Die Quantifizierung der neurovaskulären Schutz Nach Repetitive hypoxische Präkonditionierung und Transient mittleren Hirnarterie Occlusion in Mice

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Neuroprotektion nach wiederholter Hypoxie-Präkonditionierung oder RHP zu quantifizieren, indem gleichzeitig das Infarktvolumen und die Integrität der Blut-Hirn-Schranke gemessen werden. Dies wird erreicht, indem Mäuse neun stochastischen Hypoxie-Expositionen ausgesetzt werden, die sich sowohl in Dauer als auch in Intensität unterscheiden, um einen neurovaskulären Schutz vor Schlaganfall zu vermitteln. Anschließend wird bei der Maus ein Schlaganfall induziert und eine Injektion mit Evans-Blau gefolgt.

Evan's Blue bindet selektiv Albumin und ermöglicht die Quantifizierung einer Blut-Hirn-Schranke-Störung nach Injektion und anschließender Tötung des Tieres. Das Gehirn wird entnommen und mit TTC gefärbt, um das Infarktvolumen zu quantifizieren. Die Ergebnisse zeigen neuroprotektive Vorteile einer wiederholten hypoxischen Präkonditionierung bei Mäusen nach ischämischem Schlaganfall.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Hypoxie-Vorbehandlung mit einzelner Exposition besteht darin, dass RHP bei Mäusen eine Neuroprotektion für mindestens acht Wochen bewirkt. Diese duale Quantifizierungsmethode kann zentrale Fragen in der Schlaganforschung beantworten, beispielsweise wie Infarctvolumina gleichzeitig bei einer Blut-Hirn-Schranke-Störung gemessen werden können. Obwohl diese Methode Einblicke in den ischämischen Schlaganfall ermöglichen kann, lässt sich RHP auch auf andere entzündliche Erkrankungen des zentralen Nervensystems sowie systemische entzündliche Zustände anwenden. Zunächst teilen Sie die Mäuse in zwei Gruppen ein.

Die RHP-Gruppe, die Sauerstoffkonzentrationen von 8 % und 11 % ausgesetzt ist, sowie die Kontrollgruppe, die zeitgleich 21 % Sauerstoff erhält, entfernen den oberen Filterdeckel jedes Käfigs und stellen den Käfig mit intakten Futter- und Wasserflaschen in die jeweils mit den entsprechenden Sauerstoffflaschen verbundenen Kammern. Schließen und sichern Sie den Kammerdeckel. Öffnen Sie das Hauptgasventil der Flaschen, und stellen Sie den anfänglichen Durchfluss für jede Induktionskammer auf zwei Liter pro Minute (LPM) ein.

Nach fünf Minuten der Exposition verringern Sie die Durchflussrate für den Rest der Exposition auf einen Liter pro Minute. Am Ende der Exposition reduzieren Sie den Durchfluss auf null Liter pro Minute und schließen das Gasventil. Für die Tanks.

Öffnen Sie die Kammerdeckel und ersetzen Sie den Filterdeckel an jedem Käfig. Stellen Sie die Käfige bis zur nächsten hypoxischen Exposition in die Standardhaltung. Sprühen Sie jede Induktionskammer nach jedem Gebrauch mit einem Desinfektions- und Geruchsbeseitigungsmittel ab.

Exponieren Sie sowohl RHP- als auch Kontrollmäuse zu der gleichen Tageszeit im Verlauf der zwei Wochen des Protokolls. Führen Sie dann eine transiente Okklusion der mittleren zerebralen Arterie oder A-T-M-C-A-O wie im Text beschrieben durch. Die EB-Injektion sollte 22 Stunden nach der Reperfusion erfolgen und zwei Stunden vor der NTTC-Färbung im Blutkreislauf zirkulieren.

Bereiten Sie die für die Injektion benötigte Menge EB vor. Ziehen Sie dann die gewünschte Menge Raumtemperatur in eine 0,3-cc-Insulinspritze auf. Mit einer 29-Gauge-Nadel fixieren Sie die Maus mithilfe eines flachen Halterungsgeräts.

Halten Sie den Schwanz so, dass die Seitenvene oben liegt. Die Seitenvenen befinden sich auf beiden Seiten der Mittellinie des Schwanzes. Halten Sie die Schwanzspitze fest, um die Maus während der Injektion stabil zu halten.

Führen Sie die Nadel etwa drei bis fünf Millimeter in die Vene ein. Achten Sie darauf, die Vene nicht zu durchbohren, und injizieren Sie die gesamte Farblösung über einen Zeitraum von einer Minute. Wenn die Lösung in die Vene gelangt, sollte beim Anlegen von Druck auf die Spritze ein geringer Widerstand spürbar sein.

Überprüfen Sie eine erfolgreiche systemische venöse Verabreichung von EB anhand einer sofortigen Farbveränderung an den Hintergliedmaßen und Augen der Maus. Entfernen Sie die Nadel aus dem Schwanz und üben Sie vorsichtig Druck mit sauberem Mull aus, um die Blutung zu stoppen. Beginnen Sie mit der Zeitmessung.

Wenn die Haut der Maus blau wird, lassen Sie das EB zwei Stunden lang zirkulieren, um die geschwächte Blut-Hirn-Schranke zu durchdringen. Die Perfusion und TTC-Färbung sollten 24 Stunden nach Reperfusion, also 24 Stunden nach T-M-C-A-O und zwei Stunden nach der Verabreichung von EB, erfolgen. Töten Sie das Tier mit einer Überdosis Isofluran in einer kleinen Induktionskammer. Die Perfusion sollte unmittelbar nach der Tötung beginnen, um die Autolyse zu minimieren, die nach dem Sauerstoffentzug infolge des Todes einsetzt.

Fixieren Sie das Tier schnell auf einer Styroporplatte, wobei die Vordergliedmaßen durch die Pfoten festgepinnt sind. Führen Sie einen seitlichen Schnitt durch die Bauchdecke von der Mittellinie ausgehend direkt unterhalb des Rippenbogens durch. Durchtrennen Sie vorsichtig das Zwerchfell, um das Herz freizulegen.

Starten Sie die Perfusionspumpe mit einer Flussrate von fünf Millilitern pro Minute unter Verwendung einer 60-cc-Spritze, die mit eiskaltem 0,01-molarem, phosphatgepuffertem Kochsalzlösungsmittel oder PBS gefüllt ist und an eine 27-Gauge-Flügelinfusionsnadel angeschlossen ist. Führen Sie die Nadelspitze etwa 0,5 Zentimeter in den linken Ventrikel des Herzens ein und schneiden Sie das rechte Atrium auf. Während der Perfusion sollte sich allmählich verdünntes venöses Blut aus dem Atrium herausbewegen, bis venöses Blut sichtbar wird. Farbloses transkardiales perfundiertes 30 Milliliter 0,01-molares PBS werden durch das Herz geleitet.

Fügen Sie anschließend fünf Milliliter TTC-Lösung in transparente 20-ml-Scintillationsfläschchen hinzu. Unmittelbar nach der Perfusion werden die Tiere entkopft und die Gehirne gegebenenfalls mit kleinen Scheren und einem Spatel präpariert. Überprüfen Sie, ob das dem okkludierten Arteria-cerebri-media-Gebiet gegenüberliegende Hemisphäre blass erscheint, ohne erkennbares EB-Austritts oder Ödeme.

Geben Sie als Nächstes PBS in eine Acryl-Hirnmatrix, die zur Herstellung von 1,0 Millimeter dicken koronaren Schnitten eines Maushirns konzipiert ist. Legen Sie das Gehirn mit der dorsalen Seite nach oben in die Matrix und gießen Sie unverzüglich PBS über das Gehirn. Halten Sie das Gehirn feucht.

Entfernen Sie die Riechkolben, indem Sie eine Klinge aus rostfreiem Stahl mit einer Dicke von 0,21 Millimetern in den zweiten Schlitz von der rostralen Seite der Matrix einführen. Entfernen Sie dann das Kleinhirn, indem Sie eine Klinge in den vierten Schlitz von der kaudalen Seite der Matrix einführen. Führen Sie eine Klinge in den mittleren Schlitz der verbleibenden Schlitze in der Matrix ein.

Danach die verbleibenden Klingen gleichmäßig so einsetzen, dass sie das restliche Gewebe halbieren, um eine möglichst gleichmäßige Verteilung des Gewebes während des Schneidens sicherzustellen. Sobald alle Klingen eingefügt wurden, ein bis zwei Tropfen PBS auf das Gehirn geben, um es anzufeuchten. Entfernen Sie anschließend die Klingen nacheinander von der Matrix, beginnend mit der rostralen Region.

Behalten Sie die ersten sieben Schnitte für die TTC-Analyse. Nach T-M-C-A-O verwenden Sie einen kleinen Spatel, um die Schnitte vorsichtig von der Klinge in das mit TTC gefüllte Gefäß zu überführen. Sobald alle Schnitte im Gefäß sind, verschließen Sie es und stellen es in ein warmes Wasserbad, bis die Schnitte rosa gefärbt sind.

Drehen Sie die Flasche bei Bedarf vorsichtig im Bad, um eine Überlappung der Schnitte zu vermeiden, die zu einer ungleichmäßigen Färbung führen könnte. Entsorgen Sie anschließend das TTC und geben Sie eine 4%ige Paraformaldehydlösung in das Gefäß, um die Gehirnschnitte zu bedecken. Dadurch wird die TTC-Chemikalienreaktion beendet.

Ordnen Sie die Schnitte unverzüglich auf einer sauberen Glasscheibe mit den Maßen 2,5 cm × 7,6 cm an und richten Sie sie in kaudaler Richtung aus, sobald sie auf dem Objektträger liegen. Scannen Sie den Objektträger. Verwenden Sie einen Standard-Scanner und stellen Sie eine Auflösung von mindestens 600 DPI für die Bildanalyse ein.

Stellen Sie sicher, dass der Name des Tieres und ein metrisches Lineal im gescannten Bild enthalten sind. Drehen Sie schließlich das Objektträger um und scannen Sie die Rückseite, um sicherzustellen, dass alle Daten erfasst wurden. RHP reduziert die Infarktvolumina um 46 % im Vergleich zu Kontrollmäusen, hat jedoch keine Wirkung auf die hemisphärische Schwellung, die aus den TTC-Daten derselben Tiere abgeleitet wurde.

RHP verringert die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke, definiert als Evans-Blau-Austritt, normiert auf die kontralaterale Hemisphäre, repräsentative TTC-Färbungen sowohl aus der RHP-behandelten als auch der 21 % Sauerstoff ausgesetzten Kontrollgruppe. Die Mäuse sind mit den entsprechenden Infarktvolumina und dem unten angegebenen Evans-Blau-Austritt für jede Probe dargestellt. Ipsilateral bezeichnet die ischämische Hemisphäre des Gehirns, kontralateral die nicht betroffene Seite des Gehirns.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, Evan's Blau 22 Stunden nach der Fusion zu injizieren und es zwei Stunden zirkulieren zu lassen, bevor das Tier nach der Entwicklung geopfert wird. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der präklinischen Schlaganforschung den Weg, um Mechanismen des endogenen Schutzes vor Schlaganfällen bei Mäusen zu untersuchen. Nach Anschauung dieses Videos sollten Sie ein klares Verständnis dafür haben, wie die neuroprotektive Wirkung von RHP durch die doppelte Quantifizierung der Integrität der Blut-Hirn-Schranke und der Infarktvolumina gemessen werden kann.