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Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, dieses in-vitro-Dormanzmodell anzuwenden, um molekulare und zelluläre Mechanismen zu untersuchen und Hypothesen zu generieren, die in biologisch komplexeren in-vivo-Modellen getestet werden können. Dies wird erreicht, indem östrogenpositive Brustkrebszellen in fibrinbeschichteten Gewebekulturplatten bei konfluenter Dichte kultiviert werden, wodurch ihre Wechselwirkungen hauptsächlich mit dem Substrat und nicht miteinander erfolgen. In einem zweiten Schritt wird ein Ruhestadium in einigen der östrogenpositiven Zellen induziert und durch FGF2 sowie Fibronectin aufrechterhalten, was repräsentativ für Brustkrebszellen im Knochenmark ist.

Anschließend wird das System durch Zugabe von Antikörpern, Inhibitoren, Peptiden oder Nukleinsäuren gestört, um verschiedene phänotypische und molekulare Aspekte der ruhenden Zellen zu beeinträchtigen und deren Rolle bei der Aufrechterhaltung des Ruhestadiums zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigen die Anzahl und das Erscheinungsbild wachsender und ruhender Kolonien, die nach der Behandlung inkubierter Zellen mit FGF zwei auf mit Fibronectin beschichteten Platten entstehen. Diese Methode kann dabei helfen, herauszufinden, welche Signalwege, Adhäsionsmoleküle oder anderen spezifischen molekularen Mechanismen für die Entwicklung und Aufrechterhaltung der Ruhephase in östrogenabhängigen Brustkrebszellen verantwortlich sind, die sich im Mikroumfeld des Knochenmarks befinden.

Entfernen Sie zunächst das Kulturmedium von Platten, die zu etwa 50 % mit CF7-Zelllinien konfluent sind, und waschen Sie sie mit vorgewärmtem PBS. Geben Sie dann ein Milliliter 0,25 %ige Trypsin-EDTA-Lösung, gelöst in DMEM mit hohem Glucosegehalt und ohne fetalen Kälberserum, hinzu. Inkubieren Sie die Platten eine bis vier Minuten bei 37 °C, bis die Zellen beginnen, sich zu lösen.

Sobald sich die Zellen von der Platte gelöst haben und eine Einzelzell-Suspension bilden, lösen Sie verbleibende Zellklumpen durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren mit einer 2-mL-Pipette auf. Falls Zellklumpen nach vier Minuten Trypsin-Behandlung weiterhin bestehen, entsorgen Sie die Zellen und bereiten Sie neue Kulturzellen vor, da Zellen, die nach vier Minuten noch aneinander haften, voraussichtlich Fehler bei der Zählung der Kolonieanzahl verursachen. Plattieren Sie die trypsinierten Zellen und resuspendieren Sie sie mit 1.500 Zellen pro Milliliter in Kulturmedium. Mischen Sie die Zellsuspension mit einer 5-mL-Pipette vorsichtig durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Zählen Sie die Zellen und überprüfen Sie mithilfe eines automatisierten Zellzählgeräts, dass die Suspension hauptsächlich aus Einzelzellen besteht.

Dies kann auch manuell mit einer Zählkammer unter einem Phasenkontrastmikroskop durchgeführt werden. Anschließend drei Milliliter der Zellsuspension aufziehen und je einen Milliliter gleichzeitig in zwei Vertiefungen einer 24-Loch-Platte mit Fibronectin-Beschichtung geben. Um die räumliche Verteilung der Zellen zu optimieren, sollte die Suspensionspipettierung in die Mitte der Vertiefung erfolgen, und die Platte darf nicht weiter bewegt werden, bevor sich die Zellen abgesetzt und angeheftet haben.

Geben Sie die verbleibende Zellsuspension in die Hauptzellmischung zurück und mischen Sie die Zellen erneut, bevor Sie weitere drei Milliliter ansaugen. Dieses Verfahren verringert die Variabilität der Zellanzahl, da sich die Zellen kontinuierlich im Reagenzglas absetzen, und die Pipettierarbeit schnell erfolgt, um große Volumina an Zellen zu verteilen, da das Stehenlassen der Zellen in Suspension bei Raumtemperatur und CO2-Konzentration ihr kongenes Potenzial beeinflusst. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Dieser Zeitpunkt gilt als Tag minus eins.

Im Zeitverlauf des Experiments. Am Tag null des Assays ersetzen Sie das Medium durch ein Milliliter frisches Medium oder frisches Medium, das 10 Nanogramm pro Milliliter Fibroblastenwachstumsfaktor enthält. Die geringe Anzahl von Zellen in einem Well nach sechs Tagen hat keinen signifikanten Einfluss auf die Zusammensetzung der Nährstoffe oder Zytokine und nicht auf den pH-Wert des ursprünglichen Mediums.

Am dritten Tag 100 µL einer Lösung hinzufügen, die 10× der endgültigen gewünschten Konzentration eines Störfaktors enthält, beispielsweise einen PI3-Kinase-Inhibitor, LY 294 002, einen negativen Kontrollstoff LY 303 511 oder eine Mediumkontrolle, zu dem bereits in den Vertiefungen enthaltenen ein Milliliter Medium, und die Lösungen durch Diffusion vermischen lassen. Die Platte am sechsten Tag erneut in den Inkubator stellen und für weitere drei Tage inkubieren. 0,1 % Kristallviolett in einer Lösung aus zwei Prozent Ethanol und 10 Millimolar Natriumborat lösen.

Bei einem pH-Wert von neun saugt anschließend das Medium aus den Vertiefungen ab und gibt je einen Milliliter der Kristallviolett-Lösung in jede Vertiefung für 20 Minuten hinzu. Richten Sie eine Spülstation ein, indem Sie einen Eisbehälter in das Spülbecken stellen und kontinuierlich Wasser in den Behälter laufen lassen; spülen Sie die Platten, indem Sie sie mit den Vertiefungsöffnungen in einem spitzen Winkel nach unten gerichtet in das Wasser eintauchen. Kippen Sie die Platte unter Wasser in eine horizontale Position, sodass die Vertiefungsöffnungen nach unten zeigen.

Danach kippen Sie die Platte zurück in einen spitzen Winkel und nehmen Sie sie in einer sanften, fließenden Bewegung heraus. Wiederholen Sie das Eintauchen zwei oder drei Mal, bis das Wasser am Boden der Vertiefungen nicht mehr blau erscheint. Anschließend stellen Sie die Platten verkehrt herum auf Papierhandtücher auf der Laborbank, um sie über Nacht trocknen zu lassen.

Nach dem Trocknen die Platte unter ein aufrechts stehendes Phasenkontrastmikroskop stellen und die Anzahl der wachsenden und ruhenden Kolonien in jeder Vertiefung zählen. Bei 40-facher Vergrößerung Kolonien mit mehr als 30 Zellen als wachsend und Kolonien mit 12 oder weniger Zellen als ruhend zählen. Dargestellt ist das typische Erscheinungsbild einer wachsenden und einer ruhenden Kolonie.

Wachsende Kolonien enthalten mehr als 30 Zellen, ruhende Kolonien hingegen 12 oder weniger Zellen, die vielfach größer sind als wachsende Zellen und ein großes Cytoplasma-zu-Kern-Verhältnis aufweisen, und zwar ohne Zugabe von FGF zwei zur Kultur. Die Kolonien bestehen überwiegend aus wachsenden Klonen. Während in Gegenwart von FGF zwei die überwiegende Mehrheit der Klone ruht, können auch die Wirkungen zusätzlicher Wirkstoffe mithilfe dieses Systems bewertet werden. Hier wurden am dritten Tag des Congenic-Assays zwei störende Wirkstoffe in zuvor bestimmten Konzentrationen den Vertiefungen hinzugefügt.

Die Abbildung zeigt eine bevorzugte Hemmung ruhender Klone durch den PI3-Kinase-Inhibitor LY294002, jedoch keine Wirkung durch das negative Kontrollmittel LY303511. Solche Experimente können dazu beitragen, die Faktoren zu verstehen, die die Ruhephase und die Therapieresistenz steuern. Hier verloren die überlebenden ruhenden Zellen nach Behandlung mit dem PI3-Kinase-Inhibitor ihr ausgebreitetes Erscheinungsbild, wurden klein und dendritisch und wiesen Anzeichen von Stress auf.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man diesen konogenen Assay zur Kultivierung ruhender Zellen etabliert, wie man die Zellen stören kann, indem man nach der Etablierung der Ruhephase spezifische Inhibitoren oder Störstoffe hinzufügt, und wie man die Wirkung dieser Störstoffe quantifiziert. Mithilfe dieses Assays lassen sich sowohl quantitative als auch qualitative Ergebnisse erfassen, indem man ruhende Kolonien zählt oder eine Vielzahl ultrastruktureller, immunphänotypischer oder molekularer Ereignisse in den ruhenden und gestörten Zellen misst. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.