Eine preiswerte, skalierbare Behavioral Assay zur Messung von Ethanol Sedierung Empfindlichkeit und Rapid Toleranz in Drosophila

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Empfindlichkeit gegenüber Ethanol-Sedierung bei Fruchtfliegen zu bewerten. Dies wird erreicht, indem Fliegen in Fläschchen gelegt und mit Ethanoldampf belastet werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Anzahl der Fliegen zu bestimmen, die in jedem Fläschchen zu wiederkehrenden Zeitpunkten sediert werden, bis alle Fliegen sediert sind.

Als nächstes wird der Zeitpunkt interpoliert. Wenn 50 % der Fliegen für jedes Fläschchen sediert werden, zeigen die Ergebnisse einen Index der Zeit, die benötigt wird, um Fruchtfliegen mit Ethanol zu sedieren. Simran Sindu, ein Student in meinem Labor, wird dieses Verfahren heute demonstrieren. Zu Beginn des Experiments sammeln Sie Fliegen in Fläschchen mit frischen Lebensmitteln in Gruppen von 11 Personen eines Geschlechts für bis zu fünf Minuten CO2 und lassen Sie die Fliegen über Nacht in Lebensmittelfläschchen in einem umweltkontrollierten Raum erholen.

Bereiten Sie die Ethanollösung vor, indem Sie reines 100%iges Ethanol in gereinigtem Wasser auf eine Endkonzentration von 85% verdünnen. Lassen Sie die Lösung über Nacht wieder auf Raumtemperatur zurückkehren, bevor der Assay durchgeführt wird. Bereiten Sie ein sauberes, leeres Lebensmittelfläschchen vor, das als Testfläschchen dient. Ein neuer Celluloseacetat-Stopfen, ein Silikonstopfen und ein Milliliter Ethanollösung für jedes zu testende Fläschchen stellen die Raumtemperatur auf 20 bis 25 Grad Celsius und die relative Luftfeuchtigkeit auf 55 bis 65 % einBestimmen Sie einen anderen Arbeiter, der jeder Gruppe von Fläschchen einen eindeutigen Code zuweist, und notieren Sie den Code, um später codierte Fläschchen mit Fliegen im Testraum zu platzieren, um sich einige Minuten lang zu akklimatisieren. Beschriften Sie als Nächstes die leeren Testfläschchen so, dass sie mit den Codes auf den Fly-Fläschchen übereinstimmen.

Erstellen Sie ein Testprotokoll in Papierform, indem Sie die Codes in Spalten mit einer Spalte pro Fläschchen in einer Tabelle eingeben. Verwenden Sie das Testprotokoll als Leitfaden. Ordnen Sie die codierten Lebensmittelfläschchen mit Fliegen und die leeren Testfläschchen in passenden Arrays im Testraum an, übertragen Sie die Fliegen aus den Lebensmittelfläschchen nacheinander in die passenden und beschrifteten Testfläschchen.

Führen Sie dann sofort Celluloseacetat-Stopfen in die Testfläschchen ein, bis sich die Celluloseacetat-Stopfen zwei Zentimeter unter den Fläschchendeckeln befinden. Für die Zeit Null Bewertung. Fassen Sie jedes Fläschchen einzeln mit Daumen und Zeigefinger.

Klopfen Sie dreimal vorsichtig auf den Tisch, um die Fliegen auf den Boden des Fläschchens zu klopfen. Warten Sie 30 Sekunden und zählen Sie die Anzahl der Fliegen, die unbeweglich und/oder tot sind. Notieren Sie jeweils die Anzahl der unbeweglichen toten Fliegen für jedes Fläschchen.

Null Minuten im Testprotokoll in Papierform. Starten Sie den Timer bei Null und fügen Sie sofort einen Milliliter Ethanol zum Celluloseacetat hinzu. Lässt sich in kreisenden Bewegungen im Fünf-Sekunden-Intervall für den ersten Satz von vier Fläschchen in der Bestellung einstecken.

Sie werden getestet, wenn das Ethanol in alle vier Testfläschchen des Sets gegeben wurde. Führen Sie in jede Durchstechflasche einen Silikonstopfen ein, um sie nach 1, 2, 3, 4 und fünf Minuten zu verschließen. Geben Sie einen Milliliter Ethanol in den zweiten, dritten, vierten, fünften und sechsten Satz von jeweils vier Durchstechflaschen.

Fahren Sie mit dem Einsetzen von Silikonstopfen fort, nachdem Sie Ethanol zu jedem Satz von vier Durchstechflaschen LS nach sechs Minuten hinzugefügt haben. Testen Sie den ersten Satz von vier Fläschchen, indem Sie jedes Fläschchen mit einem Daumen und einem Zeigefinger greifen und dreimal vorsichtig auf den Tisch klopfen, um die Fliegen auf den Boden des Fläschchens zu schlagen. Warten Sie 30 Sekunden, zählen und notieren Sie dann die Gesamtzahl der Fliegen, die sediert sind.

Score Fliegen gelten als sediert, wenn sie erstens auf dem Boden des Fläschchens stehen, aber nicht laufen, oder zwei auf dem Rücken liegen, mit oder ohne Flügelschlag. Behandeln Sie jedes Fläschchen innerhalb des Sets in Fünf-Sekunden-Intervallen nach diesem Zeitplan. 7, 8, 9, 10 und 11 Minuten.

Testen Sie den zweiten, dritten, vierten, fünften und sechsten Satz Fläschchen wie beim ersten Satz nach 12 Minuten. Testen Sie den ersten Satz von vier Durchstechflaschen erneut und setzen Sie den Test des zweiten, dritten, vierten, fünften und sechsten Satzes von Durchstechflaschen nach 13, 14, 15, 16 bzw. 17 Minuten fort. Testen Sie die Fliegen weiter, bis sie alle sediert sind.

Geben Sie die Gesamtzahl der Fliegen in jedem Fläschchen im Hardcopy-Test ein. Log-Sensor unbewegliche oder tote Fliegen zum Zeitpunkt Null von der Gesamtzahl der Fliegen. Die Rohdaten aus dem Ethanol-Sedierungsassay wurden in den Prozentsatz der aktiven Fliegen als Funktion der Zeit umgerechnet.

Die Sensitivität gegenüber der Ethanol-Sedierung aus den Primärdaten wurde als Sedierungszeit 50 oder ST 50 quantifiziert. Die Zeit, die benötigt wird, bis 50 % der Fliegen sediert werden oder unter der Kurve oder einem UC liegen. Der Assay weist die Auswirkungen von RNAi gegen Calnexin 14 D im Nervensystem nach, was die Ethanolempfindlichkeit im Vergleich zu Kontrollen, die Mutation von Schorf und Aufrütteln, die erhöhte Empfindlichkeit der Ethanol-Sedierung und die Mutation der Happy Hour abschwächte. Abstumpfte Empfindlichkeit der Ethanol-Sedierung im Vergleich zu Kontrollen Einmal gemeistert.

Diese Technik kann in eineinhalb Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.