Automatisierte Gel Größenauswahl, um die Qualität der nächsten Generation Sequencing Libraries von Umweltwasserproben vorbereitet verbessern

Dieses Video zeigt die Verwendung eines automatisierten Instruments zur Größenselektion von Gelelekten, um verbesserte Sequenzierungen in Next-Generation-Sequenzierplattformen zu erzielen. Zunächst werden Umwasserproben gesammelt und durch eine Reihe von Filtern geleitet, um systematisch eukaryotische, bakterielle und virusgroße Partikel zu trennen. Die zurückgehaltenen Bakterien werden anschließend durch Zentrifugation weiter angereichert.

Anschließend wird die bakterielle DNA isoliert. Die isolierte DNA wird verwendet, um Bibliotheken herzustellen, in die Adapter und Indexsequenzen in die fragmentierte DNA eingefügt werden. Die DNA wird anschließend mittels PCR amplifiziert, und die Proben werden in die Elektrophorese-Plattform geladen.

DNA-Fragmente innerhalb eines bestimmten Bereichs werden anschließend automatisch ausgewählt. Die Analyse der Spuren aus der chipbasierten Kapillarelektrophorese sowie zusätzliche bioinformatische Untersuchungen zeigen, dass diese Methode geeignete Mengen an DNA-Fragmenten für die nachfolgende Analyse liefert, wobei eine minimale Anreicherung unerwünschter Fragmente unter 200 Basenpaaren auftritt. Der Hauptvorteil der automatisierten Elektrophorese-Quadratstation oder paramagnetischer Kügelchen und anderer kommerzieller Systeme liegt darin, dass eine engere, genauere Selektion möglich ist, bei der bis zu 96 Proben in einem einzigen Durchlauf verarbeitet werden können.

Obwohl diese Methode Einblicke in mikrobielle Gemeinschaften in Süßwasserproben ermöglichen kann, ist sie auf andere Systeme wie Meerwasser, Abwasserbehandlung, Pflanzenproben, Sedimentböden oder mikrobielle Matten anwendbar, im Grunde auf jede DNA-Probe, für die eine enge Größenselektion gewünscht ist. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir kurze Fragmente in Sequenzen der MySEQ-Plattform beobachteten. Wir testeten mehrere Größenselektionsansätze, darunter verschiedene Typen von Para-Perlen und deren Verhältnisse sowie einen manuellen Gelelektrophorese-basierten Größenselektionsansatz.

Dann begannen wir eine Zusammenarbeit mit Coastal Genomics, einem privaten Unternehmen aus British Columbia, das die Ranger-Technologie anbietet, um den Ablauf zu demonstrieren. Heute werden dabei Michael Chan, wissenschaftlicher Techniker aus meinem Labor, Miguel Yi, ein Postdoktorand aus meinem Labor, und Jared Sloan, ein Ingenieur von Coastal Genomics, mitwirken. In diesem Video beschreiben wir ausschließlich die Aufreinigung und Analyse des Materials, das auf den 0,2-Mikron-Filtern gewonnen wurde – hauptsächlich frei lebende Bakterien –, doch bedenken Sie, dass ähnliche Ansätze auch für andere auf den Filtern angereicherte Partikel angewendet werden können.

Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Sammlung von 40 Litern Süßwasserproben aus mehreren Umweltstandorten in sterilisierten 20-Liter-Kanistern. Filtern Sie die Proben vor Ort mit einem 105-Mikrometer-Polypropylen-Sieb aus der Spectrum-Mesh-Serie vor. Hier werden Proben aus urbanen und landwirtschaftlich beeinflussten Einzugsgebieten gesammelt.

Nach der Sammlung die Proben in Kühltaschen geben und zum Labor zurücktransportieren. Die Proben bei vier Grad Celsius lagern. Am nächsten Tag.

Richten Sie ein Filtersystem ein, das aus dem Sammelkolben für Proben besteht, der über eine peristaltische Pumpe mit einer Enviro-Check-Eins-Mikrometer-Probenkapsel verbunden ist. Schließen Sie die Probenkapsel an einen 0,2-Mikrometer-Scheibenfilter an und verbinden Sie diesen über eine zweite peristaltische Pumpe mit einem tangentialen Flussfilter mit 30 Kilodalton. Schalten Sie die peristaltischen Pumpen ein, um die Proben durch eine Reihe von Filtern zu leiten; die eukaryotischen Zellen werden isoliert, während sie durch die Probenkapsel hindurchgehen.

Die bakterielle Fraktion wird auf dem Membranscheibenfilter isoliert, während die Viruspartikel auf dem Tangentialflussfilter angereichert werden. Entfernen Sie den oder die 0,2-Mikrometer-Membranfilter aus dem Wasseraufbereitungssystem. Anschließend falten Sie den Filter zur Hälfte und geben ihn in ein 50-Milliliter-Röhrchen.

Mit der offenen Seite nach oben. Geben Sie fünf Milliliter PBS mit Tween in das Röhrchen. Wenn mehr als ein Filter während der Filtration verwendet wurde, verwenden Sie für jeden Filter ein separates Röhrchen.

Die Filter können anschließend bei vier Grad Celsius gelagert oder direkt wie folgt weiterverarbeitet werden. Entfernen Sie als Nächstes mit sterilen Pinzetten den Membranfilter aus dem 50-Milliliter-Röhrchen und legen Sie ihn mit sterilen Pinzetten und einer sterilen Schere auf eine Petrischale. Schneiden Sie den Filter zwischen den Proben in Stücke von einem Zentimeter mal einem Zentimeter.

Desinfizieren Sie die Instrumente, indem Sie sie in 70 % Isopropanol tauchen, mit einem DNA-Oberflächendekontaminationsmittel abwischen und anschließend mit Typ-1-Ultrareinwasser spülen. Legen Sie die Filterstücke zurück in das gleiche 50-Milliliter-Gefäß. Geben Sie 10 Milliliter PBS mit Tween hinzu, um mit sterilen Pinzetten das Gesamtvolumen des Puffers auf 15 Milliliter aufzufüllen.

Fügen Sie sechs saubere Wolframkugeln mit einem Durchmesser von drei Millimetern zu jedem 50-Milliliter-Röhrchen hinzu. Verschließen Sie das Röhrchen mit Parafilm und wirbeln Sie es 20 Minuten lang intensiv.

Nach dem Vortexen alle Suspensionen für jede Probe in einem einzigen sauberen 50-Milliliter-Röhrchen sammeln. Die Röhrchen 15 Minuten bei vier Grad Celsius mit 3.300 × g zentrifugieren. Nach dem Zentrifugieren das Überstand entfernen und das Pellet erneut suspendieren.

In fünf Milliliter PBS-Lösung die Bakterienzellen auf 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen verteilen, wobei jedes Röhrchen eine Aliquotprobe von einem Milliliter enthält; anschließend in einer Mikrozentrifuge bei 10.000 ×g 10 Minuten lang zentrifugieren. Nach der Zentrifugation mittels Pipette alles bis auf 200 Mikroliter des Überstandes entfernen. Die Proben bei minus 80 Grad Celsius lagern oder mit der Extraktion bakterieller DNA mithilfe eines im Handel erhältlichen DNA-Isolationskit fortfahren.

Während der bakteriellen DNA-Extraktion verwenden Sie entweder PBS oder Wasser als negative Extraktionskontrolle und E. coli als positive Extraktionskontrolle. Nach der DNA-Extraktion werden die Aliquots derselben Probe in einem 2-Milliliter-Röhrchen in 10-Millimolar-Tris-Puffer vereinigt. Anschließend wird eine Übernachtpräzipitation durchgeführt, indem eine Lösung zugegeben wird, die aus 10 % dreimolarer Natriumacetatlösung, zwei Volumina 100 %igem Ethanol und fünf Mikrolitern linearem Acrylamid besteht. Lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius.

Am nächsten Tag die Proben bei 17.000 ×g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach dem Zentrifugieren das Pellet mit einem Milliliter eiskaltem 70%igem Ethanol waschen und das Pellet anschließend nicht länger als fünf Minuten in einem Sicherheitswerkbank zur Lufttrocknung stehen lassen.

Resuspendieren Sie das DNA-Pellet anschließend in 10 Millimolar Tris. Bestimmen Sie abschließend die DNA-Menge und -Qualität durch eine Fluoreszenz-basierte Nukleinsäure-Quantifizierungsanalyse mit hoher Empfindlichkeit, gefolgt von einer Mikrovolumen-Spektrometrie. Nach der Bestimmung der DNA-Menge in jeder Probe geben Sie die entsprechende Menge Wasser in jedes Reaktionsgefäß, um die Konzentration auf etwa 0,2 Nanogramm pro Mikroliter einzustellen.

Unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits wird eine DNA-Bibliothek indizierter Fragmente aus einem Nanogramm bakterieller DNA hergestellt. Hier wird eine auf Transposition basierende Methode, bekannt als Mentation, angewandt, um DNA-Bruchstücke gleichzeitig zu generieren und Adaptersequenzen anzufügen. Anschließend erfolgt eine PCR, um die DNA-Proben gleichzeitig zu amplifizieren und zu indizieren, wodurch spezifische Barcodes an jedem Fragment sowie Sequenzen bereitgestellt werden, die für die Clusterbildung notwendig sind und von der Sequenzierplattform gelesen werden können.

Nach Abschluss der PCR den üblichen Nachreinigungsschritt überspringen und 3,5 µL Puffer für die Gelelektrophorese zu jeder Probe hinzufügen, sodass sich ein Gesamtvolumen von 28,5 µL ergibt. Anschließend die Proben in eine 96-Loch-Platte überführen. Die 96-Loch-Platte in eine Elektrophorese-Workstation mit einer vorgefertigten 1,5 %igen Agarose-Kassette im Ranger-Software-Benutzeroberfläche laden.

Geben Sie eine Größenselektion von 500 bis 800 Basenpaaren vor. Stellen Sie das Extraktionsvolumen auf 300 Mikroliter ein. Starten Sie den Lauf.

Die Elektrophorese-Arbeitsstation lädt die Proben automatisch in die Aros-Kassetten ein. Anschließend wird eine Spannung an die Kassetten angelegt, und ein auf einem Portal montiertes Abbildungssystem dient zur Lokalisierung der Proben-DNA im Aros während des gesamten Laufs.

Die Ranger-Software erfasst Bilder und schätzt mithilfe interner Standards die Position des größenselektierten Targets in jeder Probe. Nachdem die Targets identifiziert wurden, variiert die Ranger-Software. Die angelegte Spannung an jede Probe dient dazu, die Ankunft der Targets in den Extraktionsbrunnen des Kassettensystems zu synchronisieren.

Schließlich saugt die Elektrophorese-Arbeitsstation die Zielmoleküle in TBE aus den Extraktionsgefäßen auf und gibt sie in eine neue 96-Well-Platte ab, um das rohe Produkt zu konzentrieren und das rohe Elutionsvolumen mithilfe von Natriumacetat und Ethanol mit linearem Acrylamid über Nacht bei minus 80 Grad Celsius zu präzipitieren. Zentrifugieren Sie die Proben erneut bei 17.000 ×g für 30 Minuten. Nach dem Zentrifugieren entfernen Sie die Überstände und waschen das DNA-Pellet mit einem Milliliter eiskaltem 70 %igem Ethanol durch Zentrifugation.

Zentrifugieren Sie die Proben bei 17.000 ×g für 30 Minuten, entfernen Sie den Überstand, trocknen Sie die Pellets und resuspendieren Sie das DNA-Pellet schließlich in 10 Millimolar Tris-Cl. Fahren Sie fort, indem Sie die Proben mit Bibliotheksnormierungskügelchen normalisieren, die im Transposase-basierten Bibliothekspräparationskit enthalten sind. Schließen Sie anschließend die DNA-Sequenzierung mit einer Next-Generation-Sequenzierplattform ab, um informativere Reads in Next-Generation-Sequenzierplattformen zu erhalten, indem die Qualität der Sequenzierbibliotheken verbessert wird.

Wasserproben wurden an acht verschiedenen Einzugsgebieten entnommen, und Index-DNA-Bibliotheken wurden aus der isolierten bakteriellen Fraktion vorbereitet, wie in diesem Elektropherogramm dargestellt. Die aus Süßwasserproben nach PCR erzeugten DNA-Bibliotheken, jedoch vor der automatisierten Größenselektion, bestanden aus Fragmenten mit einer Größe von 50 Basenpaaren bis zu 3000 Basenpaaren. Nach der Größenselektion mittels der hochdurchsatzfähigen automatisierten Plattform wiesen die Proben ein engeres Spektrum an DNA-Fragmenten zwischen 500 und 800 Basenpaaren auf. Daher führte die Nutzung dieser automatisierten Plattform zur Gelelektrophorese-basierten Größenselektion zu geeigneten Ausbeuten und minimierte die Anreicherung unerwünschter Fragmente unter 200 Basenpaaren.

Die DNA-Sequenzierung dieser Bibliothek auf dem Aluminium-MiSeq ergab eine Clusterdichte von 1198 K pro Quadratmillimeter. Der Prozentsatz der Cluster, die die Filter passierten, betrug 84,2 % bei einer geschätzten Ausbeute von 9,2 Gigabyte. Darüber hinaus wiesen 7,4 Gigabyte bzw. 82,8 % der Reads einen Qualitätswert von größer oder gleich 30 auf.

Dies bedeutet, dass ungefähr 83 % der mit diesem modifizierten Protokoll sequenzierten Basispaare, angewendet auf Umwasserproben, eine Basenaufrufgenauigkeit von mindestens 99,9 % aufwiesen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie aussagekräftigere Ergebnisse aus Sequenzierbibliotheken generiert werden können. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die mikrobielle Fraktion, auf die Sie abzielen, die Wahl der Bibliotheksvorbereitung, die gewünschte Fragmentlänge und die Sequenzierplattformen zu berücksichtigen.