung angepasst wurden.

Diese Abbildung zeigt eine typische ERG-Aufzeichnung bei einem mit fünf D-P-F-A-P-B behandelten larvalen Zebrafisch. Unter Verwendung eines Doppelblitz-Paradigmas werden die an Dunkelheit angepassten Fische aufeinanderfolgenden 20 Millisekunden langen Weißlichtblitzen ausgesetzt.

LED leuchtet mit einer Intensität von 1000 Kanülen pro Quadratmeter, und das ISI zwischen den Lichtblitzen beträgt zwei Sekunden. Hier ist der Beginn jedes Lichtreizes angegeben. Diese Abbildung zeigt das Verhältnis der maximalen isolierten Antwort des Zapfen-Masserezeptorpotentials des zweiten Reizes zur Antwort des ersten Reizes in Abhängigkeit von steigendem ISI, was die fortschreitende Erholung der Photorezeptorempfindlichkeit anzeigt.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass die Qualität der Aufnahmen von der Integrität der Elektroden-Kornea-Verbindung und vom Gesundheitszustand der Larven abhängt. Die Entwicklung dieser Technik hat die Fähigkeit der Forscher in den Sehwissenschaften erheblich verbessert, die Anpassung und Erholung von Zapfen in der Wirbeltierretina in vivo zu untersuchen.