Name: Elektroretinogramm Analyse der Sicht Antwort in Zebrafisch-Larven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Lernen Sie die Elektroretinographie an Zebrafisch-Larven zur Analyse der visuellen Funktion in vivo. Diese Methode ermöglicht präzise Messungen der Netzhautantworten für die Erforschung von Sehvermögen und Lichtadaptation.

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Wir danken den Mitgliedern der UNC Zebrafish Aquaculture Anlage für die Pflege des Zebrafisches. Wir möchten uns auch bei Diagnosys, LLC für die Unterstützung bei der Einrichtung des ERG-Geräts bedanken. Ein weiterer Dank geht an Dr. Portia McCoy und das Labor von Dr. Ben Philpot für die Unterstützung bei elektrophysiologischen Methoden. Wir danken auch Lizzy Griffiths für ihre Illustration einer Zebrafischlarve. Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health Awards F32 EY022279 (an J.D.C) und R21 EY019758 (an E.R.W) unterstützt.

Tier Pflege und experimentelle Protokolle wurden von den Institutional Animal Care und Verwenden Ausschüsse der University of North Carolina in Chapel Hill genehmigt, und erfüllen alle Anforderungen der NIH Office of Laboratory Animal Welfare und der Gesellschaft für Evaluierung und Akkreditierung für Labortier Care International. HINWEIS: Um die Larven für ERG Analyse zu erhalten, veröffentlicht Protokolle für Standard Zebrafischhaltung und Wartung eingesetzt wurden 18. Larven werden durch natürliche Zucht erhalten und unter einem 14 Stunden Licht / 10 h Dunkel-Zyklus untergebracht. Dieses Protokoll wurde für die Larven in 5-7 Tage nach der Befruchtung (dpf) optimiert worden, konnte aber im Idealfall auf ältere Fische mit kleinen Änderungen an der Vorgehensweise durchgeführt werden. Hier verwenden Sie die TL-Stamm von Wildtyp-Zebrafisch-Larven bei 5 dpf. 1. Mikropipette Produktion <ol><li> Ziehen Sie mehrere Mikropipetten mit 1,5 x 0,86 mm (Außendurchmesser von Innendurchmesser) feuerpolierte Borosilikatglas Kapillaren mitFilament (Schmelztemperatur, 821 ° C) und eine P-97 Flaming / Braun Mikropipette Abzieher mit Feld Wärme Filament eingebaut. Verwenden Sie das Programm für die Gestaltung in Tabelle 1 beschriebenen Mikropipetten. </li><li> Überprüfen Sie jede Mikropipette unter dem Mikroskop mit einem geeigneten Raster Lineal, um sicherzustellen, dass Spitzen sind 10-15 um im Durchmesser und hat eine glatte Bahnöffnung (dh keine scharfen Kanten). </li><li> Sorgfältig zu verwahren Mikropipetten zur Spitze Schäden und die Belastung durch Staub zu verhindern. Speicheroptionen Petrischalen mit Labor-Band, mit Schaumstoff ausgekleideten Boxen, oder im Handel erhältliche Mikropipette Lagerbehälter. Hinweis: andere Mikropipette Abzieher und Glaskapillaren kann, solange die richtigen Durchmesser der Mikropipette und eine hochwertige Spitze erreicht wird. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Druck </td><td> Wärme </td><td> Ziehen </td><td> Geschwindigkeit </td&gt; <td> Zeit </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 560 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 450 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 410 </td><td> 55 </td><td> 40 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Programm für die Herstellung von Mikropipetten mit einem P-97 Flaming / braun Mikropipette Abzieher mit einem Kasten Wärme Filament eingebaut Mikropipetten werden mit 1,5 x 1,0 mm 2 (Außendurchmesser von Innendurchmesser) feuerpolierte Borosilikatglas Kapillaren mit Filament. (Schmelztemperatur 821 ° C). 2. Buffer Vorbereitung <ol><li> Gebrauch gefiltert, oxygenierte fish Ringer-Puffer 19 in der Mikroelektrode Kapillare und den Polyvinylalkohol (PVA) Schwamm, auf welche die Larven werden für Experimente platziert sättigen. Alternativ können Sie E3<html> Embryo Medien oder Hanks Balanced Salt Solution. </li><li> Bereiten Lösung 10x Goldfisch Ringer wie in Tabelle 2 beschrieben einstellen auf pH 7,8 und sterilisiert mit einem 0,22 um Filter und lagern Sie die 10-faches bei 4 ° C. </li><li> Erstellen Sie eine Arbeitslösung auf dem Tag des Experiments durch die 10x Ringerlösung verdünnt mit deionisiertem, destilliertem Wasser 1x. Filter mit einem 0,22 um Filter-System. Oxygenat durch Blasenbildung mit 95% O 2/5% CO &amp; sub2; -Gas für 10 Minuten. Deckel fest danach, um sicherzustellen, dass die Lösung bleibt oxygenierten. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> NaCl </td><td> 1,25 M </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 26 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 25 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 100 mM </td></tr></tbody></table>jove_content &quot;&gt; Tabelle 2: Herstellung einer Lösung 10x Goldfisch Ringer. 3. Elektroretinogramm Platform <ol><li> Führen ERG Experimente an einem Anti-Vibrationstisch in einem Faraday-Käfig, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern. Befestigen Sie eine benutzerdefinierte Stahlplattform mit dem Antivibrationstisch mit Sechskantmuttern. Legen Sie eine bewegliche Kunststoffplattform mit einem viskoelastischen Urethanpolymer stoßdämpfenden Boden auf den Tisch unter die Lichtquelle. </li><li> Positionieren Sie die Kamera mit einem magnetisierten stand, sich an den beweglichen Kunststoff-Plattform ab. Positionieren Sie den Mikromanipulator mit einem zweiten magnetisierten Stand auf der rechten Seite des beweglichen Kunststoff-Plattform (die die Aufzeichnungsmikro halten wird). Sicherzustellen, dass die Kamera und der Mikromanipulator wird nicht durch die Bewegung der anderen Geräte gestört werden und dass sie nicht die Beleuchtung von der Lichtquelle zu blockieren. </li><li> Schließen Sie die Kamera an einen Videomonitor und positionieren Sie es, um das Auge des sehenLarve für die Platzierung der Elektrode in der richtigen Position. </li><li> Stellen Sie sicher, dass das Setup richtig mit Kupferdraht geerdet. Um das Rauschen zu überprüfen, legen Sie die Referenzelektrode und die Spitze der Mikroelektrode in einer Aufnahme 35 mm Petrischale mit Ringer-Lösung gefüllt. Überprüfen Sie die elektrische Geräuschpegel des Setup mit einem Oszilloskop oder einem eingebauten Merkmal der ERG Gerät. Der Geräuschpegel sollte nicht mehr als ± 10 &amp; mgr; V von der Grundlinie sein. </li></ol> 4. Sponge Vorbereitung <ol><li> Schneiden Sie ein kleines Rechteck von trockenem PVA Schwamm, der fest in einer 35 mm Petrischale passt. Die Dicke des Schwammes sollte nicht größer als die Tiefe der Schale sein. Mit einem Messer mit einer sauberen Rasierklinge zum Schneiden. </li><li> Vereinbaren Sie einen zusätzlichen Schnitt in den Schwamm, um die Referenzelektrode unterzubringen (entweder ein flacher Schnitt der Länge nach auf den Boden der Schwamm oder ein Schmetterling vertikal durch eine der kleineren beschnitten). </li><li> Verwenden Sie einen chemisch beständigen Markierungum einen kleinen Punkt auf dem Schwamm (wo die Larve gelegt werden), die zur Positionierung der Kamera verwendet werden kann, zu markieren. </li><li> Weichen Sie die PVA Schwamm in Ringer-Lösung bis zur Sättigung. Entfernen und tupfen Sie schnell auf ein Papiertuch 2-3 mal. Setzen Sie den Schwamm in einer sauberen 35-mm-Petrischale. </li><li> Platzieren Sie die Petrischale mit dem Schwamm auf der Plastikplattform, so daß die Markierung von der Kamera sichtbar gemacht werden. </li></ol> 5. Elektrodenvorbereitung HINWEIS: Der Zebrafisch Aufbau besteht aus einer Referenzelektrode in Kontakt mit der Ringerlösung gesättigten PVA-Schwamm und einer Aufzeichnungselektrode, die in Kontakt mit der Hornhaut. Die Bezugselektrode besteht aus einer Ag / AgCl-Pellet. Die Aufzeichnungselektrode ist eine gezogene Glasmikropipette mit Ringer-Lösung gefüllt und durch ein Mikroelektrodenhalter, die eine Ag-Draht gehalten. <ol><li> Chlorid die Elektroden durch Einweichen in 6-9% Natriumhypochlorit (Bleiche) für 5 min (die Aufzeichnungs microelectrode Draht) oder 15 Minuten (die Referenzelektrode). Luft trocknen auf einem Kimwipe für 5 min. <ol><li> In Abhängigkeit von der Art der Schnitt in Schritt 4.2 gemacht, legen Sie die Ag / AgCl-Pellet der Referenzelektrode in die (für die vertikale Schmetterling ausschneiden) oder mit (für die flache Schnitt der Länge nach auf den Boden) dem Schwamm. Befestigen Sie die Referenzelektrode führen zu dem Aufzeichnungssystem. </li><li> Alternativ, wenn die ERG Setup hat Platz oder gibt es besonders starke Photovoltaik-Artefakten aus der Ag / AgCl-Elektrode, schließen Sie die Referenzelektrode mit dem Schwamm über ein Agar-Salzbrücke, die Elektrode aus dem Lichtweg zu bewegen. </li></ol></li><li> Bringen ~ 40 cm von geeigneter Größe Schlauch an einen 5 ml nicht-Luer-Lock-Spritze. Füllen Sie die Spritze mit Ringerlösung. Mikroelektrodenhalter besitzen Druckanschlüsse versenden in der Regel mit Adaptern für Schläuche mit Innendurchmessern von 1/16 unterzubringen &quot;, 3/32&quot;, 1/8 &quot;oder 5/32&quot;. </li><li> Füllen Sie eine 1 ml nicht-Luer-Lock-Spritze mitRinger-Lösung und mit einem Micro-fil, sorgfältig füllen die Mikroelektrodenhalter. Verhindern die Bildung von Blasen. </li><li> Befestigen Sie die 5-ml-Spritze mit dem Druckanschluss der Mikroelektrode Halter mit Schlauch und es verwenden, um sicherzustellen, dass die Mikroelektrodenhalter ist voll von Ringer-Lösung. Mit dem Micro-fil und 1-ml-Spritze mit Ringer-Lösung gefüllt, füllen Sie die Mikropipette Glas von der Spitze und sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind. </li><li> Befestigen Sie die Glas-Mikropipette auf die Mikroelektrodenhalter, wobei Sie darauf achten, den Elektrodendraht gerade zu halten. Sobald gesichert mit der 5 ml Spritze sorgfältig zwingen Ringerlösung durch die Mikroelektrode, bis eine kleine Menge der Lösung auf die Spitze sichtbar ist. Gelegentliche Anwendung von Druck auf die Spritze (wenn sie nicht an der Hornhaut angewendet wird) wird die Bildung von Luftblasen sowie Einschlüsse aufgrund von Staub oder Salzansammlung zu verhindern, in die Mikropipettenspitze. <ol><li> Wenn die Lösung herauskommt als ein Strom, ersetzen Sie die glass Mikropipette, die Spitzenöffnung zu groß ist oder beschädigt ist. </li></ol></li><li> Legen Sie das Aufnahme-Mikroelektrode im Mikromanipulator und befestigen Sie das Kabel mit dem Aufnahmesystem. </li></ol> 6. Elektroretinogramm Analyse HINWEIS: Aufgrund der Kegel Dominanz des Larvennetzhaut, können qualitativ hochwertige ERG Ergebnisse erhalten, wenn die Vorbereitungen für die Aufnahme unter niedrigen indirekten weißem Licht durchgeführt werden (&lt;1 Lux) oder für kurze Zeit (&lt;1 min) höherer Intensität ( ≤250 Lux) Arbeitslicht. Eine kurze Zeit der Dunkeladaptation ist weiterhin erforderlich, vor der Aufnahme (siehe Schritt 6.7). Jedoch können Versuche unter schwach rot oder Infrarotlicht unter Verwendung einer infrarotempfindlichen Kamera durchgeführt werden. Alle Experimente wurden in steril filtriert (0,22 um) System Wasser von der UNC Zebrafisch Aquakulturanlage durchgeführt, aber alternative Embryo Mittel können angewendet werden. <ol><li> Schneiden Sie Papiertuch Quadraten mit Abmessungen von ungefähr 1cm 2. </li><li> Wenn die Messung isoliert Kegel Masse receptor potential, Inkubation 3-5 Larven im System Wasser mit 500 uM (±) -2-Amino-4-phosphonobutyric Säure (APB) für 5 min. HINWEIS: Wenn APB ist eine racemische Mischung des aktiven (L) oder inaktiven (R) Formen AP4, ist es als L-AP4 als wirksame und weniger teuer. </li><li> Anesthetize 3-5 Larven im System Wasser mit 0,02% (w / v) Tricaine, bis nicht mehr reagiert, ca. 1-2 min. </li><li> Verwenden einer Pasteurpipette und Pipettenpumpe einzelne Larven vorsichtig Transfer auf Papiertuch Quadrate unter Sezieren Stereoskop mit minimalen Beleuchtungsstärke (Lux ≤250 &lt;1 min). Überprüfen Sie die Position der einzelnen Larve und wählen Sie einen Kandidaten, der Rückenseite mit einer nicht verschlossenen Auge ist. <ol><li> Für längere Aufnahmen (&gt; 30 min), feucht zu halten die Larve durch Verglasung der Körper bis zu aber nicht einschließlich der Kopf mit 3% Methylcellulose mit einem feinen Kamelhaarbürste. </li></ol></li><li> Mit einer Pinzette, übertragen Sie die Papiertuch square mit der Larve in die feuchten PVA Schwamm. <ol><li> Für längere Aufnahmen (&gt; 30 min), gelten ein kontinuierlicher Strom von wassergesättigter 100% O 2 -Gas über die Larve durch Einblasen des Gases durch eine Ausströmer in einem Seitenarm-Kolben, der destilliertes Wasser. Positionieren Sie den Schlauch Verlassen der Kolben Seitenarm, der die befeuchteten Sauerstoff in der Nähe von Kopf der Larve vermittelt. HINWEIS: Schritt 6.4.1 und Schritt 6.5.1 wird die Lebensdauer des Fisches 16 zu verlängern. </li></ol></li><li> Unter minimale Beleuchtung, verwenden Sie den Mikromanipulator und Kamera, um die Mikroelektrodenspitze in der Mitte zwischen der Nasen und Schwanzenden der Augenposition und drücken Sie vorsichtig auf die dorsale Grenze der Hornhaut. HINWEIS: Fehlanordnung der Elektrodenspitze in die entfernt distalen Bereichen der Hornhaut in ERG-Wellenformen mit umgekehrter Polarität führen. </li><li> Lassen Larve bis dunkel anpassen 5-10 min. </li><li> Nehmen Testblitz Reaktionen auf Licht von einer LED-Lichtquelle oder Licht Stimulator zur Verfügung gestellt mit dem avaiLabel Stimulation und Aufnahmegeräte. Passen Protokollparameter wie die Blitzintensität, Blitzweite, Blitzfarbe, Hintergrundintensität und Farb und Filtereinstellungen, um das Experiment zu passen. </li><li> Wenn das Experiment beendet ist, einschläfern Larven nach AVMA / IACUC Richtlinien. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

In diesem Protokoll ein einfaches Verfahren für die ERG-Aufnahmen von Larven Zebrafisch wird beschrieben. Dieses Verfahren ermöglicht eine schnelle und umfassende Test der visuellen function.There gibt mehrere wichtige Schritte im Rahmen des Verfahrens, das im Auge behalten werden sollte. Der Zebrafisch-Larven sollten gesund sein, bevor das Experiment zu Tode während der potenzielle medikamentöse Behandlungen zu vermeiden und eine längere Lebensunterhalt während der ERG-Aufnahmen. Darüber hinaus ist es wichtig, daß die ...

Das Elektroretinogramm (ERG) ist eine nicht-invasive elektrophysiologischen Verfahren, die ausführlich in der Klinik für die Bestimmung der Funktion der Retina in Menschen verwendet wird. Die elektrische Aktivität in Reaktion auf einen Lichtreiz, wird durch Anordnen Aufzeichnungselektroden auf der äußeren Oberfläche der Hornhaut gemessen. Die Eigenschaften des Reizparadigma und der Antwort-Wellenform zu definieren, die retinalen Neuronen, die zur Reaktion. Dieses Verfahren ist für den Einsatz mit einer Reihe von Tiermodellen, einschließlich Mäusen und Zebrafisch angepasst. Die typische Wirbel ERG Antwort hat vier Hauptkomponenten: das a-Welle, die eine Hornhaut-negatives Potential von Photorezeptorzellaktivität abgeleitet ist; die b-Welle, eine Hornhaut-positives Potential von der ON bipolaren Zellen abgeleitet; der d-Welle, eine Hornhaut-positiven Potential wie die Aktivität der OFF bipolaren Zellen interpretiert; und die c-Welle, die nach der b-Welle einige Sekunden auftritt und spiegelt Aktivität in Müller Glia und retinal Pigmentepithel 1-4. Zusätzliche Hinweise für das Verständnis der Geschichte und Prinzipien der ERG Analyse bei Menschen und Modelltiere sind die Online-Lehrbuch, Webvision, von der University of Utah und Texte wie den Principles and Practice of Clinical Elektrophysiologie des Sehens 4, 5. Danio rerio (Zebrafisch) ist seit langem als Modell für die Entwicklung von Wirbeltieren begünstigt worden, aufgrund seiner schnellen Reifung und Transparenz, die für die nichtinvasive morphologische Analyse von Organsystemen, Verhaltens-Assays und sowohl vorwärts und rückwärts genetischen Screens (zur Übersicht siehe Fadool und ermöglicht Dowling 6). Zebrafisch-Larven sind sehr gut für genetische und pharmakologische Manipulation, die, wenn sie mit ihrer hohen Fruchtbarkeit, machen sie eine ausgezeichnete Tiermodell für die Hochdurchsatz-biologischen Analysen. Das höhere Verhältnis von Kegeln mit Stangen in Larven Zebrabärbling - etwa 1: 1 im Vergleich zu Mäusen (~ 3% Konuse) - machen sie besonders nützlich für die Untersuchung der Kegelfunktion 7-9. In der Retina von Wirbeltieren entwickeln Kegel vor Stangen 10. Interessanterweise sind Zebrafisch Kegel operative bereits 4 dpf, was eine selektive elektrophysiologische Analyse der Kegel in diesem Stadium 6, 11,12. Im Gegensatz dazu ERG-Antworten in Stäbe erscheinen zwischen 11 und 21 dpf 13. Daher Zebrafisch-Larven bei 4-7 dpf funktionell dienen als All-Kegel Netzhaut. Allerdings ist die Mutterphotopischen ERG Antwort von 4-7 dpf Larven von der b-Welle dominiert. Anwendung von pharmakologischen Mitteln, wie beispielsweise L - (+) - 2-Amino-4-phosphono-buttersäure (L-AP4), ein Agonist des metabotropen Glutamat (mGluR6) Rezeptors durch den, bezogen auf die bipolaren Zellen, blockiert wirksam die Erzeugung der b-Welle und zeigt die isolierte Kegel Masse receptor potential, (die &quot;a-Welle&quot;), 14-17. Hier beschreiben wir eine einfache und reliable Verfahren für ERG Analyse mit handelsüblichen ERG Geräte für den Einsatz mit Mäusen, die für die Verwendung mit Zebrafisch-Larven adaptiert wurden konzipiert. Dieses System kann auf Zebrafisch-Larven mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen, sowie diejenigen, mit pharmakologischen Mitteln behandelt, die Forscher bei der Identifizierung von Signalwegen, die visuelle Empfindlichkeit und leichte Anpassung 16 beitragen unterstützen genutzt werden. Die in diesem Protokoll beschriebenen experimentellen Verfahren wird Ermittler im Gebrauch von ERG-Analyse, um eine Vielzahl von biologischen Fragen zu beantworten Vision führen und zeigen den Aufbau eines flexiblen ERG-Setup.

<table><tbody><tr><td>Faraday Cage</td><td>80/20 Inc</td><td>kundenspezifisches</td><td>kundenspezifisches Aluminium "Industrial Erector Set" für Käfigrahmen</td></tr><tr><td>PVA-Schwamm</td><td>Amazon</td><td>B000ZOWG1C</td><td>Bietet eine weiche, feuchte Plattform für die Platzierung von Zebrafischlarven</td></tr><tr><td>150 ml Sterile Filtersysteme</td><td>Corning</td><td>431154</td><td>Filterlösungen, um zu verhindern, dass kleine Gelenke Mikropipetten blockieren</td></tr><tr><td>Espion E2</td><td>Diagnosys, LLC</td><td>Kontakt</td><td>Modulares Elektrophysiologie-System, das in der Lage ist, visuelle Reize für jeden Stimulator zu erzeugen und die Reaktionen mit Hilfe proprietärer Software digital aufzuzeichnen und zu analysieren, weitere Informationen unter http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>Colordome</td><td>Diagnosys, LLC</td><td>Kontakt</td><td>Lichtstimulator mit RGB-LED und Xenon-Lichtquellen für Ganzfeld ERG, weitere Informationen unter http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Drummond</td><td>3-000-024-R</td><td>Halten und Positionieren der Aufzeichnungs-Mikroelektrode</td></tr><tr><td>Magnetisches Ringstativ</td><td>Drummond</td><td>3-000-025-MB</td><td>Halten und Positionieren der Kamera und der Referenzelektrode</td></tr><tr><td>Kabelverlängerungen</td><td>Grass Technologies</td><td>F-LX</td><td>Ersatzkabel von Buchse auf Stecker 1,5 mm zum Anschluss von Elektroden</td></tr><tr><td>Stecker Pin auf Buchse SAFELEAD Adapter</td><td>Grass Technologies</td><td>DF-215/10</td><td>Verbinden von 2 mm Pins mit 1,5 Kopfteil-Pins</td></tr><tr><td>Fenstergitterrahmen (Metall) und Spline</td><td>Lowes oder Home Depot</td><td>diverse</td><td>Zur Befestigung von Kupfergittern an Faradayschen Käfigrahmen</td></tr><tr><td>Steriflip 50 ml Filter</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>Filterlösungen, um zu verhindern, dass kleine Gelenke Mikropipetten blockieren</td></tr><tr><td>BNC-Adapter</td><td>Monoprice</td><td>4127</td><td>Anschluss der Kamera an das BNC-Kabel</td></tr><tr><td>BNC-Kabel</td><td>Monoprice</td><td>626</td><td>Anschließen der Kamera an den Videoadapter</td></tr><tr><td>Kameraobjektiv</td><td>Navitar</td><td>1582232</td><td>Visualisierung der Positionierung der Aufzeichnungsmikroelektrode auf der Hornhaut</td></tr><tr><td>der Larve Kamerakoppler</td><td>Navitar</td><td>1501149</td><td>Visualisierung der Positionierung der Aufzeichnungsmikroelektrode auf der Hornhaut der Larve</td></tr><tr><td>Luna BNC auf VGA + HDMI Konverter</td><td>Sewell</td><td>SW-29297-PRO</td><td>BNC-auf-VGA-Adapter zur Projektion des Kamerabildes auf den Computermonitor</td></tr><tr><td>APB</td><td>Sigma</td><td>A1910</td><td>mGluR6-Agonist, blockiert die b-Welle und ermöglicht die Analyse des isolierten Kegelmassenrezeptorpotentials</td></tr><tr><td>Borosilikatglas</td><td>Sutter</td><td>BF-150-86-10</td><td>Feuerpoliertes Borosilikatglas (Messtemperatur = 821 Grad; C) mit Filament und Abmessungen von 1,5 mm x 0,86 mm (Außendurchmesser x Innendurchmesser)</td></tr><tr><td>P97 Flammender/Brauner Abzieher</td><td></td><td>Sutter P97</td><td>Zum Ziehen von Glasmikropipetten</td></tr><tr><td>Sorbothan-Blatt</td><td>Thorlabs</td><td>SB12A</td><td>Synthetisches viskoelastisches Urethanpolymer, platziert unter passiven Isolationshalterungen und ERG-Plattform, um Stöße zu absorbieren und ein Verrutschen zu verhindern, kann zugeschnitten werden</td></tr><tr><td>Steckbrett</td><td>Thorlabs</td><td>B2436F</td><td>Schwingungsisolationsplatte für ERG-Stimulator und Zebrafischprobe</td></tr><tr><td>Passive Isolationshalterungen</td><td>Thorlabs</td><td>PWA074</td><td>Bietet Schwingungsisolierung für das Steckbrett</td></tr><tr><td>Kupfergewebe</td><td>TWP</td><td>022X022C0150W36T</td><td>Zum Auslegen der Faraday-Käfig-Pipettenpumpe</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>53502-233</td><td>Wird mit Pasteur-Pipetten verwendet, um Zebrafischlarven vorsichtig zu übertragen</td></tr><tr><td>Pasteur-Pipetten</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td>Wird mit Pipettenpumpe verwendet, um Zebrafischlarven vorsichtig zu übertragen</td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Watec</td><td>WAT-902B</td><td>Visualisierung der Positionierung der Aufzeichnungsmikroelektrode auf der Hornhaut der Larve</td></tr><tr><td>Tricain (MS-222)</td><td>Western Chemical</td><td>Tricaine-S</td><td>Anästhetikum in pharmazeutischer Qualität,Micro-fil</td></tr> <tr><td></td><td></td><td>WPI MF28G-5</td><td>Füllmikroelektrodenhalter und Mikroelektrodenglas</td></tr><tr><td>Mikroelektrodenhalter</td><td>WPI</td><td>MEH2SW15</td><td>Hält Glasmikroelektrode, verbindet sich mit ERG-Geräten</td></tr><tr><td>Referenzelektrode</td><td>WPI</td><td>DRIREF-5SH</td><td>Brechen Sie vorsichtig den letzten Zentimeter des Gehäuses ab, um den Elektrolyten abzulassen und die gesinterte Ag/AgCl-Pelletelektrode freizulegen</td></tr><tr><td>Referenzelektrode (alternativ)</td><td>WPI</td><td>EP1</td><td>Alternative zu DRIREF-5SH. Ag/AgCl-Elektrode, die mit der Anschlussleitung verdrahtet/gelötet werden muss</td></tr><tr><td>Geräuscharmes Kabel für Mikroelektrodenhalter</td><td>WPI</td><td>13620</td><td>Anschluss des Mikroelektrodenhalters an den Adapter/das Kopfteil</td></tr></tbody></table>

elektroretinogramm analyse der sicht antwort in zebrafisch-larven

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

Das Elektroretinogramm (ERG) ist eine nicht-invasive elektrophysiologische Verfahren zur Bestimmung der Netzhautfunktion. Durch die Anordnung einer Elektrode auf der Oberfläche der Hornhaut, in Antwort auf Licht erzeugte elektrische Aktivität kann gemessen und verwendet, um die Aktivität von Netzhautzellen in vivo zu beurteilen. Diese Handschrift beschreibt die Verwendung von der ERG zur Sehfunktion im Zebrafisch zu messen. Zebrafische sind seit langem als Modell für die Entwicklung von Wirbeltieren wegen der Leichtigkeit der Gen-Unterdrückung durch Morpholino Oligonukleotiden und pharmakologische Manipulation genutzt. 5-10 dpf sind nur Zapfen Funktions im Larvennetzhaut. Daher ist die Zebrafisch, im Gegensatz zu anderen Tieren, ist ein leistungsfähiges Modellsystem für das Studium der Kegel visuellen Funktion in vivo. Dieses Protokoll verwendet Standard-Anästhesie, Mikromanipulation und Stereomikroskopie-Protokolle, die in Labors, die Zebrafisch-Forschung führen gemeinsam sind. Die beschriebenen Methoden verwenden Standard-Elektrophysiologie equipment und eine Lichtkamera, um die Platzierung der Aufnahme Mikroelektroden auf die Larvenhornhaut führen. Schließlich zeigen wir, wie ein handelsüblicher ERG Stimulator / Recorder ursprünglich für den Einsatz mit Mäusen entwickelt, kann leicht für die Verwendung mit Zebrafisch angepasst werden. ERG der Larven Zebrafisch ist eine ausgezeichnete Verfahren zur Untersuchung Kegel Sehfunktion bei Tieren, die von Morpholino Oligonukleotid Einspritzung geändert wurden, sowie neuere Genom-Engineering-Techniken wie beispielsweise Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) Transkriptionsaktivator-Like Effektor Nukleasen (Talens) und Regelmäßig gruppierten beabstandeten Kurz Palindromic Repeats (CRISPR) / Cas9, alle haben die Effizienz und Wirksamkeit des Gen-Targeting in Zebrabärbling stark erhöht. Darüber hinaus nutzen wir die Fähigkeit von pharmakologischen Mitteln zur Zebrafisch-Larven, die molekularen Komponenten, die dem Photo beitragen bewerten zu durchdringen. Dieses Protokoll beschreibt eine Einrichtung, die geändert und von den Forschern verwendet werden könnenmit verschiedenen experimentellen Ziele.

Typischerweise werden ERGs von Zebrafisch-Larven bei 5 dpf erfasst, da eine Reihe von Studien haben ERG Aufnahmen in dieser Phase 9, 16,20 veröffentlicht. Larven Antworten wurden unter dunkeladaptierten Bedingungen ohne Hintergrundbeleuchtung mit einem 20 ms Reiz weißem LED-Licht gemessen. Wir verwendeten einen handelsüblichen ERG-System, bestehend aus einem Ganzfeld Licht Stimulator und Computer-Controller / Recorder. Der Stimulator verwendet ein proprietäres Pulsbreitenmodulation (PWM) System streng kontrol...

Wir präsentieren eine Methode zur elektroretinographischen (ERG) Analyse von Zebrafischlarven unter Verwendung von Mikromanipulations- und Elektroretinographie-Techniken. Dies ist eine einfache und unkomplizierte Methode, um die Sehfunktion von Zebrafischlarven in vivo zu bestimmen.

Elektroretinogramm Analyse der Sicht Antwort in Zebrafisch-Larven

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die zur Durchführung einer elektrografischen Analyse an Zebrafischlarven erforderlichen Schritte zu veranschaulichen. Dies wird zunächst durch die Herstellung von Glas-Mikropipetten mit der geeigneten Form und Größe erreicht. Der zweite Schritt besteht darin, sorgfältig die für das Experiment entscheidende Ausrüstung, wie Referenz- und Ableitelektroden, einzurichten. Als Nächstes wird der larvale Zebrafisch anästhesiert und korrekt relativ zur Stimulations- und Aufnahmeeinrichtung ausgerichtet. Der letzte Schritt besteht in der korrekten Platzierung der gläsernen Mikroelektrode auf der Hornhaut des larvalen Zebrafischs. Letztendlich larvaler Zebrafisch.Die ERG-Analyse eignet sich zur Untersuchung der Zapfen-Sehleistung in der vollständig aus Zapfen bestehenden Netzhaut von Wirbeltieren in vivo. Diese Methode ist äußerst nützlich, um zentrale Fragen im Bereich der Sehforschung zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung von Signalwegen, die zur visuellen Empfindlichkeit und Lichtanpassung in Zapfen beitragen. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da das korrekte Positionieren der Aufnahmeelektrode am Präparat aufgrund der geringen Größe des Auges von Zebrafischlarven schwer zu erlernen ist.Um dieses Verfahren zu beginnen, ziehen Sie mehrere Mikropipetten aus feuerpolierten Borosilikatglas-Kapillaren mit Filament. Überprüfen Sie jede Mikropipette unter einem Mikroskop mit einem geeigneten Messlineal, um sicherzustellen, dass der Durchmesser der Spitze 10 bis 15 Mikrometer beträgt und gleichmäßig aussieht. Stellen Sie am Tag des Experiments eine Arbeitslösung her, indem Sie die 10-fach-Ringer-Lösung auf die 1-fache Konzentration verdünnen.Mit einem Filter aus entionisiertem destilliertem Wasser die Lösung sterilisieren, um sicherzustellen, dass Partikel die Mikropipettenspitze nicht verstopfen. Anschließend 10 Minuten lang mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid anreichern. Danach die Lösung fest verschließen, um sicherzustellen, dass sie weiterhin mit Sauerstoff angereichert bleibt.Platzieren Sie nun eine bewegliche Kunststoffplattform mit einer viskoelastischen, stoßdämpfenden Urethanpolymer-Bodenfläche auf dem Anti-Vibrations-Tisch unterhalb der Lichtquelle. Positionieren Sie anschließend die Kamera mit einem magnetischen Stativ und richten Sie sie auf die bewegliche Kunststoffplattform aus. Danach platzieren Sie den Mikromanipulator der Aufnahmeelektrode auf einem zweiten magnetischen Stativ.Stellen Sie sicher, dass die Kamera und der Mikromanipulator nicht durch die Bewegung anderer Geräte beeinträchtigt werden und dass die Beleuchtung von der Lichtquelle nicht blockiert wird. Anschließend schließen Sie die Kamera an einen Videomonitor an und richten Sie sie auf die Plattform aus. Vergewissern Sie sich, dass die Aufbauten ordnungsgemäß mit Kupferdraht geerdet sind.In diesem Schritt schneiden Sie mit einem sauberen Rasiermesser ein kleines Rechteck aus trockenem PVA-Schwamm zu, das passgenau in eine 35-Millimeter-Petri-Schale passt. Führen Sie einen zusätzlichen Schnitt in den Schwamm ein, um die Platzierung der Referenzelektrode zu ermöglichen. Markieren Sie anschließend mit einem chemikalienbeständigen Stift einen kleinen Punkt auf dem Schwamm an der Stelle, an der die Larve platziert wird.Anschließend den PVA-Schwamm in Ringer-Lösung einweichen, bis er gesättigt ist. Herausnehmen und schnell zwei- bis dreimal auf einem Papierhandtuch abtupfen, bevor er in eine saubere 35-Millimeter-Petrischale gegeben wird. Danach die Petrischale mit dem Schwamm auf eine Kunststoffplattform stellen, sodass die Markierung durch die Kamera sichtbar ist.Als Nächstes chloridieren Sie die Elektroden, indem Sie sie sechs bis neun Prozent in Natriumchlorid einweichen. Anschließend trocknen Sie sie fünf Minuten lang auf einem Kim-Tuch an der Luft. Setzen Sie das Silber-Silberchlorid-Pellet der Referenzelektrode je nach Art des Schnitts in oder unter den Schwamm und verbinden Sie die Leitung der Referenzelektrode mit dem Aufnahmesystem.Befestigen Sie anschließend etwa 40 Zentimeter Schlauch an einer fünf Milliliter-Non-Lure-Lock-Spritze und füllen Sie die Spritze mit Ringer-Lösung. Danach füllen Sie eine ein-Milliliter-Non-Lure-Lock-Spritze mit Ringer-Lösung. Füllen Sie mithilfe eines Microfill vorsichtig den Mikroelektrodenhalter und vermeiden Sie die Bildung von Blasen.Danach die Fünf-Milliliter-Spritze mit dem Druckanschluss des Mikroelektrodenhalters über einen Schlauch unter Verwendung des Microfill und einer mit Ringer-Lösung gefüllten Ein-Milliliter-Spritze verbinden. Die Glas-Mikropipette von der Spitze her füllen und sicherstellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind. Anschließend die Glas-Mikropipette am Mikroelektrodenhalter befestigen und darauf achten, dass der Elektrodendraht gerade bleibt.Wenn die Befestigung erfolgt ist, verwenden Sie die Fünf-Milliliter-Spritze, um die Ringer-Lösung vorsichtig durch die Mikroelektrode zu pressen, bis eine winzige Menge der Lösung an der Spitze sichtbar ist. Setzen Sie nun die Ableitmikroelektrode vorsichtig in den Mikromanipulator ein und verbinden Sie die Leitung mit dem Ableitsystem, um das Systemrauschen zu überprüfen. Stellen Sie die Referenzelektrode und die Spitze der Ableitmikroelektrode in eine 35-Millimeter-Petri-Schale, die mit Ringer-Lösung gefüllt ist.Überprüfen Sie die elektrischen Rauschpegel der Aufbauten mit einem Oszilloskop oder einer integrierten Funktion des ERG-Geräts. Die Rauschpegel sollten nicht mehr als plus oder minus 10 Mikrovolt von der Grundlinie abweichen. Schneiden Sie in diesem Verfahren mehrere quadratische Papiertuchstücke mit einer Fläche von je einem Quadratzentimeter zu, betäuben Sie drei bis fünf Larven in einer 35-Millimeter-Petri-Schale, indem Sie Trica auf eine Endkonzentration von 0,02 % hinzufügen und eine bis zwei Minuten warten.Danach eine einzelne Larve vorsichtig unter einem Auflichtstereomikroskop mit minimaler Beleuchtung auf ein Papiertuchquadrat überführen. Die Position der Larven überprüfen und ein Exemplar auswählen, das mit der dorsalen Seite nach oben liegt und ein verdecktes Auge aufweist, für Aufnahmesitzungen, die länger als 30 Minuten dauern. Die Larve feucht halten, indem der Körper mit 3% Methylcellulose mittels eines feinen Pinsels aus Kamelhaar bestrichen wird.Überführen Sie dann das mit der Larve versehene Papiertuchquadrat auf den feuchten PVA-Schwamm. Anschließend leiten Sie einen kontinuierlichen Strom aus Wasser gesättigten 100 %igen Sauerstoffs über die Larven, indem Sie das Gas durch einen Luftsstein in einem Seitenhalskolben mit destilliertem Wasser blubbern lassen. Führen Sie den aus dem Seitenhals des Kolbens kommenden befeuchteten Sauerstoff mit Hilfe eines Schlauchs in geringer Beleuchtung nahe zum Kopf der Larve.Verwenden Sie den Mikromanipulator und die Kamera, um die Mikroelektrode in der Mitte zwischen der Nasen- und Hinterseite des Auges zu positionieren, und drücken Sie vorsichtig an die dorsale Grenze der Hornhaut. Lassen Sie die Larven sich fünf bis zehn Minuten lang an die Dunkelheit anpassen. Nehmen Sie dann die Reaktionen auf Testblitze auf, die von einer LED-Lichtquelle oder einem optischen Stimulator bereitgestellt werden.Diese Abbildung zeigt eine typische ERG-Aufzeichnung bei einem fünf Tage alten Zebrafisch-Larven. Die an die Dunkelheit angepassten Fische wurden weißen LED-Lichtreizen von 20 Millisekunden Dauer ausgesetzt, deren Intensität zwischen ein und 5.000 Candela pro Quadratmeter variierte, wobei der Lichtreiz zum Zeitpunkt null Sekunden begann. Das negative Potential, die A-Welle, ist schwer zu erkennen, während das positive Potential, die B-Welle, der dominierende Peak der Wellenform ist.Diese Einlage zeigt die gemittelten B-Wellen-Amplituden, die mithilfe der NACA-rush-Gleichung angepasst wurden. Diese Abbildung zeigt eine typische ERG-Aufzeichnung bei einem im Dunkeln adaptierten fünf Tage post Befruchtung (DPF) alten Zebrafischlarven, die mit einem PB behandelt wurden. Die Fische wurden 20 Millisekunden lang LED-Weißlicht mit Intensitäten von eins bis 5.000 Candela pro Quadratmeter ausgesetzt, und das isolierte Konusmasserezeptorpotential stellt das dominierende Element der Wellenform dar. Diese Einlage zeigt die gemittelten Antwortamplituden eines mit PB behandelten Zebrafischlarven, die mithilfe der NACA-rush-Gleichung angepasst wurden.Diese Abbildung zeigt eine typische ERG-Aufzeichnung bei einem mit fünf D-P-F-A-P-B behandelten larvalen Zebrafisch. Unter Verwendung eines Doppelblitz-Paradigmas werden die an Dunkelheit angepassten Fische aufeinanderfolgenden 20 Millisekunden langen Weißlichtblitzen ausgesetzt.LED leuchtet mit einer Intensität von 1000 Kanülen pro Quadratmeter, und das ISI zwischen den Lichtblitzen beträgt zwei Sekunden. Hier ist der Beginn jedes Lichtreizes angegeben. Diese Abbildung zeigt das Verhältnis der maximalen isolierten Antwort des Zapfen-Masserezeptorpotentials des zweiten Reizes zur Antwort des ersten Reizes in Abhängigkeit von steigendem ISI, was die fortschreitende Erholung der Photorezeptorempfindlichkeit anzeigt.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass die Qualität der Aufnahmen von der Integrität der Elektroden-Kornea-Verbindung und vom Gesundheitszustand der Larven abhängt. Die Entwicklung dieser Technik hat die Fähigkeit der Forscher in den Sehwissenschaften erheblich verbessert, die Anpassung und Erholung von Zapfen in der Wirbeltierretina in vivo zu untersuchen.

electroretinogram-analysis-of-the-visual-response-in-zebrafish-larvae

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir entwickelten die Visual-Motor Reaktion auf die Motorleistung von Larven Zebrafisch als Reaktion auf Licht-und absteigende quantifizieren. Wir untersuchten auch Zebrafisch-Mutanten Vision, einschließlich der nicht optokinetischen Reaktion (NRC) Mutanten, die vermutlich völlig blind waren, als von einer anderen Vision-Assay, der optokinetischen Reflex getestet.

A Behavioral Assay, um die Reaktionsfähigkeit der Zebrafisch zu Änderungen in Lichtintensitäten messen

Optokinetischen Reaktionen waren weit verbreitet, um die visuellen Funktionen von Larven Zebrafisch zu beurteilen. Dennoch ist das Standardprotokoll für die Fischlarven noch nicht ohne weiteres anwendbar bei...

Mit der optokinetischen Reaktion auf visuelle Funktion des Zebrafisch-Studie

Die VisioTracker ist ein automatisiertes System für die quantitative Analyse der visuellen Leistung von Larven und kleine erwachsene Fische auf der Aufzeichnung von Augenbewegungen basieren. Es verfügt über die vollständige Kontrolle über visuelle Reiz Eigenschaften und Echtzeit-Analyse und ermöglicht High-Throughput-Forschung in Bereichen wie visuelle System Entwicklung und Funktion, Pharmakologie, neuronalen Schaltkreis Studien und sensomotorische Integration.

VisioTracker, eine innovative automatisierte Ansatz zur oculomotorius Analysis

Dieses Video beschreibt den photomotorischen Response-Assay von Zebrafisch- und Dickkopf-Elritzenlarven mit einer automatisierten Tracking-Software. Das Protokoll misst die Verhaltensreaktion der Fischlarven nach einer plötzlichen Änderung der Lichtverhältnisse.

Photomotor Response Assay: Eine Methode zur Messung der Verhaltensreaktion von Zebrafischlarven auf eine plötzliche Änderung der Lichtverhältnisse

Dieses Video beschreibt den optokinetischen Reaktionstest im Zebrafisch. Das Video misst die reflexiven Augenbewegungen anhand des visuellen Bewegungsreizes und bestimmt die Sehschärfe beim Zebrafisch.

Optokinetic Response Assay: Eine Methode zur Messung der Sehschärfe bei Zebrafischen

Dieses Video demonstriert die Methode zur Untersuchung der visuellen Beuteerkennung in transgenen Zebrafischlarven unter Verwendung von Kalziumindikator-basierter Fluoreszenzbildgebung, wobei ihre Neuronen fluoreszierende Kalziumindikatorkomplexe exprimieren.

Analyse der beuteevozierten neuronalen Aktivität in einer transgenen Zebrafischlarve

Zebrafische haben ein wertvolles Werkzeug für viele Forschungsbereiche. Hier zeigen wir eine Methode, um eine visuelle Reaktion hervorzurufen und berechnen eine funktionale Sehschärfe im erwachsenen Zebrafisch.

Die optokinetischen Antwort als quantitatives Maß der Sehschärfe im Zebrafisch

Wir stellen eine effiziente Methode zur retrograden Markierung von retinalen Ganglienzellen (RGCs) in adulten Zebrafischen vor.

Retrograde Markierung von retinalen Ganglienzellen im erwachsenen Zebrafisch mit Fluoreszenzfarbstoffen

Hier stellen wir ein Protokoll für die Entwicklung und Charakterisierung eines Zebrafischmodells der Epilepsie vor, das aus der vorübergehenden Hemmung des DEPDC5-Gens resultieren.

Verhaltens- und physiologische Analyse in einem Zebrafischmodell der Epilepsie

Hier präsentieren wir eine Protokoll, die die Messung von Licht evozierten Elektroretinogramm Antworten von Larven Zebrafisch vereinfacht. Eine neuartige kegelförmige Schwamm-Tip Elektrode kann dazu beitragen, das Studium der visuellen Entwicklung im Larvenstadium Zebrafisch mit Elektroretinogramm ERG mit einfacher zuverlässige Ergebnisse und geringere Kosten.

Elektroretinogramm Aufnahme im Larvenstadium Zebrafisch mit A Roman kegelförmigen Schwamm-Tip Elektrode

Der Artikel erklärt, wie man Augen von lebenden Zebrafischlarven chirurgisch entfernt, als ersten Schritt zur Untersuchung, wie der retinale Input das Wachstum und die Entwicklung des optischen Tektums beeinflusst. Darüber hinaus enthält der Artikel Informationen über Larvenanästhesie, Fixierung und Hirndissektion, gefolgt von Immunhistochemie und konfokaler Bildgebung.

Augenentfernung in lebenden Zebrafischlarven zur Untersuchung des innervationsabhängigen Wachstums und der Entwicklung des visuellen Systems

Lernen Sie die Elektroretinographie an Zebrafisch-Larven zur Analyse der visuellen Funktion in vivo. Diese Methode ermöglicht präzise Messungen der Netzhautantworten für die Erforschung von Sehvermögen und Lichtadaptation.

Elektroretinogramm Analyse der Sicht Antwort in Zebrafisch-Larven

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