Name: Automatisierte Gel Größenauswahl, um die Qualität der nächsten Generation Sequencing Libraries von Umweltwasserproben vorbereitet verbessern (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 26 s
Description: Erfahren Sie die automatisierte Gel-Größenauswahl zur Verbesserung von Next-Generation-Sequencing-Bibliotheken aus Umweltwasserproben. Diese Methode ermöglicht Hochdurchsatz-DNA-Reinigung mit präziser Fragmentselektion.

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Diese Arbeit wurde von Genome BC, Genome Canada und Coastal Genomics finanziert. Die Autoren danken Kirby Cronin und Michael Chan für ihre Hilfe bei der Probenentnahme und -verarbeitung. Wir möchten uns auch bei Thea Van Rossum und Dr. Fiona Brinkman für die Unterstützung bei der Bioinformatik bedanken.

1. Wassersammlung und Filtration <ol><li> Sammeln Süßwasserproben von verschiedenen Standorten (Abbildung 1). Geben Proben durch eine Reihe von Filtern: 1 &amp; mgr; m-Filter, 0,2 &amp; mgr; m-Filter und 30 kDa cutoff Tangentialstromfilter systematisch separaten eukaryotische, bakterielle und virale große Partikel auf. Hinweis: Nur der Reinigung und Analyse des Materials an der 0,2 &amp; mgr; m-Filter (frei lebenden Bakterien) gewonnen wird in diesem Bericht beschrieben, jedoch ähnlichen Ansätzen kann für die anderen Partikel vom Filter gewonnen werden. </li></ol> 2. Bakterien Konzentration, DNA-Extraktion und Reinigung <ol><li> Entfernen Sie die 0,2 um-Membranfilter (s) von der Wasser-Filtersystem (schematische Darstellung, Figur 2). Falten Sie die 0,2 um Scheibenfilter in der Mitte und legen Sie es in einen 50-ml-Röhrchen mit der offenen Seite nach oben. 5 ml 1x phosphatgepufferter Lösung (PBS) und 0,01% Tween, pH 7,4, indas Rohr. Wenn mehr als ein Filter während des Verfahrens verwendet verwenden eine andere Röhre pro Filter. Öffnungsrohr (e) mit Filter bei 4 ° C bis zur Verarbeitung. Andernfalls fahren Sie mit Schritt 2.2. </li><li> Entfernen Sie den 0,2 um-Membranfilter aus dem 50-ml-Röhrchen mit einer sterilen Pinzette. Platz-Filter (n) auf eine Petrischale (lassen Sie die PBS-Puffer in der Röhre). <ol><li> Mit einer sterilen Pinzette und einer sterilen Schere, schneiden Sie den Filter in kleine Streifen (1 cm x 1 cm). Desinfizieren Pinzette und Schere durch Einweichen in 70% Isopropanol, Abwischen mit einem DNA-Dekontaminations Oberfläche und Spülen mit Reinstwasser vom Typ 1 zwischen verschiedenen Proben. </li></ol></li><li> Setzen Sie den Filter in Streifen geschnitten wieder in den gleichen 50-ml-Tube. 10 ml 1x PBS und 0,01% Tween, pH 7,4 zu den Filtern gibt es insgesamt 15 ml Puffer in 50-ml-Röhrchen. </li><li> In 6 Reinwolframkügelchen (Durchmesser 3 mm) in jede 50 ml Tube, decken Sie die Röhrchen mit Parafilm und Vortex kräftig 20 min (zu verwenden 50-ml-Röhrchen Vortex-Adapter). Wenn multiple Filter werden von einer Probe, die Weitergabe und Pool alle Homogenat in ein sauberes 50-ml-Tube verarbeitet. Zentrifugiere die Röhrchen bei 3.300 xg für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Das Pellet und aliquoten Bakterienzellen (~ 1 ml Aliquots) in 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Beachten Sie, dass es 5 Mikrozentrifugenröhrchen pro Probe. </li><li> Spin down die Reaktionsgefäße bei 10.000 × g für 10 Minuten, und entfernen Sie die meisten der Überstand bis auf ~ 200 &amp; mgr; l-Marke. </li><li> Lagern Sie die Proben bei -80 ° C, oder fahren bakterielle DNA unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen DNA-Isolierungskits nach den Angaben des Herstellers extrahiert. Während bakterielle DNA-Extraktion verwenden entweder PBS oder Wasser als negative Extraktionskontrolle und E. coli als positive Extraktionskontrolle. </li><li> Da DNA aus mehreren Rohren extrahiert werden, bündeln parallel Unterteilmengen aus der gleichen Probe in ein 2-ml-Tube. Diese führen eine O / N Niederschlag unter Verwendung einer Lösung von 0,1 umfassteVolumen von 3 M Natriumacetat, 2 Volumina 100% Ethanol und 5 &amp; mgr; l von 5 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l lineares Acrylamid. Gut mischen und Proben bei -80 ° C. </li><li> Zentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit (17,000 · g) für 30 min bei 4 ° C. Waschen Pellet mit 1 ml eiskaltem 70% Ethanol, der Luft trocknen in einer Biosicherheitswerkbank für nicht mehr als 5 Minuten und resuspendieren DNA-Pellet in 34 ul 10 mM Tris-Cl, pH 8,5. Hinweis: Linear Acrylamid wird dazu beitragen, DNA-Pellet nach der O / N Niederschlag zu visualisieren. </li><li> Bestimmen DNA Menge und Qualität mit einer hohen Empfindlichkeit fluoreszierender Nukleinsäure Quantifizierung Assay und eine Mikrovolumen Spektralphotometer jeweils folgenden Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien). Hinweis: Wenn mehrere Proben werden zum Zeitpunkt hergestellt wird, kann eine hochempfindliche fluoreszierende Nukleinsäurefärbemittel Assay zur Quantifizierung dsDNA und plattenbasierte Fluorometer / Spektrophotometer stattdessen verwendet werden. </li></ol> 3. DNA-Bibliothek Vorbereitung <ol><li&gt; Normalisieren genomischen von Wasserproben auf eine Konzentration von ~ 0,2 ng / &amp; mgr; l Bakterien-DNA extrahiert. </li><li> Enzymatisch Fragment ein Nanogramm von bakterieller DNA mit einem Transposon-beruhenden Methode (tagmentation). Fügen Sie Adapter und Indexfolgen auf fragmentierte DNA nach den Anweisungen des Herstellers. Gegenstand tagmented Proben zu 12 PCR-Zyklen, wie in den Anweisungen des Herstellers, an welchem ​​Punkt die Sequenzierungs Indizes eingeschlossen angegeben. </li></ol> 4. Automatisierte Gel Größenauswahl <ol><li> Überspringen Standard Post-PCR-Clean-up-Schritt in den Anweisungen des Herstellers beschrieben (siehe Tabelle der Materialien). Größe wählen Post-PCR-Proben direkt mit Hilfe eines automatisierten Gel-Basis Größenauswahl Plattform. <ol><li> Hinzufügen 3,5 ul Beladungspuffer zu jeder Probe. </li><li> Nach dem Protokoll des Herstellers, laden Sie die Proben auf die Elektrophorese-Workstation, die Angabe eines Größenselektionsziel von 500 bis 800 bp, in einem 300 ul ExtraktIonenvolumen unter Verwendung eines vorgegossenen 1,5% Agarose-Kassette. </li><li> Konzentriere das rohe Ausgangsmaterial (300 ul) auf 25 &amp; mgr; l über Ethanolfällung. Hinweis: Alternativ können Sie die Elektrophorese Workstation an Konzentration für eine größere Anzahl von Proben über Filterplatte und Vakuumkammer zu automatisieren. <ol><li> Ausfällung des rohen Elutionsvolumen unter Verwendung von 0,1 Volumina 3 M Natriumacetat, 2 Volumina 100% Ethanol und 5 &amp; mgr; l von 5 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l linear Acrylamid. Gut mischen, Ort Proben bei -80 ° CO / N. Zentrifuge Proben bei 17.000 xg für 30 min. </li><li> Verwerfen Überständen und fahren Sie mit DNA-Pellet mit 1 ml eiskaltem 70% Ethanol waschen. </li><li> Zentrifuge Proben wieder bei 17.000 × g für 30 min, die Überstände verworfen, an der Luft trocknen, und schließlich zu resuspendieren DNA Pellet in 25 ul 10 mM Tris-Cl, pH 8,5. </li></ol></li></ol></li><li> (Optional) Verwenden Sie 1 ul DNA-Bibliotheken Größe mit dem automatisierten Gelgröße Auswahl Plattform ausgewählt, um einen fünf machenfache Verdünnung mit Tris-EDTA-Pufferlösung, pH-Wert 8,0. Analysieren Bibliotheken unter Verwendung einer Chip-basierte Kapillarelektrophorese Instrument dsDNA Qualität entsprechend den Anweisungen des Herstellers analysiert. </li></ol> 5. Bibliothek Normalisierung und Sequencing <ol><li> Fahren Sie mit Proben mit Bibliothek Normalisierung Perlen (in der Transposon-basierte Bibliothek Vorbereitung Kit im Lieferumfang enthalten), wie in den Hersteller Vorbereitung Guide beschrieben zu normalisieren. <ol><li> Alternativ Maßnahme dsDNA-Bibliotheken mit einer hohen Empfindlichkeit fluoreszierender Nukleinsäurequantifizierungsassay, gefolgt durch die Bündelung in äquimolaren Verhältnissen, um eine endgültige dsDNA Konzentration von 2 nM erreichen. Fahren Sie mit Bibliotheken mit 10 ul der gepoolten Bibliotheken und 10 ul 0,2 N NaOH denaturiert, Inkubation für 5 min bei RT. Denaturierter Bibliotheken unter Verwendung von Hybridisierungspuffer (mit der Transposon-basierte Zubereitung Satz enthalten) in einem Endvolumen von 1 ml und die Konzentration von 23.05. </li></ol></li><li> Lastprobes in einer der nächsten Generation Sequenzierungsplattform durch folgende Standardsequenzierungsprotokolle des Herstellers. </li></ol>

<ol><li>Siuda, W., Chrost, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+susceptibility+of+dissolved+DNA+for+enzyme+degradation+in+lake+water+-+some+methodological+remarks%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Concentration and susceptibility of dissolved DNA for enzyme degradation in lake water - some methodological remarks.</a> Aquatic Microbial Ecology. 21, 195-201 (2000).</li>
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<li>Liles, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery%2C+purification%2C+and+cloning+of+high-molecular-weight+DNA+from+soil+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Recovery, purification, and cloning of high-molecular-weight DNA from soil microorganisms.</a> Applied and environmental microbiology. 74, 3302-3305 (2008).</li>
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<li>Tebbe, C. C., Vahjen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference+of+humic+acids+and+DNA+extracted+directly+from+soil+in+detection+and+transformation+of+recombinant+DNA+from+bacteria+and+a+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast.</a> Applied and environmental microbiology. 59, 2657-2665 (1993).</li>
<li>Solonenko, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+platform+and+library+preparation+choices+impact+viral+metagenomes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Sequencing platform and library preparation choices impact viral metagenomes.</a> BMC genomics. 14, 320(2013).</li>
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<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn5+transposase+and+tagmentation+procedures+for+massively+scaled+sequencing+projects%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects.</a> Genome research. , (2014).</li>
<li>Rhodes, J., Beale, M. A., Fisher, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+Choices+for+Library+Prep%3A+A+Comparison+of+Library+Preparation+Methods+for+Whole+Genome+Sequencing+of+Cryptococcus+neoformans+Using+Illumina+HiSeq%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Illuminating Choices for Library Prep: A Comparison of Library Preparation Methods for Whole Genome Sequencing of Cryptococcus neoformans Using Illumina HiSeq.</a> PloS One. 9, e113501(2014).</li>
</ol>

Jared R. Slobodan und Matthew J. Nesbitt beide halten Aktien der Küsten Genomics, ein in Privatbesitz British Columbia Corporation bietet die Ranger Technologie.

Die Anwesenheit von Adapter Dimere und Clusterbildung von kleinen Plattengrößen bevorzugt in aktuellen Plattformen sequenziert stellen eine Abnahme der nutzbaren Ertrag und Unterauslastung der Kapazität 15 der Geräte. Die Verwendung von Wulst zu schlagen Methoden kombiniert mit einer Transposon-basierten Ansatz, um Bibliotheken vorbereiten kann in mehrere DNA-Scherung führen im Vergleich zu anderen Methoden der Extraktion 4,5. Trotzdem werden alle Methoden der Extraktion und Bibliotheks Herstellung...

Metagenomik beinhaltet die Sequenzierung des gesamten genetischen Materials in einer Probe, um die vorhandenen mikrobiellen Gemeinschaften zu charakterisieren. Es handelt sich um einen komplexen und teuren Prozess, bei dem extrahierte Nukleinsäuren in DNA-Bibliotheken umgewandelt und anschließend eine Next-Generation-Sequenzierung durchgeführt wird. Qualitativ hochwertige Bibliotheken sind für eine maximale Datenausgabe und eine genaue Metagenomik-Analyse unerlässlich. Umweltproben, wie z. B. Wasserproben, stellen aufgrund geringer DNA-Mengen, die auch1-3 abgebaut werden können, und des Vorhandenseins von Inhibitoren der PCR4-6 oft eine große Herausforderung für die Erstellung hochwertiger Bibliotheken dar. 
Qualitativ hochwertige Bibliotheken bestehen idealerweise aus längeren DNA-Segmenten innerhalb eines engen Längenbereichs. Um die Menge an nützlichen Daten, die pro Sequenzierungslauf erzeugt werden, zu maximieren, sollte die Länge der DNA in der Bibliothek mindestens so lang sein wie die maximale Leselänge der verwendeten Sequenzierungsmethode. Bei der Verwendung einer Sequenzierungstechnologie durch Synthese wie der Illumina MiSeq beeinflusst die Größe der DNA-Fragmente die Effizienz, mit der Cluster auf der Durchflusszelle erzeugt werden. Wenn eine Bibliothek beispielsweise sowohl kürzere als auch längere DNA-Fragmente enthält, sind die kürzeren in den Sequenzierungsdaten überrepräsentiert7,8. Im Gegensatz dazu wird eine Bibliothek mit ähnlich großen DNA-Fragmenten proportional in den Sequenzierungsdaten repräsentiert. Viele Bibliotheksvorbereitungskits verwenden ligationsbasierte Methoden, um den DNA-Fragmenten Adapter hinzuzufügen, und eine Größenauswahl ist erforderlich, um Adapterdimere zu entfernen, die kein Insertenthalten 9,10. Es gibt zahlreiche Methoden11,12, um dies zu erreichen, aber die eine Technik, die die konsistentesten Ergebnisse liefert, ist die elektrophoretische Trennung der DNA, gefolgt von der Wiederherstellung der gewünschten DNA-Längen13,14. Dieser Prozess kann für eine kleine Anzahl von Proben manuell durchgeführt werden, aber wenn es um die Verarbeitung von Hunderten von Proben geht, sind automatisierte Lösungen erforderlich. Die derzeit verfügbaren Plattformen für die automatisierte Auswahl der Gelgröße weisen einen geringen Durchsatz auf und es werden neue Plattformen benötigt, um eine große Anzahl von Proben für die Sequenzierung zu verarbeiten. Die Ranger-Technologie kann in bestehende Liquid-Handling-Workstations integriert werden, um den Einsatz der Agarose-Gelelektrophorese für die Größenauswahl und analytische Zwecke in einem Maßstab zu ermöglichen, der der heutigen Hochdurchsatzumgebung gerecht wird.

<table><tbody><tr><td>Schlauchpumpe Masterflex P/S Serie 1400</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>1400-1620</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &Mikro; m Supor Membrane</td><td>VWR</td><td>CA28143-969</td><td>Pall Corporation, Ann Harbor, MI</td></tr><tr><td>Wolframkarbid-Kügelchen 3 mm (200)</td><td>Qiagen</td><td>69997</td><td></td></tr><tr><td>Isopropylalkohol 70%</td><td>Jedmon Products</td><td>825751</td><td>Healthcare Plus</td></tr><tr><td>DNA away</td><td>VWR</td><td>7010</td><td>Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA</td></tr><tr><td>Milli-Q Wasseraufbereitungssystem</td><td>Fisher Scientific</td><td>ZMQS6VF0Y</td><td>Merck Millipore. Dieses System wurde eingestellt.</td></tr><tr><td>20x PBS pH 7,5</td><td>VWR</td><td>E703-1L</td><td>Amresco, Inc., Solon, OH</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td>Fisher Chemikalien</td></tr><tr><td>Vortex-Adapter für 2 (50&nbsp; ml) Röhren</td><td>VWR</td><td>13000-V1-50</td><td>MoBio, Carlsbad, CA</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2, 120&nbsp; V (Modell G560)</td><td>VWR</td><td>SI-0236</td><td>Scientific Industries, Inc.</td></tr><tr><td>Beckman Centrifuge</td><td>Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd</td><td>Modell J-6B</td><td></td></tr><tr><td>PowerLyzer Powersoil DNA-Isolationskit</td><td>VWR</td><td>12855-100</td><td>MoBio, Carlsbad, CA</td></tr><tr><td>Vortex-Adapter für 24 (1,5-2 ml) Röhrchen</td><td>VWR</td><td>13000-V1-24</td><td>MoBio, Carlsbad, CA</td></tr><tr><td>Microfuge 18 Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td>Nimbus Select-Arbeitsplatz mit Ranger Technology</td><td>Hamilton Robotics</td><td>92720-01</td><td>Enthält die Liquid-Handling-Workstation und den integrierten Ranger Tech (Elektrophorese-Hardware)</td></tr><tr><td>Ranger-Reagenzienkit</td><td>Coastal Genomics</td><td>CG-10600-150-12-21</td><td>Enthält Ladepuffer und Kassetten</td></tr><tr><td>Ethylalkohol (wasserfrei)</td><td>Kommerzielle Alkohole</td><td>P016EAAN</td><td>Greenfield-Ethanol</td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889-250G</td><td></td></tr><tr><td>Lineares Acrylamid (5&nbsp; mg/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9520</td><td>Ambion</td></tr><tr><td>Eppendorf Kühlzentrifuge</td><td>Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd.</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Puffer EB (250 ml)</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spektralphotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Life Technologies</td><td>Q32857</td><td>Invitrogen. Dieses Produkt wurde eingestellt.</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>Hochempfindliches DNA-Reagenz</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Hochempfindliche DNA-Chips</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2011 Bioanalysator</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938B</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA-Probenvorbereitungskit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Index</td><td>Kit Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reagenzienkit v2 (500 Zyklen)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>Miseq System</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr></tbody></table>

automatisierte gel größenauswahl, um die qualität der nächsten generation sequencing libraries von umweltwasserproben vorbereitet verbessern

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Die Sequenzierung von Umweltproben der nächsten Generation kann aufgrund der unterschiedlichen DNA-Quantität und -Qualität in diesen Proben eine Herausforderung darstellen. Für optimale Ergebnisse aus dem Next-Generation-Sequencing werden hochwertige DNA-Bibliotheken benötigt. Umweltproben wie Wasser können eine geringe Qualität und Menge an DNA sowie Verunreinigungen aufweisen, die mit der DNA mitausfallen. Die mechanischen und enzymatischen Prozesse, die bei der Extraktion und der Bibliotheksvorbereitung beteiligt sind, können die DNA weiter schädigen. Die Auswahl der Gelgröße ermöglicht die Aufreinigung und Rückgewinnung von DNA-Fragmenten einer definierten Größe für Sequenzierungsanwendungen. Nichtsdestotrotz ist diese Aufgabe einer der zeitaufwändigsten Schritte im Arbeitsablauf bei der Vorbereitung von DNA-Bibliotheken. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die vollständige Automatisierung der Agarosegelladung, der elektrophoretischen Analyse und der Rückgewinnung von gezielten DNA-Fragmenten. 
In dieser Studie beschreiben wir einen Hochdurchsatz-Ansatz zur Herstellung hochwertiger DNA-Bibliotheken aus Süßwasserproben, die auch auf andere Umweltproben angewendet werden können. Wir verwendeten einen indirekten Ansatz, um Bakterienzellen aus Süßwasserproben aus der Umwelt zu konzentrieren. Die DNA wurde mit einem kommerziell erhältlichen DNA-Extraktionskit extrahiert, und die DNA-Bibliotheken wurden unter Verwendung eines kommerziellen Transposon-basierten Protokolls hergestellt. DNA-Fragmente von 500 bis 800 bp wurden mit Hilfe der Ranger-Technologie, einer automatisierten Elektrophorese-Workstation, in der Gelgröße ausgewählt. Die Sequenzierung der größenselektierten DNA-Bibliotheken zeigte signifikante Verbesserungen der Leselänge und der Qualität der Sequenzierlesevorgänge.

DNA-Konzentration, and Quality Assessment Bakterielle DNA-Konzentrationen reichten von 0,01 bis 0,11 ng ​​/ ml pro Wasserprobe der verschiedenen Einzugsstellen (Tabelle 1). DNA aus Bakterien-Fraktion isoliert hatte eine 260/280 und A-260/230-Verhältnisse von 1,4 bis 1,8 und 0,3 bis 1,6 auf. Während einige der A 260/230 Verhältnisse waren relativ niedrig war, wurde keine offensichtliche Hemmung in der hergestellten Bibliothek ...

Dieses Manuskript beschreibt einen automatisierten Ansatz zur Auswahl der Gelgröße zur Aufreinigung von DNA-Fragmenten für die Next-Generation-Sequenzierung. Die Ranger-Technologie ermöglicht die vollständige Automatisierung des gesamten Prozesses der Beladung des Agarosegels, der elektrophoretischen Analyse und der Rückgewinnung von DNA-Zielfragmenten und ermöglicht so einen hohen Durchsatz und eine hohe Qualität der Sequenzierungsbibliotheken der nächsten Generation.

Automatisierte Gel Größenauswahl, um die Qualität der nächsten Generation Sequencing Libraries von Umweltwasserproben vorbereitet verbessern

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Dieses Video zeigt die Verwendung eines automatisierten Instruments zur Größenselektion von Gelelekten, um verbesserte Sequenzierungen in Next-Generation-Sequenzierplattformen zu erzielen. Zunächst werden Umwasserproben gesammelt und durch eine Reihe von Filtern geleitet, um systematisch eukaryotische, bakterielle und virusgroße Partikel zu trennen. Die zurückgehaltenen Bakterien werden anschließend durch Zentrifugation weiter angereichert.Anschließend wird die bakterielle DNA isoliert. Die isolierte DNA wird verwendet, um Bibliotheken herzustellen, in die Adapter und Indexsequenzen in die fragmentierte DNA eingefügt werden. Die DNA wird anschließend mittels PCR amplifiziert, und die Proben werden in die Elektrophorese-Plattform geladen.DNA-Fragmente innerhalb eines bestimmten Bereichs werden anschließend automatisch ausgewählt. Die Analyse der Spuren aus der chipbasierten Kapillarelektrophorese sowie zusätzliche bioinformatische Untersuchungen zeigen, dass diese Methode geeignete Mengen an DNA-Fragmenten für die nachfolgende Analyse liefert, wobei eine minimale Anreicherung unerwünschter Fragmente unter 200 Basenpaaren auftritt. Der Hauptvorteil der automatisierten Elektrophorese-Quadratstation oder paramagnetischer Kügelchen und anderer kommerzieller Systeme liegt darin, dass eine engere, genauere Selektion möglich ist, bei der bis zu 96 Proben in einem einzigen Durchlauf verarbeitet werden können.Obwohl diese Methode Einblicke in mikrobielle Gemeinschaften in Süßwasserproben ermöglichen kann, ist sie auf andere Systeme wie Meerwasser, Abwasserbehandlung, Pflanzenproben, Sedimentböden oder mikrobielle Matten anwendbar, im Grunde auf jede DNA-Probe, für die eine enge Größenselektion gewünscht ist. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir kurze Fragmente in Sequenzen der MySEQ-Plattform beobachteten. Wir testeten mehrere Größenselektionsansätze, darunter verschiedene Typen von Para-Perlen und deren Verhältnisse sowie einen manuellen Gelelektrophorese-basierten Größenselektionsansatz.Dann begannen wir eine Zusammenarbeit mit Coastal Genomics, einem privaten Unternehmen aus British Columbia, das die Ranger-Technologie anbietet, um den Ablauf zu demonstrieren. Heute werden dabei Michael Chan, wissenschaftlicher Techniker aus meinem Labor, Miguel Yi, ein Postdoktorand aus meinem Labor, und Jared Sloan, ein Ingenieur von Coastal Genomics, mitwirken. In diesem Video beschreiben wir ausschließlich die Aufreinigung und Analyse des Materials, das auf den 0,2-Mikron-Filtern gewonnen wurde – hauptsächlich frei lebende Bakterien –, doch bedenken Sie, dass ähnliche Ansätze auch für andere auf den Filtern angereicherte Partikel angewendet werden können.Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Sammlung von 40 Litern Süßwasserproben aus mehreren Umweltstandorten in sterilisierten 20-Liter-Kanistern. Filtern Sie die Proben vor Ort mit einem 105-Mikrometer-Polypropylen-Sieb aus der Spectrum-Mesh-Serie vor. Hier werden Proben aus urbanen und landwirtschaftlich beeinflussten Einzugsgebieten gesammelt.Nach der Sammlung die Proben in Kühltaschen geben und zum Labor zurücktransportieren. Die Proben bei vier Grad Celsius lagern. Am nächsten Tag.Richten Sie ein Filtersystem ein, das aus dem Sammelkolben für Proben besteht, der über eine peristaltische Pumpe mit einer Enviro-Check-Eins-Mikrometer-Probenkapsel verbunden ist. Schließen Sie die Probenkapsel an einen 0,2-Mikrometer-Scheibenfilter an und verbinden Sie diesen über eine zweite peristaltische Pumpe mit einem tangentialen Flussfilter mit 30 Kilodalton. Schalten Sie die peristaltischen Pumpen ein, um die Proben durch eine Reihe von Filtern zu leiten; die eukaryotischen Zellen werden isoliert, während sie durch die Probenkapsel hindurchgehen.Die bakterielle Fraktion wird auf dem Membranscheibenfilter isoliert, während die Viruspartikel auf dem Tangentialflussfilter angereichert werden. Entfernen Sie den oder die 0,2-Mikrometer-Membranfilter aus dem Wasseraufbereitungssystem. Anschließend falten Sie den Filter zur Hälfte und geben ihn in ein 50-Milliliter-Röhrchen.Mit der offenen Seite nach oben. Geben Sie fünf Milliliter PBS mit Tween in das Röhrchen. Wenn mehr als ein Filter während der Filtration verwendet wurde, verwenden Sie für jeden Filter ein separates Röhrchen.Die Filter können anschließend bei vier Grad Celsius gelagert oder direkt wie folgt weiterverarbeitet werden. Entfernen Sie als Nächstes mit sterilen Pinzetten den Membranfilter aus dem 50-Milliliter-Röhrchen und legen Sie ihn mit sterilen Pinzetten und einer sterilen Schere auf eine Petrischale. Schneiden Sie den Filter zwischen den Proben in Stücke von einem Zentimeter mal einem Zentimeter. Desinfizieren Sie die Instrumente, indem Sie sie in 70 % Isopropanol tauchen, mit einem DNA-Oberflächendekontaminationsmittel abwischen und anschließend mit Typ-1-Ultrareinwasser spülen. Legen Sie die Filterstücke zurück in das gleiche 50-Milliliter-Gefäß. Geben Sie 10 Milliliter PBS mit Tween hinzu, um mit sterilen Pinzetten das Gesamtvolumen des Puffers auf 15 Milliliter aufzufüllen.Fügen Sie sechs saubere Wolframkugeln mit einem Durchmesser von drei Millimetern zu jedem 50-Milliliter-Röhrchen hinzu. Verschließen Sie das Röhrchen mit Parafilm und wirbeln Sie es 20 Minuten lang intensiv.Nach dem Vortexen alle Suspensionen für jede Probe in einem einzigen sauberen 50-Milliliter-Röhrchen sammeln. Die Röhrchen 15 Minuten bei vier Grad Celsius mit 3.300 × g zentrifugieren. Nach dem Zentrifugieren das Überstand entfernen und das Pellet erneut suspendieren.In fünf Milliliter PBS-Lösung die Bakterienzellen auf 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen verteilen, wobei jedes Röhrchen eine Aliquotprobe von einem Milliliter enthält; anschließend in einer Mikrozentrifuge bei 10.000 ×g 10 Minuten lang zentrifugieren. Nach der Zentrifugation mittels Pipette alles bis auf 200 Mikroliter des Überstandes entfernen. Die Proben bei minus 80 Grad Celsius lagern oder mit der Extraktion bakterieller DNA mithilfe eines im Handel erhältlichen DNA-Isolationskit fortfahren.Während der bakteriellen DNA-Extraktion verwenden Sie entweder PBS oder Wasser als negative Extraktionskontrolle und E. coli als positive Extraktionskontrolle. Nach der DNA-Extraktion werden die Aliquots derselben Probe in einem 2-Milliliter-Röhrchen in 10-Millimolar-Tris-Puffer vereinigt. Anschließend wird eine Übernachtpräzipitation durchgeführt, indem eine Lösung zugegeben wird, die aus 10 % dreimolarer Natriumacetatlösung, zwei Volumina 100 %igem Ethanol und fünf Mikrolitern linearem Acrylamid besteht. Lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius.Am nächsten Tag die Proben bei 17.000 ×g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach dem Zentrifugieren das Pellet mit einem Milliliter eiskaltem 70%igem Ethanol waschen und das Pellet anschließend nicht länger als fünf Minuten in einem Sicherheitswerkbank zur Lufttrocknung stehen lassen.Resuspendieren Sie das DNA-Pellet anschließend in 10 Millimolar Tris. Bestimmen Sie abschließend die DNA-Menge und -Qualität durch eine Fluoreszenz-basierte Nukleinsäure-Quantifizierungsanalyse mit hoher Empfindlichkeit, gefolgt von einer Mikrovolumen-Spektrometrie. Nach der Bestimmung der DNA-Menge in jeder Probe geben Sie die entsprechende Menge Wasser in jedes Reaktionsgefäß, um die Konzentration auf etwa 0,2 Nanogramm pro Mikroliter einzustellen.Unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits wird eine DNA-Bibliothek indizierter Fragmente aus einem Nanogramm bakterieller DNA hergestellt. Hier wird eine auf Transposition basierende Methode, bekannt als Mentation, angewandt, um DNA-Bruchstücke gleichzeitig zu generieren und Adaptersequenzen anzufügen. Anschließend erfolgt eine PCR, um die DNA-Proben gleichzeitig zu amplifizieren und zu indizieren, wodurch spezifische Barcodes an jedem Fragment sowie Sequenzen bereitgestellt werden, die für die Clusterbildung notwendig sind und von der Sequenzierplattform gelesen werden können.Nach Abschluss der PCR den üblichen Nachreinigungsschritt überspringen und 3,5 µL Puffer für die Gelelektrophorese zu jeder Probe hinzufügen, sodass sich ein Gesamtvolumen von 28,5 µL ergibt. Anschließend die Proben in eine 96-Loch-Platte überführen. Die 96-Loch-Platte in eine Elektrophorese-Workstation mit einer vorgefertigten 1,5 %igen Agarose-Kassette im Ranger-Software-Benutzeroberfläche laden.Geben Sie eine Größenselektion von 500 bis 800 Basenpaaren vor. Stellen Sie das Extraktionsvolumen auf 300 Mikroliter ein. Starten Sie den Lauf.Die Elektrophorese-Arbeitsstation lädt die Proben automatisch in die Aros-Kassetten ein. Anschließend wird eine Spannung an die Kassetten angelegt, und ein auf einem Portal montiertes Abbildungssystem dient zur Lokalisierung der Proben-DNA im Aros während des gesamten Laufs.Die Ranger-Software erfasst Bilder und schätzt mithilfe interner Standards die Position des größenselektierten Targets in jeder Probe. Nachdem die Targets identifiziert wurden, variiert die Ranger-Software. Die angelegte Spannung an jede Probe dient dazu, die Ankunft der Targets in den Extraktionsbrunnen des Kassettensystems zu synchronisieren.Schließlich saugt die Elektrophorese-Arbeitsstation die Zielmoleküle in TBE aus den Extraktionsgefäßen auf und gibt sie in eine neue 96-Well-Platte ab, um das rohe Produkt zu konzentrieren und das rohe Elutionsvolumen mithilfe von Natriumacetat und Ethanol mit linearem Acrylamid über Nacht bei minus 80 Grad Celsius zu präzipitieren. Zentrifugieren Sie die Proben erneut bei 17.000 ×g für 30 Minuten. Nach dem Zentrifugieren entfernen Sie die Überstände und waschen das DNA-Pellet mit einem Milliliter eiskaltem 70 %igem Ethanol durch Zentrifugation.Zentrifugieren Sie die Proben bei 17.000 ×g für 30 Minuten, entfernen Sie den Überstand, trocknen Sie die Pellets und resuspendieren Sie das DNA-Pellet schließlich in 10 Millimolar Tris-Cl. Fahren Sie fort, indem Sie die Proben mit Bibliotheksnormierungskügelchen normalisieren, die im Transposase-basierten Bibliothekspräparationskit enthalten sind. Schließen Sie anschließend die DNA-Sequenzierung mit einer Next-Generation-Sequenzierplattform ab, um informativere Reads in Next-Generation-Sequenzierplattformen zu erhalten, indem die Qualität der Sequenzierbibliotheken verbessert wird.Wasserproben wurden an acht verschiedenen Einzugsgebieten entnommen, und Index-DNA-Bibliotheken wurden aus der isolierten bakteriellen Fraktion vorbereitet, wie in diesem Elektropherogramm dargestellt. Die aus Süßwasserproben nach PCR erzeugten DNA-Bibliotheken, jedoch vor der automatisierten Größenselektion, bestanden aus Fragmenten mit einer Größe von 50 Basenpaaren bis zu 3000 Basenpaaren. Nach der Größenselektion mittels der hochdurchsatzfähigen automatisierten Plattform wiesen die Proben ein engeres Spektrum an DNA-Fragmenten zwischen 500 und 800 Basenpaaren auf. Daher führte die Nutzung dieser automatisierten Plattform zur Gelelektrophorese-basierten Größenselektion zu geeigneten Ausbeuten und minimierte die Anreicherung unerwünschter Fragmente unter 200 Basenpaaren.Die DNA-Sequenzierung dieser Bibliothek auf dem Aluminium-MiSeq ergab eine Clusterdichte von 1198 K pro Quadratmillimeter. Der Prozentsatz der Cluster, die die Filter passierten, betrug 84,2 % bei einer geschätzten Ausbeute von 9,2 Gigabyte. Darüber hinaus wiesen 7,4 Gigabyte bzw. 82,8 % der Reads einen Qualitätswert von größer oder gleich 30 auf.Dies bedeutet, dass ungefähr 83 % der mit diesem modifizierten Protokoll sequenzierten Basispaare, angewendet auf Umwasserproben, eine Basenaufrufgenauigkeit von mindestens 99,9 % aufwiesen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie aussagekräftigere Ergebnisse aus Sequenzierbibliotheken generiert werden können. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die mikrobielle Fraktion, auf die Sie abzielen, die Wahl der Bibliotheksvorbereitung, die gewünschte Fragmentlänge und die Sequenzierplattformen zu berücksichtigen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Die Charakterisierung der mikrobiellen Gemeinschaft ist ein langjähriges Ziel in der Umweltmikrobiologie. Next-Generation-Sequencing-Methoden ermöglichen nun die Charakterisierung mikrobieller Gemeinschaften in einer noch nie dagewesenen Tiefe mit minimalem Kosten- und Arbeitsaufwand. Wir beschreiben hier unseren Ansatz zur Sequenzierung bakterieller ribosomaler 16S-RNA-Gene mit einem Tischsequenzierer.

Next-Generation-Sequenzierung der ribosomalen 16S-RNA Gene Amplikons

Enhanced Reduced Representation Bisulfit Sequencing ist eine Methode zur Erstellung von Sequenzierungsbibliotheken für die DNA-Methylierungsanalyse, die auf dem Verdau von Restriktionsenzymen in Kombination mit der Umwandlung von Cytosin-Bisulfit basiert. Dieses Protokoll erfordert 50 ng Ausgangsmaterial und liefert Daten zur Auflösung von Basenpaaren in GC-reichen genomischen Regionen.

Verbesserte Reduzierte Darstellung Bisulfit-Sequenzierung für die Bewertung der DNA-Methylierung bei Basenpaar Auflösung

Bisulfit-Amplikon-Sequenzierung (BSAS) ist eine Methode zur Quantifizierung der Cytosin-Methylierung in bestimmten genomischen Regionen von Interesse. Bei dieser Methode wird die Bisulfit-Umwandlung in Kombination mit der PCR-Amplifikation von Zielregionen vor der Next-Generation-Sequenzierung verwendet, um eine absolute Quantifizierung der DNA-Methylierung auf basenspezifischer Ebene zu erzielen.

Gezielte DNA Methylierungsanalyse von Next-Generation-Sequencing

Ein integriertes System für die gezielte Next-Generation-Sequenzierung von onkologischen Proben wird beschrieben. Dieses plattformübergreifende System ist für Tumorbiopsien von geringer Qualität und geringen Mengen optimiert, ermöglicht geringe DNA-Eingaben, umfasst gut charakterisierte Mehrvariantenkontrollen und verfügt über einen neuartigen Variantenaufrufer, der auf quantitativen präanalytischen Qualitätskontrollmaßnahmen basiert.

Integration von Nass- und Trocken Bench Prozesse werden so optimiert Gezielte Next-Generation Sequenzierung von Low-Qualität und Low-Menge Tumorbiopsien

Wir beschreiben eine effiziente, robuste und kosteneffektive Methode zur Nukleinsäure von Tupfern zur Charakterisierung von Bakteriengemeinschaften Extraktion unter Verwendung von 16S rRNA-Gen-Amplikons Sequenzierung. Das Verfahren ermöglicht eine gemeinsame Verarbeitungsansatz für mehrere Probenarten und beherbergt eine Reihe von nachgelagerten analytischen Prozessen.

Effiziente Nukleinsäure-Extraktion und 16S rRNA Gen-Sequenzierung für bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung

Am häufigsten Darm Inhaltsanalysen der Makroinvertebraten sind visuell. Intensive Kenntnisse über morphologische Vielfalt der Beute Organismen erfordern, sie vermissen weichen vollmundigen Beute und durch starke Zerkleinerung von Beute, sind fast unmöglich für einige Organismen, einschließlich Amphipoden. Wir bieten detaillierte, neuartigen gentechnische Ansätze für Soisgrabenbaches Identifikation in der Ernährung der Amphipoden Beute.

Laborprotokoll für genetische Darm Inhaltsanalysen der aquatischen Makroinvertebraten Using gruppenspezifische rDNA Primer

Gel-Seq ermöglicht Forschern gleichzeitig Bibliotheken für beide DNA und RNA-Seq bei vernachlässigbaren Kosten ab 100-1000 Zellen mit einem einfachen Hydrogel-Gerät vorzubereiten. Dieser Beitrag stellt einen detaillierten Ansatz für die Herstellung des Geräts sowie das biologische Protokoll zum gekoppelte Bibliotheken zu generieren.

Gel-Seq: Eine Methode zur gleichzeitigen Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von DNA und RNA mit Hydrogel Matrizen

In voller Länge individuelle proviralen Sequenzierung (FLIPS) bietet eine effiziente und Hochdurchsatz-Methode für die Verstärkung und die Abfolge der einzelnen, in der Nähe von Full-Length (intakt und Defekte) HIV-1-Proviruses und ermöglicht die Bestimmung ihres Potenzials Replikation-Kompetenz. FLIPS überwindet Grenzen der früheren Assays entwickelt, um die latente HIV-1-Reservoir-Sequenz.

Verstärkung des in der Nähe von Full-Length HIV-1 Proviruses für Next Generation Sequencing

Die Kennung der physikalischen Wechselwirkungen zwischen Genen und regulatorische Elemente ist anspruchsvoll aber erfassen Bezahlungsmethode Chromosom Konformation erleichtert worden. Diese Modifikation des 4C-Seq-Protokolls mildert PCR Bias durch Minimierung der Überverstärkung PCR-Vorlagen und maximiert die Mappability von Lesevorgängen durch den Einbau eines Zusatz Restriktionsenzym verdauen Schritt.

Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

Wir stellen ein Protokoll zur Verfügung, das im Allgemeinen auf die Auswahl von Aptameren angewendet werden kann, die nur an infektiöse Viren binden und nicht an Viren, die durch eine Desinfektionsmethode nicht infektiös gemacht wurden, oder an andere ähnliche Viren. Dies eröffnet die Möglichkeit, den Infektiositätsstatus in tragbaren und Schnelltests zu bestimmen.

In-vitro-Selektion von Aptameren zur Unterscheidung von infektiösen und nicht-infektiösen Viren

Dieses Protokoll bietet einen einfach zu befolgenden Arbeitsablauf für die Durchführung von Poly(A)-RNA-Aufreinigung, Bisulfitumwandlung und Bibliotheksvorbereitung mit standardisierten Geräten für eine biologische Probe von Interesse.

Anreicherung von mRNA- und Bisulfit-mRNA-Bibliotheksvorbereitung für Next-Generation-Sequencing

Erfahren Sie die automatisierte Gel-Größenauswahl zur Verbesserung von Next-Generation-Sequencing-Bibliotheken aus Umweltwasserproben. Diese Methode ermöglicht Hochdurchsatz-DNA-Reinigung mit präziser Fragmentselektion.

Automatisierte Gel Größenauswahl, um die Qualität der nächsten Generation Sequencing Libraries von Umweltwasserproben vorbereitet verbessern (Video) | JoVE Journal

Automatisierte Gel Größenauswahl, um die Qualität der nächsten Generation Sequencing Libraries von Umweltwasserproben vorbereitet verbessern

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