Name: Ein In-vitro- Winterruhe Model of Östrogen-sensitiven Brustkrebs im Knochenmark: Ein Werkzeug für Molecular Mechanism Studien und Hypothesengenerierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Lernen Sie ein In-vitro-Winterruhe-Modell für östrogensensitiven Brustkrebs im Knochenmark kennen. Diese Methode nutzt FGF2 und Fibronektin zur Aktivierung der Dormanz und ermöglicht die Untersuchung molekularer Mechanismen.

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1. Klonogentest <ol><li> Bereiten Sie eine Einzelzellsuspensionen von Östrogen-abhängigen Brustkrebs-Zelllinien MCF-7 und T47D-Zellen unter Verwendung der unten angegebenen Schritte, <ol><li> Saugen Sie das Kulturmedium (DMEM / 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum / Glutamin und Pen / Strep) von einer 10 cm Gewebekulturschale, die nicht mehr als 50% konfluent mit MCF-7 oder T-47D-Zellen ist. Spülen mit PBS. Inkubieren mit Trypsin 0,25% / 2,21 mM EDTA in DMEM mit hohem Glucose gelöst bei 37 ° C für 1-4 min. </li><li> Prüfzellen in 1-Minuten-Intervallen unter einem Phasenkontrastmikroskop, um eine einzelne Zellverteilung zu gewährleisten. Resuspendieren der Zellen mit einer 2 ml-Pipette durch Auf- und Abpipettieren mehrmals, um Zell-Zell-Kontakt unterbrechen, um eine fast unveränderlich, einzelne Zelle Status zu erreichen. </li><li> Weiterhin Zellen bei 37 ° C für 4 min inkubieren in Trypsin, wenn Sie Zellklumpen nach nur 2 min Inkubation zu beobachten. Verwenden Sie diese Zellen für die klonogenen Studien, wenn sie haft e bleibenach andere nach 4 min von Trypsinierung, weil Fehler in der Kolonie Nummer Ertrag eingebracht werden. HINWEIS: Wenn Zellen verklumpten, wird die Anzahl der gebildeten Kolonien des Produkts von weniger Zellen als die Anzahl inkubiert reflektieren. Wenn Zellen übermßig trypsiniert, kann ihr klonogenen Potential vermindert. </li><li> Vorbereitung einer Einzelzellsuspension von 1.500 Zellen / ml Kulturmedium für 24-Well-Platten oder weniger (+ 500 Zellen / ml, abhängig von dem Zelltyp oder einen Durchgang-Zahl), durch serielle Verdünnungen in einem Master Rohr das gesamte Volumen von Nöten alle Variablen in dem Experiment. ANMERKUNG: Das Ziel ist eine endgültige Zelldichte von 800 Zellen / cm 2 (im Bereich von ca. 500 bis 1.100 Zellen / cm 2). Das Ziel ist, auf etwa 100 + 50 Kolonien zu erhalten, die relativ einfach Zählung ermöglicht, verhindert Verdrängung und ermöglicht ausreichend Kolonien in statistisch signifikanten Differenzen im Kolonien werden erhöht oder verringert experimentellen perturbagen. </li></ol></li><li> Inkubieren Zellen bei Klonogene Density Mit skizzierten Schritte <ol><li> Zellen in vierfachen Vertiefungen auf 24-Well-Fibronektin-beschichtete Platten bei einem klonogenen Dichte von 1500 Zellen / Well von einer Master-Einzelzellsuspension Rohr von 1.500 Zellen / ml. Man reibt das Medium, das Zellen mit einer 5 ml Pipette durch Aufziehen 3 ml und Abgabe 1 ml Medium in jeder der 2 Brunnen. HINWEIS: Fibronectin-beschichteten Platten sollten gekauft vorbeschichtet werden von einem kommerziellen Anbieter. Lackplatten außerhalb eines Qualitäts gesteuert automatisierten Prozess führt zu einer unebenen Oberfläche ungeeignet für diesen Test. </li><li> Mischen Sie die Suspension durch Auf- und Abpipettieren mit einer 5 ml Pipette erarbeiten 3 ml Zellsuspension und füllen 2 Brunnen mit je 1 ml. Füllen Sie nur 2 Brunnen zu einem beliebigen Zeitpunkt von einer Pipette. Schicken Sie das Restvolumen in der Pipette zu der Zellsuspension in der Master-Rohr, Die Zellen wiederum durch Auf- und Abpipettieren und stellt weitere 3 ml, um eine andere 2 wel füllenls mit je 1 ml. HINWEIS: Das kontinuierliche Mischen des Masterrohr ist erforderlich, da Zellen kontinuierlich zu sedimentieren. Die Zusammenstellung einer ausreichenden Menge, um nur 2 Brunnen zu füllen ist notwendig, um ähnliche Zellzahlen in jede Vertiefung hinzufügen, weil Zellen sedimentieren in der Pipette als auch. </li><li> Arbeiten schnell, um die großen Mengen an Zellen zu verteilen, da ermöglicht den Zellen in Suspension bei Raumtemperatur und der CO 2 -Konzentration sitzen ihre klonogenen Potential (unveröffentlichte Beobachtungen) modulieren. </li><li> Optimieren Sie die räumliche Verteilung der Zellen während der Akt der Pipettieren sie in Brunnen für Kolonie-Assays. Dies geschieht durch langsam Pipettieren der Suspension, die die endgültige Zellkonzentration in der Mitte der Vertiefung. Die Platte, um die Bewegung weiterer Gegenstand nicht vor Zellen am Boden absetzen. Die Platte wirbeln Sie nicht, weil Kreismisch effektiv die Zellen, um den Umfang der auch die Schaffung hohe Zelldichten und unzählige konfluente Kolonien Zentrifuge bei 6 Tage. HINWEIS: wenn es nicht notwendig mischen, da dies überhaupt nach der Einführung die Lautstärke mit den Zellen in Suspension weniger wünschenswert als keine Vermischung. Wenn es notwendig ist, um Zellen zu mischen, dies durch Bewegen der Platte vor und zurück in senkrechten Richtungen, während es auf einer flachen Oberfläche aufliegt. </li><li> Zellen bei 37 ° C 5% CO 2 inkubieren ohne Medienwechsel für 6 Tage. Die geringe Zahl von Zellen in einem Bohrloch nach 6 Tagen nicht signifikant beeinflussen den Nährstoff oder Zytokin Zusammensetzung noch den pH-Wert des Originalmediums. </li><li> Entwerfen der zeitliche Verlauf des Assays wie folgt: Zellen, die auf Fibronectin beschichteten Substrate am Tag 1. Inkubieren Ersetzen bestehender Medium mit 1 ml frischem Medium oder frischer Medium enthaltend FGF-2 10 ng / ml am Tag 0 Stain-Zellen am Tag 6 nach unten in 1.4). Durchzuführen keine experimentellen Störungen an Tag 3, wie unten in 1.3). </li></ol></li><li> Einrichten Experimental Störungen der molekularen Signal oder Adhäsionsmoleküle <ol><li> An Tag 3 werden 10056; l einer Lösung, die 10-fach von dem geplanten Konzentration der störenden Mittels zu dem 1 ml Medium in den Vertiefungen. Nicht zu verwechseln. Weiterhin die Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für weitere 3 Tage inkubiert. HINWEIS: Stören Mittel können eine Vielzahl von Inhibitoren und Blockierungsmittel Adhäsionsmoleküle, Rezeptoren oder andere Oberflächenproteine, Inhibitoren der intrazellulären Signalwegen, Moleküle, Faktoren, Co-Faktoren oder strukturellen Proteinen, die Rollen bei der Unterstützung des Ruhezustand spielen können, umfassen. </li><li> Flecken Kolonien am Tag 6, wie folgt. </li></ol></li><li> Stain Colonies <ol><li> Flecken Zellen nach 6 Tagen in Kultur mit einer frisch hergestellten 0,1% Kristallviolett in 2% Ethanol / 10 mM Natriumborat (pH 9,0) Lösung. Saugen Sie Medien und fügen Sie eine ml Kristallviolett-Lösung in jede Vertiefung für 20 Minuten. </li><li> Waschplatten, indem sie mit den Öffnungen nach unten und in einem spitzen Winkel in einem Eiskübel überfüllt mit kontinuierlich fließendem LeitungseintauchenWasser in der Spüle. Kippen Sie die Platte an einem horizontalen Winkel einmal unter Wasser, auch die Öffnung nach unten und dann nach hinten neigen, um einen spitzen Winkel beim Entfernen in einem sanften fließenden Bewegung. </li><li> Wiederholen der Eint 2 oder 3 mal, bis das Wasser auf dem Boden der Vertiefungen ist nicht mehr blau. Kräftiges Waschen kann Zellen oder Kolonien, die aufgrund der experimentellen Eingriff weniger haft sind, was eine um wesentlich zu dem Fehler in Zählung und der Daten. </li><li> Dry Platten über Nacht, indem sie den Kopf auf Handtücher auf der Tischplatte angrenzend an die entsprechenden markierten Abdeckungen. </li></ol></li><li> Graf Colonies <ol><li> Zählen die Anzahl der wachsenden und ruhenden Kolonien in jeder Vertiefung nach 6 Tagen Inkubation Färbung und Trocknen. Graf Kolonien optimal bei 40-facher Vergrößerung in einem umgekehrten Phasenkontrastmikroskop. Zählen Kolonien von&gt; 30 Zellen wachsen und Kolonien von 12 Zellen oder weniger, mit dem morphologischen Erscheinungsbild sehr groß im Vergleich zum Züchten von Zellen, große expaNDED Cytoplasma mit großen Cytoplasma in Verhältnissen, die in 1 gezeigten Kern 7,15. HINWEIS: Cluster von 13 bis 29 Zellen werden in der Regel nicht gezählt, da sie nicht sehr häufig in einfachen Ruhe Assays. Sie können angerechnet werden, wenn Störungen verschieben das Wachstumspotenzial der entweder wachsen oder ruhenden Zellen. Diese Ergebnisse müssen dann mit biologischer Bedeutung korreliert werden. </li></ol></li></ol> 2. Klonogene Inkubation für Immunfluoreszenz-Studien <ol><li> Einzustellen Zellzahlen ungefähr 7,500-8,000 Zellen / Vertiefung in Platten mit 6 Vertiefungen zu entsprechen Nummern / Oberfläche analog 24 Vertiefungen Experimente Zelle. </li><li> Platzieren Sie einen runden, sterile, Fibronektin-beschichtete Deckglas in jede Vertiefung Basis des 6-Well-Platten für die bildgebenden Untersuchungen vor der Zelle hinaus. Pipette Zellen in 3 ml Volumina in jede Vertiefung 2 Vertiefungen in einer Zeit in Konzentrationen ausgeführt, wie bei den obigen Experimenten klonogenen in 1.2 beschrieben). </li><li> Inkubieren Zellenfür 6 Tage, wie oben in 1.2.4 und 1.2.5. Hinzuzufügen Störfaktoren am Tag 3 bei 10-facher Konzentration in 300 ul-Volumina, wie sie in den Kolonie-Assay-Verfahren in 1.3 beschrieben). </li><li> Stain-Zellen am Tag 6 mit Antikörpern gegen Adhäsionsmoleküle wie Integrine α4, α5, α6, β1, β3 zB focal adhesion komplexe Moleküle FAK, paxillin und Vinculin Zelle, zum Beispiel, Proteine ​​der Motilität beteiligt, wie α-Tubulin B. Signalweg Elemente, wie Phospho-Akt, Phospho-ERK, Phospho-p38, Phospho-JNK, zum Beispiel, oder jedes andere Protein, das das Ziel der Untersuchung für seine Rolle in der Ruhe ist, unter Verwendung von Standard-Techniken zur direkten oder indirekten Immunfluoreszenzfärbung. <ol><li> Folien mit einer Pinzette entfernen Tag 6. Fix in Aceton / Methanol 1: 1 bei -20 ° C für 20 min und der Luft trocknen. Eine alternative Fixiermittel wie Paraformaldehyd, verwendet werden, falls erforderlich. Permeabilisieren Zellen mit 0,1% Triton X-100, 0,1% Natriumcitrat 2 min foder den Nachweis von intrazellulären Antigenen. Zellen mit PBS waschen. </li><li> Für indirekte immunofluorecence Färbung Blockobjektträger 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 5% BSA oder mit 10% Serum vor der Immunisierung von der Spezies, in welcher der sekundäre Antikörper erzeugt wurde. </li><li> Inkubieren über Nacht bei 4 ° C mit primären Antikörpern gegen Adhäsionsmoleküle Brenn komplexe Moleküle Zelle Signalweg Elemente oder andere Protein, das das Ziel der Untersuchung für seine Rolle in der Ruhe auf spezifische Verdünnungen vom Hersteller empfohlenen Verdünnung in PBS 0,1% Triton X -100. </li><li> Mit PBS waschen 3 Mal. Deckgläser mit Fluorophor-konjugierten Antikörpern Inkubieren bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Als ein Beispiel kann Alexa Fluor 488 Esel Anti-Maus-IgG-Antikörper verwendet, um Maus monoklonalen primären Antikörper nachzuweisen. Berg Deckgläser Zellseite nach unten auf Glasobjektträger unter Verwendung eines Antifade Mittel mit DAPI. Verschließen Sie die Umfänge mit Nagellack. </li><li> Für direkte Immunfluoreszenz, die Durchführung der BSAwie oben in 2.4.2) Blockieren, Inkubation mit Fluorophor-konjugierte primäre Antikörper über Nacht bei 4 ° C. Mit PBS waschen 3 Mal. Inkubieren Sie die Objektträger mit einer Antifade Mittel und Dapi und Dichtung mit Nagellack. </li><li> Schutzglasschalen mit Aluminiumfolie und bei 4 ° C für die Bildgebung und Fotografie jederzeit bis zu mehreren Wochen später. Ansehen und Foto-Zellen unter Verwendung beliebiger fluoreszenzmikroskopischen Bildgebungssysteme mit einer Kamera ausgestattet an 1,000x Vergrößerung. </li><li> Für fibrilläres Aktinfärbung Block gleitet in 1% Rinderserumalbumin (BSA) für 30 Minuten und Inkubieren in BODIPY FL-Phallacidin (grün) oder Rhodamin-Phalloidin (rot) bei Raumtemperatur für 20 min. Fügen Sie einen Antifade Mittel und Dichtung wie oben. </li></ol></li></ol> 3. Klonogene Inkubation für Molekulare Studien <ol><li> Western Blots <ol><li> Inkubieren ER + Brustkrebszellen MCF-7 oder T47D auf klonogenen Dichten von 20.000 Zellen / 60 mm Platte und 50.000 Zellen / 100 mm Platte auf fibronecZinn-beschichteten Platten bei 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> Inkubieren Zellen bei etwas höheren Dichte von 75.000 Zellen / 100 mm Platte für molekulare Studien erfordern mg Mengen für Protein aus Lysaten. Verwenden Sie bis zu zehn Platten pro Versuchspunkt, um ausreichend Protein für molekulare Studien unter Verwendung von Western-Blots oder für RNA-Isolierung für Northern Blots zu sammeln. </li><li> Zellzahl anhand Gelbeladung ist eine notwendige Ergänzung für den Vergleich der Proteinexpression in beträchtlichem Ausmaß unterschiedlich große wachsenden und ruhenden Zellen. Sammle die Zellen durch Trypsinisierung und zählen ein Aliquot in einem Hämozytometer in 0,2% Trypan Blau zur Herstellung von Lysaten für Westernblots statt Abschaben der Zellen mit einer einzigen Kante Klinge. </li><li> Centrifuge Zellen bei 10.000 × g für 2 Minuten, entfernen Medien durch Aspiration, fügen Sie 200 ul Lysepuffer, beschallen die Zellen in Lysepuffer und bestimmen die Proteinkonzentration. </li><li> Berechnen der Menge an Protein pro Zelle durch Teilen der Proteinausbeute durch die Anzahl der Zellendaß die Menge erzeugt. Laden des Lysates in jede Vertiefung einer separaten Polyacrylamidgelen, die sowohl a) äquivalente Mengen des Proteins, und b) Proteinmengen, die äquivalente Zellzahlen darstellt. Mindestens 25 ug Protein sollte in jede Vertiefung geladen. Hinweis: das Vergleichen zwischen wachsenden oder ruhenden Zellen, die in der Größe und der Proteingehalt (Figur 1) sind signifikant verschieden zu ermöglichen. </li></ol></li><li> Durchflusszytometrie <ol><li> Sammeln Zellen von 100-mm-Platten durch Trypsinierung, wie in 3.1 und analysiert durch Standardfluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) Protokolle, die primäre oder sekundäre Immunfluoreszenzfärbung für entweder intrazelluläre oder extrazelluläre Antigene, wie in Abschnitt 2.4 beschrieben. HINWEIS: Abnehmen Zellen aus Gewebekulturplatten durch Trypsinisierung beeinflußt nicht die Konzentration von Membranproteinen, wie durch Antikörpermarkierung bestimmt. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Unterstützt durch das Department of Defense Grants DAMD17-01-C-0343 und DAMD17-03-1-0524, die New Jersey State Kommission für Cancer Research 02-1140-CCR-E0 und der Ruth Estrin Goldberg Memorial für Krebsforschung (RW)

Unser Modell besteht aus mehreren Schlüsselelemente der Vegetationsruhe im Knochenmark besteht. Es besteht aus Östrogen empfindlichen Zellen, die die Art wahrscheinlich ruhend im Mark längere Zeiträume 10 zu bleiben, sie besteht aus Fibronectin, einem wichtigen Strukturelement der Mark, FGF-2, ein Wachstumsfaktor reichlich durch die Knochenmarkstroma synthetisierten und stark in der extrazellulären Matrix von Knochenmark 31,32 und Inkubation der Zellen bei klonogenen Dichte wo ihre Wechselwirkungen...

Brustkrebszellen zu metastasieren in das Knochenmark vor der Erkrankung nachweisbar 1, sobald kleine Tumore entwickeln Blutgefße 2,3. Die metastasierendem Verfahren ist schnell, aber ineffizient. Zellen, geben Sie die neuen Blutgefäße schnell, zu Millionen pro Tag 4, aber nur wenige überleben die Reise zu entfernten Organen 5. Dennoch gibt es einige Mikrometastasen zu überleben in den Knochen und kann als einzelne Zellen oder kleine Zellklumpen in Knochenmarkaspirate von neu diagnostizierten Patienten 1 gefunden werden. Diese Zellen wider adjuvante Chemotherapie, die für den Zweck der Beseitigung von ihnen 6 verabreicht wird. Dieser Widerstand wird dotiert, im Wesentlichen durch das Überleben Signalisierung durch Wechselwirkungen mit dem Knochenmark-Mikroumgebung 7,8 eingeleitet. Mikrometastasen in etwa ein Drittel der Frauen mit lokalem Brustkrebs gefunden werden und stellen ein unabhängiges Indikator für das Überleben, wenn sie von univariaten Analyse 9 analysiert. Einige micrometastases sind Wachstum eingeleitet, aber Wiederholungsmuster sind abhängig von Zelltyp. Patienten mit triple negativem Brustkrebs neigen dazu, zwischen 1 bis 4 Jahre wiederkehren, was auf schlechte Kontrolle über die schlafenden Zustand. Andere Zelltypen, einschließlich ER / PR + Zellen können für bis zu 20 Jahre ruhend bleiben, mit einem stetigen, kontinuierlichen Rezidivrate 10. Während Unterschiede in der Keimruhe Genexpressionssignaturen zwischen ER + und ER- Brustzelllinien und Tumoren spiegeln unterschiedliche Ruhepotentiale 11, Interaktionen mit Knochenmarkstroma wahrscheinlich einen bedeutenden Beitrag zur Keimruhe. Das Studium der Keimruhe in vivo ist außerordentlich schwierig, weil Mikrometastasen sind selten und werden zahlenmäßig von blutbildenden Zellen um mehr als 10 6 -fach. Daher müssen entsprechende Modelle erzeugt werden, die in-vitro-Daten, die Mechanismen vorschlagen, und erzeugen überprüfbare Hypothesen in vivo unterbieten sind. Eine Reihe von Ruhe Modelle, darunter matheatika Modelle 12,13, in-vitro-Modellen 7,8,14,15, in vivo-Xenotransplantat-Modelle 16, Kombinationen von in vitro und Xenotransplantatmodellen 17,18 und spontaner Tumormetastasen und Modelle 19, haben einen Einblick in Krebszellruhe 20 ergab . Jedes dieser Modelle haben ihre eigenen Grenzen und sind von sich selbst in erster Linie sinnvoll zur Erzeugung von Hypothesen zur molekularen Signal und Interaktionen, die Ruhephase, um in mehr biologisch relevanten Modellen getestet werden regieren. Mit dem Gesamtziel definiert, die molekularen Mechanismen der Keimruhe, die Wechselwirkungen mit der Mikroumgebung, die in Zyklusarrest, Redifferenzierung und Therapieresistenz und Mechanismen führt, die in Rückfällen bei ER + Zellen führen, ein in vitro-Modell, das ausgewählt relevanten Elemente der bietet entwickelten wir Stroma-Mikroumgebung 7. Dieses Modell, während in seiner Kompo relativ spärlichenten, ist robust genug, um die Ermittler zu ermöglichen, spezifische molekulare Mechanismen, die signifikante Funktionen der Keimruhe beeinträchtigen abzuleiten. Diese Experimente erzeugen Hypothesen, die direkt in vivo getestet werden können. Das Modell stützt sich auf einige Schlüsselelemente, die wir gezeigt, in Keimruhe relevant. Sie umfassen die Verwendung von Östrogen-abhängigen Brustkrebs-Zellen, der Kultur von Zellen in einem klonogenen Dichte wo ihre Wechselwirkung ist hauptsächlich mit der Erde und die löslichen Bestandteile des Mediums, einer Fibronektin-Substrat und das Vorhandensein von basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF-2) im Medium. Wir gekennzeichnet Mechanismen, die das System in vitro regeln, einschließlich der Induktion von Zellzyklusarrest von FGF-2 21, durch TGFß 22 vermittelt wird, das Überleben Signalgebung durch PI3 Kinase ERK 7,8 und 8 und morphogenic Differenzierung zu einer epithelialen Phänotyp, die auf abhing RhoA Inaktivierung Integrin45; 5β1 Hochregulierung und die Ligation von Stromazellen Fibronektin Überleben 7,15 (Abbildung 1). Die in-vitro-Zellzykluseffekte von FGF-2 auf die MCF-7 Zellen beginnen bei Konzentrationen mindestens einer Protokoll unter 10 ng / ml 21,23. Die Begründung wurde auf die zeitliche Steuerung von FGF-2-Expression über Brust-duktales Morphogenese, zyklische Expansion und Rezession in einer Reihe von Säugetiersystemen 24-27 basiert. Wir haben gezeigt, dass FGF-2 induziert die Differenzierung, einschließlich duktalen Morphogenese in 3D-Kultur 28, und dass FGF-2-Expression in der Regel verlor mit malignen Transformation von menschlichen Tumoren 29. Die Expression von FGR1 blieb intakt in befragten 29 und MCF-7 Zellen Mammakarzinomen weiterhin alle 4 FGF-Rezeptoren 30 zum Ausdruck bringen. Im Kontext der Dormanz wird FGF-2 durch exportiert und stark auf Knochenmarkstroma 31,32, wo es bei der Konservierung von Blutstammzellen 33 fungiert abgeschieden. Wir DMonstrated, dass FGF-2 induziert einen Ruhezustand in ER + Brustkrebszellen zu Fibronektin Substraten, auch im Knochenmark, wo es morphogenic Differenzierung 7 induziert reichlich kultiviert. Im Modell Brustkrebszellen sind Wachstum gehemmt wird, inaktivieren Rho A durch die RhoGap GRAF, Redifferenzierung zu einer epithelialen Phänotyp und Re-express Integrine α5β1 lost mit malignen Progression. Sie binden Fibronektin durch Integrin α5β1 und aktiviere das Überleben signalisiert, dass sie resistent gegen zytotoxischen Therapie 7,8,15 (Abbildung 1) zu machen. Hemmung der Rho-GTPasen Klasse wurde bereits gezeigt, dass eine Ruhe Phänotyp 34 induzieren. Hier werden wir die spezifischen Verfahren, die Ermittler erlauben wird, um das Modell zu etablieren und zu studieren spezifischen molekularen und zellulären Mechanismen, die Ruhephase der ER + Brustkrebszellen zu skizzieren. In den Experimenten hier dargestellt, um die Verwendung des Modells veranschauGezielte wir den PI3K-Weg (1B) mit einem Akt-Inhibitor und einem PI3K-Inhibitor und alle Mitglieder der Rho-Familie (1B) mit einem pan-Rho-Inhibitor und einem Rho-Kinase (ROCK) Inhibitor.

<table><tbody><tr><td>MCF-7 Zellen</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>T47D Zellen &nbsp;</td><td>ATCC</td><td>HTB-123</td><td></td></tr><tr><td>BD BioCoat Fibronektin 24 Well Clear Flat Bottom TC-behandelte Multiwell-Platte</td><td>Corning</td><td>354411</td><td></td></tr><tr><td>BD BioCoat Fibronektin 60 mm Kulturschalen</td><td>Corning</td><td>354403</td><td></td></tr><tr><td>BD BioCoat Fibronektin 100 mm Kulturschalen</td><td>Corning</td><td>354451</td><td></td></tr><tr><td>BD BioCoat 22x22mm #1 Glasdeckglas mit gleichmäßiger Applikation von humanem Fibronektin</td><td>Corning</td><td>354088</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Gewebekulturplatte</td><td>CellTreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Pulver</td><td>Corning Life Sciences</td><td>50-013-PB</td><td></td></tr><tr><td>Hitzeinaktiviertes, fötales Rinderserum</td><td>Serum Source International</td><td>FB02-500HI</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsin/2,21 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin, 100x, flüssiges</td><td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>rekombinantes humanes FGF&nbsp; Grundlegende</td><td>Forschung und Entwicklung D Systems</td><td>234-FSE-025</td><td></td></tr><tr><td>Akt-Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-o-octadecyl-sn-glycerocarbonat)</td><td>CalBiochem</td><td>124005</td><td></td></tr><tr><td>LY294002&nbsp;</td><td>CalBiochem</td><td>19-142</td><td>Chenischer PI3K-Inhibitor</td></tr><tr><td>C3-Transferase&nbsp;</td><td>Das Zytoskelett</td><td>CTO3</td><td>hemmt RhoA, RhoB und RhoC, aber nicht verwandte GTPasen wie Cdc42 oder Rac1</td></tr><tr><td>Y-27632 Dihydrochlorid&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>129830-28-2</td><td></td></tr><tr><td>BODIPY FL-Phallacidin (grün)&nbsp;</td><td>Molekulare Sonden</td><td>B607</td><td>Fluorochrom für die fibrilläre Aktinfärbung</td></tr><tr><td>BODIPY FL-Rhodamin Phalloidin (rot)&nbsp;</td><td>Molekulare Sonden</td><td>R415</td><td>Fluorochrom für die fibrilläre Aktinfärbung</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Esel Anti-Maus IgG Antikörper, ReadyProbes Reagenz&nbsp;</td><td>Molekulare Sonden</td><td>R37114</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Eindeckmittel mit DAPI&nbsp;</td><td>Molekulare Sonden</td><td>P-36931</td><td></td></tr></tbody></table>

ein<em&gt; in-vitro-</em&gt; winterruhe model of Östrogen-sensitiven brustkrebs im knochenmark: ein werkzeug für molecular mechanism studien und hypothesengenerierung

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

Die Untersuchung der Brustkrebs-Ruhephase im Knochenmark ist aufgrund der Komplexität der Wechselwirkungen ruhender Zellen mit ihrer Mikroumgebung, ihrer Seltenheit und des überwältigenden Überschusses an hämatopoetischen Zellen ein außerordentlich schwieriges Unterfangen. Zu diesem Zweck haben wir ein in vitro 2D-klonogenes Modell der Dormanz von östrogenempfindlichen Brustkrebszellen im Knochenmark entwickelt. Das Modell besteht aus einigen Schlüsselelementen, die für die Ruhephase notwendig sind. Dazu gehören 1) die Verwendung von östrogenempfindlichen Brustkrebszellen, die wahrscheinlich über längere Zeiträume inaktiv bleiben, 2) die Inkubation von Zellen mit klonogener Dichte, bei der die strukturelle Interaktion jeder Zelle hauptsächlich mit dem Substrat erfolgt, 3) Fibronektin, ein Schlüsselstrukturelement des Knochenmarks und 4) FGF-2, ein Wachstumsfaktor, der von Knochenmarkstromazellen reichlich synthetisiert und stark in der extrazellulären Matrix abgelagert wird. Zellen, die mit FGF-2 inkubiert wurden, bilden nach 6 Tagen ruhende Klone, die aus 12 oder weniger Zellen bestehen, die ein ausgeprägtes flaches Aussehen haben, deutlich größer und breiter verteilt sind als wachsende Zellen und ein großes Verhältnis von Zytoplasma zu Zellkern aufweisen. Im Gegensatz dazu bilden Zellen, die ohne FGF-2 inkubiert werden, hauptsächlich wachsende Kolonien, die aus >30 relativ kleinen Zellen bestehen. Störungen des Systems mit Antikörpern, Inhibitoren, Peptiden oder Nukleinsäuren am Tag 3 nach der Inkubation können verschiedene phänotypische und molekulare Aspekte der ruhenden Zellen nach 6 Tagen signifikant beeinflussen und können verwendet werden, um die Rolle von membranlokalisierten oder intrazellulären Molekülen, Faktoren oder Signalwegen auf den Ruhezustand oder das Überleben ruhender Zellen zu beurteilen. Unter Berücksichtigung des In-vitro-Charakters des Assays kann er als äußerst nützliches Werkzeug fungieren, um wichtige Informationen über die molekularen Mechanismen zu erhalten, die für die Etablierung und das Überleben ruhender Zellen erforderlich sind. Diese Daten können verwendet werden, um Hypothesen zu generieren, die in vivo-Modellen getestet werden können.

<html> Experimente wurden durchgeführt, um den Test zu wiederholen. Der Zeitverlauf des Experiments ist in 2A gezeigt. Die Zellen werden bei klonogenen Dichte am Tag -1 inkubiert wird FGF-2 in frischem Medium am Tag 0 gegeben und die Zellen werden bis zum Tag 6 kultiviert, wenn sie gefärbt sind, und die Kolonien gezählt. Jegliche Störungen in das System werden am Tag 3 in 100 ul-Volumina bei 10-facher Endkonzentration verabreicht gewünscht. 2B veranschaulicht das typische Erscheinungsbil...

Wir haben ein in vitro Modell der Dornanz im Knochenmark für östrogenempfindliche Brustkrebszellen entwickelt. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Verwendung des Modells für die Untersuchung der Molekular- und Zellbiologie der Ruhephase und für die Generierung von Hypothesen für nachfolgende Tests in vivo zu demonstrieren.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Winterruhe Model of Östrogen-sensitiven Brustkrebs im Knochenmark: Ein Werkzeug für Molecular Mechanism Studien und Hypothesengenerierung

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, dieses in-vitro-Dormanzmodell anzuwenden, um molekulare und zelluläre Mechanismen zu untersuchen und Hypothesen zu generieren, die in biologisch komplexeren in-vivo-Modellen getestet werden können. Dies wird erreicht, indem östrogenpositive Brustkrebszellen in fibrinbeschichteten Gewebekulturplatten bei konfluenter Dichte kultiviert werden, wodurch ihre Wechselwirkungen hauptsächlich mit dem Substrat und nicht miteinander erfolgen. In einem zweiten Schritt wird ein Ruhestadium in einigen der östrogenpositiven Zellen induziert und durch FGF2 sowie Fibronectin aufrechterhalten, was repräsentativ für Brustkrebszellen im Knochenmark ist.Anschließend wird das System durch Zugabe von Antikörpern, Inhibitoren, Peptiden oder Nukleinsäuren gestört, um verschiedene phänotypische und molekulare Aspekte der ruhenden Zellen zu beeinträchtigen und deren Rolle bei der Aufrechterhaltung des Ruhestadiums zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigen die Anzahl und das Erscheinungsbild wachsender und ruhender Kolonien, die nach der Behandlung inkubierter Zellen mit FGF zwei auf mit Fibronectin beschichteten Platten entstehen. Diese Methode kann dabei helfen, herauszufinden, welche Signalwege, Adhäsionsmoleküle oder anderen spezifischen molekularen Mechanismen für die Entwicklung und Aufrechterhaltung der Ruhephase in östrogenabhängigen Brustkrebszellen verantwortlich sind, die sich im Mikroumfeld des Knochenmarks befinden.Entfernen Sie zunächst das Kulturmedium von Platten, die zu etwa 50 % mit CF7-Zelllinien konfluent sind, und waschen Sie sie mit vorgewärmtem PBS. Geben Sie dann ein Milliliter 0,25 %ige Trypsin-EDTA-Lösung, gelöst in DMEM mit hohem Glucosegehalt und ohne fetalen Kälberserum, hinzu. Inkubieren Sie die Platten eine bis vier Minuten bei 37 °C, bis die Zellen beginnen, sich zu lösen. Sobald sich die Zellen von der Platte gelöst haben und eine Einzelzell-Suspension bilden, lösen Sie verbleibende Zellklumpen durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren mit einer 2-mL-Pipette auf. Falls Zellklumpen nach vier Minuten Trypsin-Behandlung weiterhin bestehen, entsorgen Sie die Zellen und bereiten Sie neue Kulturzellen vor, da Zellen, die nach vier Minuten noch aneinander haften, voraussichtlich Fehler bei der Zählung der Kolonieanzahl verursachen. Plattieren Sie die trypsinierten Zellen und resuspendieren Sie sie mit 1.500 Zellen pro Milliliter in Kulturmedium. Mischen Sie die Zellsuspension mit einer 5-mL-Pipette vorsichtig durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Zählen Sie die Zellen und überprüfen Sie mithilfe eines automatisierten Zellzählgeräts, dass die Suspension hauptsächlich aus Einzelzellen besteht.Dies kann auch manuell mit einer Zählkammer unter einem Phasenkontrastmikroskop durchgeführt werden. Anschließend drei Milliliter der Zellsuspension aufziehen und je einen Milliliter gleichzeitig in zwei Vertiefungen einer 24-Loch-Platte mit Fibronectin-Beschichtung geben. Um die räumliche Verteilung der Zellen zu optimieren, sollte die Suspensionspipettierung in die Mitte der Vertiefung erfolgen, und die Platte darf nicht weiter bewegt werden, bevor sich die Zellen abgesetzt und angeheftet haben.Geben Sie die verbleibende Zellsuspension in die Hauptzellmischung zurück und mischen Sie die Zellen erneut, bevor Sie weitere drei Milliliter ansaugen. Dieses Verfahren verringert die Variabilität der Zellanzahl, da sich die Zellen kontinuierlich im Reagenzglas absetzen, und die Pipettierarbeit schnell erfolgt, um große Volumina an Zellen zu verteilen, da das Stehenlassen der Zellen in Suspension bei Raumtemperatur und CO2-Konzentration ihr kongenes Potenzial beeinflusst. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Dieser Zeitpunkt gilt als Tag minus eins.Im Zeitverlauf des Experiments. Am Tag null des Assays ersetzen Sie das Medium durch ein Milliliter frisches Medium oder frisches Medium, das 10 Nanogramm pro Milliliter Fibroblastenwachstumsfaktor enthält. Die geringe Anzahl von Zellen in einem Well nach sechs Tagen hat keinen signifikanten Einfluss auf die Zusammensetzung der Nährstoffe oder Zytokine und nicht auf den pH-Wert des ursprünglichen Mediums.Am dritten Tag 100 µL einer Lösung hinzufügen, die 10× der endgültigen gewünschten Konzentration eines Störfaktors enthält, beispielsweise einen PI3-Kinase-Inhibitor, LY 294 002, einen negativen Kontrollstoff LY 303 511 oder eine Mediumkontrolle, zu dem bereits in den Vertiefungen enthaltenen ein Milliliter Medium, und die Lösungen durch Diffusion vermischen lassen. Die Platte am sechsten Tag erneut in den Inkubator stellen und für weitere drei Tage inkubieren. 0,1 % Kristallviolett in einer Lösung aus zwei Prozent Ethanol und 10 Millimolar Natriumborat lösen.Bei einem pH-Wert von neun saugt anschließend das Medium aus den Vertiefungen ab und gibt je einen Milliliter der Kristallviolett-Lösung in jede Vertiefung für 20 Minuten hinzu. Richten Sie eine Spülstation ein, indem Sie einen Eisbehälter in das Spülbecken stellen und kontinuierlich Wasser in den Behälter laufen lassen; spülen Sie die Platten, indem Sie sie mit den Vertiefungsöffnungen in einem spitzen Winkel nach unten gerichtet in das Wasser eintauchen. Kippen Sie die Platte unter Wasser in eine horizontale Position, sodass die Vertiefungsöffnungen nach unten zeigen.Danach kippen Sie die Platte zurück in einen spitzen Winkel und nehmen Sie sie in einer sanften, fließenden Bewegung heraus. Wiederholen Sie das Eintauchen zwei oder drei Mal, bis das Wasser am Boden der Vertiefungen nicht mehr blau erscheint. Anschließend stellen Sie die Platten verkehrt herum auf Papierhandtücher auf der Laborbank, um sie über Nacht trocknen zu lassen.Nach dem Trocknen die Platte unter ein aufrechts stehendes Phasenkontrastmikroskop stellen und die Anzahl der wachsenden und ruhenden Kolonien in jeder Vertiefung zählen. Bei 40-facher Vergrößerung Kolonien mit mehr als 30 Zellen als wachsend und Kolonien mit 12 oder weniger Zellen als ruhend zählen. Dargestellt ist das typische Erscheinungsbild einer wachsenden und einer ruhenden Kolonie.Wachsende Kolonien enthalten mehr als 30 Zellen, ruhende Kolonien hingegen 12 oder weniger Zellen, die vielfach größer sind als wachsende Zellen und ein großes Cytoplasma-zu-Kern-Verhältnis aufweisen, und zwar ohne Zugabe von FGF zwei zur Kultur. Die Kolonien bestehen überwiegend aus wachsenden Klonen. Während in Gegenwart von FGF zwei die überwiegende Mehrheit der Klone ruht, können auch die Wirkungen zusätzlicher Wirkstoffe mithilfe dieses Systems bewertet werden. Hier wurden am dritten Tag des Congenic-Assays zwei störende Wirkstoffe in zuvor bestimmten Konzentrationen den Vertiefungen hinzugefügt.Die Abbildung zeigt eine bevorzugte Hemmung ruhender Klone durch den PI3-Kinase-Inhibitor LY294002, jedoch keine Wirkung durch das negative Kontrollmittel LY303511. Solche Experimente können dazu beitragen, die Faktoren zu verstehen, die die Ruhephase und die Therapieresistenz steuern. Hier verloren die überlebenden ruhenden Zellen nach Behandlung mit dem PI3-Kinase-Inhibitor ihr ausgebreitetes Erscheinungsbild, wurden klein und dendritisch und wiesen Anzeichen von Stress auf.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man diesen konogenen Assay zur Kultivierung ruhender Zellen etabliert, wie man die Zellen stören kann, indem man nach der Etablierung der Ruhephase spezifische Inhibitoren oder Störstoffe hinzufügt, und wie man die Wirkung dieser Störstoffe quantifiziert. Mithilfe dieses Assays lassen sich sowohl quantitative als auch qualitative Ergebnisse erfassen, indem man ruhende Kolonien zählt oder eine Vielzahl ultrastruktureller, immunphänotypischer oder molekularer Ereignisse in den ruhenden und gestörten Zellen misst. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Eine modifizierte 3-D in vitro-System vorgestellt, bei der Wachstumseigenschaften von mehreren Tumorzelllinien in rekonstituierte Basalmembran mit dem ruhenden oder proliferative Verhalten der Tumorzellen in einer metastatischen sekundären Standort...

Ein In Vitro System zur Tumor Vegetationsruhe und die Umstellung auf Metastasen Study

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Patientenbasierte Xenograft-Modelle (PDX) und transplantierbare gentechnisch veränderte Mausmodelle rekapitulieren menschliche Krankheiten originalgetreu und sind bevorzugte Modelle für die grundlegende und translationale Brustkrebsforschung. Hier wird eine Methode beschrieben, Brusttumorfragmente orthotopisch in das Brustfettpolster zu transplantieren, um die Tumorbiologie zu untersuchen und die Arzneimittelreaktion zu bewerten.

Orthotope Transplantation von Brusttumoren als präklinische Modelle für Brustkrebs

Crosstalk zwischen Brustepithelzellen und Endothelzellen trägt wesentlich zum Fortschreiten von Brustkrebs, Tumorwachstum und Metastasierung bei. In dieser Studie wurden Sphäroide aus Brustkrebszellen zusammen mit vaskulären und/oder lymphatischen Endothelzellen hergestellt und demonstrieren ihre Anwendbarkeit als In-vitro-System für die Brustkrebsforschung.

Brustepithel- und Endothelzell-Sphäroide als potenzielles funktionelles In-vitro-Modell für die Brustkrebsforschung

Lernen Sie ein In-vitro-Winterruhe-Modell für östrogensensitiven Brustkrebs im Knochenmark kennen. Diese Methode nutzt FGF2 und Fibronektin zur Aktivierung der Dormanz und ermöglicht die Untersuchung molekularer Mechanismen.

Ein In-vitro- Winterruhe Model of Östrogen-sensitiven Brustkrebs im Knochenmark: Ein Werkzeug für Molecular Mechanism Studien und Hypothesengenerierung (Video) | JoVE Journal

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