Die Quantifizierung der neurovaskulären Schutz Nach Repetitive hypoxische Präkonditionierung und Transient mittleren Hirnarterie Occlusion in Mice

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Neuroprotektion nach repetitiver Hypoxie-Präkonditionierung (RHP) zu quantifizieren, indem gleichzeitig das Infarktvolumen und die Integrität der Blut-Hirn-Barriere gemessen werden. Dies wird erreicht, indem Mäuse neun stochastischen Hypoxie-Expositionen ausgesetzt werden, die sich sowohl in Dauer als auch in Intensität unterscheiden, um einen neurovaskulären Schutz vor einem Schlaganfall zu bieten. Dann wird bei der Maus ein Schlaganfall induziert und anschließend Evans blaue Injektion durchgeführt.

Evan's Blue bindet selektiv Albumin und ermöglicht die Quantifizierung der Störung der Blut-Hirn-Schranke nach der Tötung des Tieres nach der Injektion. Das Gehirn wird entnommen und mit TTC gefärbt, um das Infarktvolumen zu quantifizieren. Die Ergebnisse zeigen neuroprotektive Vorteile der repetitiven Hypoxie-Präkonditionierung bei Mäusen nach ischämischem Schlaganfall.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der hypoxischen Einzelexpositions-Präkonditionierung besteht darin, dass RHP bei Mäusen mindestens acht Wochen lang Neuroprotektion erzeugt. Diese duale Quantifizierungsmethode kann Schlüsselfragen in der Schlaganfallforschung beantworten, z. B. wie das Infarktvolumen bei einer Störung der Blut-Hirn-Schranke gleichzeitig gemessen werden kann. Obwohl diese Methode verwendet werden kann, um Einblicke in den ischämischen Schlaganfall zu erhalten, kann RHP auch auf andere ZNS-basierte und systemische proinflammatorische Krankheitszustände angewendet werden. Teilen Sie die Mäuse zunächst in zwei Gruppen auf.

Die RHP-Gruppe, die gleichzeitig einer Exposition von 8 % und 11 % Sauerstoff ausgesetzt ist, und die Kontrollgruppe, die eine Exposition von 21 % Sauerstoff erhält, entfernen den oberen Filterdeckel jedes Käfigs und setzen den Käfig mit intakten Futter- und Wasserflaschen in die Kammern ein, die mit ihren jeweiligen Sauerstofftanks verbunden sind. Schließen und verriegeln Sie den Deckel der Kammer. Öffnen Sie das Hauptgasventil für die Tanks und stellen Sie den Anfangsdurchfluss für jede Induktionskammer auf zwei Liter pro Minute oder LPM ein.

Reduzieren Sie die Durchflussrate nach fünf Minuten Exposition für den Rest der Exposition auf ein LPM. Reduzieren Sie am Ende der Exposition den Durchfluss auf null LPM und schließen Sie das Gasventil. Für die Panzer.

Öffnen Sie die Kammerdeckel und setzen Sie den oberen Filterdeckel auf jeden Käfig auf. Stellen Sie die Käfige bis zur nächsten hypoxischen Exposition in ein Standardgehäuse. Sprühen Sie jede Induktionskammer nach jedem Gebrauch mit einem Desinfektions- und Desodorierungsmittel ein.

Setzen Sie sowohl RHP- als auch Kontrollmäuse während der zwei Wochen des Protokolls zur gleichen Tageszeit aus. Führen Sie dann einen vorübergehenden Verschluss der mittleren Hirnarterie oder A-T-M-C-A-O durch, wie im Text beschrieben. Die EB-Injektion sollte 22 Stunden nach der Reperfusion durchgeführt werden und zwei Stunden lang im Blutkreislauf zirkulieren, bevor die NTTC-Färbung geopfert wird.

Bereiten Sie die Menge an EB vor, die für die Injektion benötigt wird. Ziehen Sie dann die gewünschte Menge Raumtemperatur in eine 0,3 ml Insulinspritze. Halten Sie die Maus mit einer 29-Gauge-Nadel mit einem Rückhaltesystem mit flachem Boden fest.

Halte den Schwanz so, dass die Seitenvene nach oben zeigt. Laterale Venen befinden sich auf beiden Seiten der Mittellinie des Schwanzes. Halten Sie die Spitze des Schwanzes fest, um die Maus für die Injektion ruhig zu halten.

Führen Sie die Nadel etwa drei bis fünf Millimeter in die Vene ein. Achten Sie darauf, die Vene nicht zu perforieren, und injizieren Sie den gesamten Farbstoff im Laufe einer Minute. Wenn die Lösung in die Vene gelangt, sollte ein minimaler Widerstand vorhanden sein, wenn Druck auf die Spritze ausgeübt wird.

Bestätigen Sie die erfolgreiche systemische venöse Verabreichung von EB durch eine sofortige Farbveränderung in den Schwanzgliedmaßen und Augen der Maus. Entfernen Sie die Nadel vom Schwanz und üben Sie vorsichtig Druck mit sauberer Gaze aus, um die Blutung zu stoppen. Beginnen Sie mit dem Timing.

Wenn sich die Haut der Maus blau verfärbt, lassen Sie das EB zwei Stunden lang zirkulieren, um die geschwächte Blut-Hirn-Schranke zu durchdringen. Perfusion und TTC-Färbung sollten 24 Stunden nach der Reperfusion erfolgen, 24 Stunden nach T-M-C-A-O und zwei Stunden nach EB-Verabreichung das Tier mit einer isof-Fluor-Überdosis in einer kleinen Induktionskammer töten. Die Perfusion sollte unmittelbar nach der Tötung beginnen, um die Autolyse zu minimieren, die nach dem Tod in Abwesenheit von Sauerstoff beginnt.

Sichern Sie das Tier schnell auf einer Styroporplattform mit den Unterarmen, die durch die Pfoten gesteckt werden. Schneiden Sie einen seitlichen Schnitt durch die Bauchdecke von der Mittellinie direkt unter dem Brustkorb. Schneiden Sie vorsichtig durch das Zwerchfell, um das Herz freizulegen.

Starten Sie die Perfusionspumpe mit einer Durchflussrate von fünf Millilitern pro Minute mit einer 60-cm³-Spritze, die mit eiskalter 0,01 molar phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS gefüllt ist und an eine geflügelte 27-Gauge-Infusionsnadel angeschlossen ist. Platzieren Sie die Nadelspitze etwa 0,5 Zentimeter in der linken Herzkammer und schneiden Sie den rechten Vorhof. Während der Perfusion sollte progressiv verdünntes venöses Blut aus dem Vorhof fließen, bis venöses Blut entsteht. Farblos trans cardio e perfundierte 30 Milliliter 0,01 molare PBS durch das Herz.

Geben Sie anschließend fünf Milliliter TTC-Lösung in transparente 20-Szintillationsflaschen. Enthaupten Sie die Tiere unmittelbar nach der Perfusion und sezieren Sie die Gehirne bei Bedarf mit einer kleinen Schere und einem Spatel. Prüfen Sie, ob die Hemisphäre kontralateral zur verschlossenen mittleren Hirnarterie blass erscheint, ohne dass EB-Leckagen oder Ödeme erkennbar sind.

Als nächstes verwandelte sich das arme PBS in eine Acryl-Gehirnmatrix, die entwickelt wurde, um 1,0 Millimeter dicke koronale Schnitte eines Mäusegehirns herzustellen. Legen Sie die dorsale Seite des Gehirns nach oben in die Matrix und gießen Sie sofort PBS über das Gehirn. Halten Sie das Gehirn feucht.

Entfernen Sie die Riechkolben, indem Sie eine 0,21 Millimeter dicke Klinge aus Edelstahl in den zweiten Schlitz von der rostralen Seite der Matrix einführen. Entfernen Sie dann das Kleinhirn, indem Sie eine Klinge in den vierten Schlitz der verwöhnten Seite der Matrize einführen. Führen Sie eine Klinge in den mittleren Schlitz der verbleibenden Schlitze in der Matrize ein.

Führen Sie dann die restlichen Klingen gleichmäßig ein und halbieren Sie das verbleibende Gewebe, um eine möglichst gleichmäßige Verteilung des Gewebes während des Schneidens zu gewährleisten. Sobald alle Klingen eingeführt sind, geben Sie ein bis zwei Tropfen PBS in das Gehirn, um es zu befeuchten. Entfernen Sie als Nächstes die Klingen nacheinander aus der Matrix, beginnend mit der rostralen Region.

Bewahren Sie die ersten sieben Schichten für die TTC-Analyse auf. Nach T-M-C-A-O die Scheiben vorsichtig mit einem kleinen Spatel von der Klinge in das mit TTC gefüllte Fläschchen übertragen. Nachdem sich alle Teile in der Durchstechflasche befinden, verschließen Sie sie und legen Sie sie in ein warmes Wasserbad, bis die Abschnitte rosa werden.

Drehen Sie die Flasche bei Bedarf vorsichtig in der Badewanne, um eine Überlappung des Abschnitts zu vermeiden, die zu ungleichmäßigen Flecken führen könnte. Entsorgen Sie dann das TTC und gießen Sie eine 4%ige Paraformaldehydlösung in das Fläschchen, um die Gehirnabschnitte zu bedecken. Dadurch wird die chemische Reaktion TTC beendet.

Ordnen Sie die Abschnitte sofort auf einem sauberen, drei x drei Zoll großen Glasobjektträger an und richten Sie die Abschnitte von rostral nach verhätschelt aus, wenn die Abschnitte auf der Folie angeordnet sind. Scannen Sie die Folie. Stellen Sie bei Verwendung eines Standardscanners die Auflösung für die Bildanalyse auf mindestens 600 DPI ein.

Achten Sie darauf, den Namen des Tieres und ein metrisches Lineal in das gescannte Bild aufzunehmen. Drehen Sie abschließend die Folie um und scannen Sie die Rückseite, um sicherzustellen, dass alle Daten gesammelt wurden. RHP reduziert das Infarktvolumen um 46 % im Vergleich zu Kontrollmäusen, hat aber keinen Einfluss auf die hemisphärische Schwellung, die aus den TTC-Daten bei denselben Tieren abgeleitet wurde.

RHP reduziert die Störung der Blut-Hirn-Schranke, wie sie durch das Evans-Blau-Leck definiert wird, das auf die für die kontralaterale Hemisphäre repräsentative TTC-Färbungen sowohl bei RHP-behandelten als auch bei 21 % sauerstoffexponierten Kontrollen normiert ist. Die Mäuse sind mit den entsprechenden Infarktvolumina und dem Evans-Blau-Leck dargestellt, das hier unter jeder Probe aufgeführt ist. Ipsilateral ist die ischämische Hemisphäre des Gehirns und kontralateral ist die nicht betroffene Seite des Gehirns.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, Evan's Blue 22 Stunden nach der Fusion zu injizieren und es zwei Stunden lang zirkulieren zu lassen, bevor das Tier nach seiner Entwicklung getötet wird. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der präklinischen Schlaganfallforschung, um Mechanismen des endogenen Schutzes vor Schlaganfällen bei Mäusen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein klares Verständnis davon haben, wie Sie die neuroprotektive Wirkung von RHP durch die duale Quantifizierung der Integrität der Blut-Hirn-Schranke und des Infarktvolumens messen können.