Vereinfachte Menschen Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolierung und Handhabung

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, ein einfaches Protokoll zur Isolierung von neutrophilen, extrazellulären Fallen oder Netzen aus menschlichem Vollblut unter Verwendung leicht verfügbarer Reagenzien zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Neutrophile aus dem menschlichen Vollblut isoliert werden, wobei in einem zweiten Schritt eine differentielle Zentrifugationstechnik verwendet wird. Isolierte Neutrophile werden mit PMA stimuliert, um die Netzbildung, auch NETose genannt, zu induzieren.

Als nächstes wird eine Platte mit einem zellfreien Netzisolat vorbereitet und Krebszellen werden hinzugefügt, um zu demonstrieren, wie die Netze die Adhäsion der Zellen beeinflussen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe einer Netto-Monoschicht die Adhäsion von 5 49 Krebszellen verbessert und dass diese Adhäsion reduziert wird, wenn die Netze abgebaut werden. Die Verwendung von DNAS ist eine visuelle Demonstration dieser Methode von entscheidender Bedeutung.

Angesichts der Neuartigkeit dieser Technik ist der Umgang mit neutrophilen xor-zellulären Fallen aufgrund der Zerbrechlichkeit dieser Strukturen extrem schwierig. Zu Beginn erhalten Sie 80 Milliliter frisches menschliches Vollblut in 14 heparinisierten grünen Oberröhrchen, wie im Textprotokoll beschrieben. Öffnen Sie jedes Röhrchen und geben Sie fünf Milliliter PBS ohne Kalzium und Magnesium in jedes Röhrchen.

Geben Sie anschließend 15 Milliliter Lymphozytentrennmedium oder LSM in jedes der vier konischen 50-Milliliter-Röhrchen bei Raumtemperatur. Verwenden Sie dann eine 18-Gauge-Nadel, die auf einer 60-Milliliter-Spritze montiert ist, um das verdünnte Blut vorsichtig auf das LSM zu schichten, wodurch eine scharfe LSM-Blutgrenzfläche entsteht. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang bei 21 Grad Celsius, ohne zu brechen, um die Zentrifuge zu stoppen, saugen Sie die oberen beiden Flüssigkeitsschichten und die Grenzfläche zwischen ihnen vorsichtig ab und verwerfen Sie sie, so dass nur die untere rote Schicht übrig bleibt. Dieses Pellet enthält Erythrozyten und Neutrophile.

Geben Sie 20 Milliliter PBS und 20 Milliliter 6%ige Dextranlösung in jedes Röhrchen. Drehen Sie jedes Röhrchen vorsichtig um und lassen Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur ruhen. Die roten Blutkörperchen sedimentieren zum Boden des Röhrchens.

Füllen Sie dann die Überstände in frische Röhrchen um und entsorgen Sie die Paletten. Zentrifugieren Sie die Überstände fünf Minuten lang bei 450 mal G bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie dann den Überstand, wobei das neutrophile Pellet übrig bleibt. Bereiten Sie eine Lyselösung mit 0,5 Millilitern Lysepuffer in 4,5 Millilitern sterilem Wasser vor.

Geben Sie insgesamt fünf Milliliter der Lyselösung in jedes Röhrchen und bündeln Sie alle Pellets in einem Kolben. Stellen Sie den Kolben 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln, um die verbleibenden roten Blutkörperchen zu läusieren. Zentrifugieren Sie die Neutrophilen bei 450 mal G bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.

Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit fünf Millilitern PBS ohne Kalzium und Magnesium. Anschließend wird die Probe erneut bei 450 mal G bei vier Grad Celsius zentrifugiert und der Überstand mit der restlichen Lyselösung entfernt. Resuspendieren Sie das neutrophile Pellet in 30 Millilitern kaltem RPMI-Medium, das mit 3%igem fötalem Rinderserum ergänzt ist, und legen Sie das Röhrchen auf Eis, um die Bildung von extrazellulären Neutrophilenfallen oder -netzen zu stimulieren.

Geben Sie 500 Nanomolare PMA zu 30 Litern der Neutrophilensuspension in eine 150 Millimeter x 25 Millimeter große flache Gewebekulturschale. Mit einem 20-Millimeter-Raster inkubieren Sie die Zellen vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter 5 % Kohlendioxid. Nach der Inkubation das Medium vorsichtig ansaugen und verwerfen, wobei darauf zu achten ist, dass die Netzschicht und die Neutrophilen, die am Boden der Schale haften, nicht beschädigt werden.

Waschen Sie dann mit einer Pipette den Boden jeder Schüssel mit 15 Millilitern kaltem PBS ohne Kalzium und Magnesium, wobei sämtliches anhaftendes Material vom Boden entfernt werden sollte. Die Waschsuspension in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen auffangen und dann 10 Minuten lang bei 450 mal G zentrifugieren. Bei vier Grad Celsius pelletieren Neutrophile und alle verbleibenden Zellen am Boden.

Lassen Sie einen zellfreien, nettoreichen Überstand übrig, dekantieren Sie den Überstand anschließend in mehrere 1,5-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie ihn bei acht 18.000 μm für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Um die DNA zu pelletieren, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in PBS, so dass die Konzentration zweimal 10 bis sieben Neutrophilen pro 100 Mikroliter PBS entspricht. Dieser zellfreie Netzstock kann für nachfolgende Experimente verwendet werden.

Messen Sie die DNA-Konzentration der Probe mit Hilfe der Spektrophotometrie. Eine angemessene Konzentration sollte zwischen 140 und 180 Nanogramm pro Mikroliter bei 100 Mikrolitern des Nettobestands in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit flachem Boden reichen und die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius im Dunkeln inkubieren, um die Vertiefungen 12 bis 20 Stunden später zu beschichten, ein Mikroskop verwenden, um die Bildung einer einheitlichen Monoschicht aus zellfreien Netzen am Boden der Vertiefungen zu überprüfen. Sobald die Monoschicht verifiziert wurde, saugen Sie vorsichtig alles nicht anhaftende Material aus den Vertiefungen ab.

Achten Sie darauf, die Monoschicht an der Unterseite nicht zu stören. Dies ist der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens. Um eine adäquate Netto-Monolage zu erhalten, muss man die Platte sehr vorsichtig handhaben.

Geben Sie alle Reagenzien und Zellen langsam an der Seite der Vertiefungen, saugen Sie sehr vorsichtig an und vermeiden Sie es, den Boden der Vertiefung mit einer Saugspitze zu berühren. Nachdem das nicht anhaftende Material entfernt wurde, geben Sie vorsichtig 100 Mikroliter einer 1%igen Rinderserumalbumin-Blockierungslösung in jede Vertiefung und lassen Sie es eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Bewegen oder schütteln Sie die Platte nicht, da dies die Netz-Monoschicht stören kann.

Bereiten Sie als Nächstes 5 49 Krebszellen vor, indem Sie sie ernten, wenn sie zu 70 bis 80 % zusammenfließen. Unter Verwendung von Standardtechniken werden die Zellen in Medium in einer Konzentration von zweimal 10 bis zur vierten Zellzahl pro 100 Mikroliter resuspendiert. Färben Sie die Zellen, indem Sie einen Mikroliter CFS e pro Milliliter Medium hinzufügen und lassen Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen.

Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen bei 450 mal G bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Der Überstand wird verworfen und die Zellen im Anfangsvolumen des Mediums resuspendiert, um eine Konzentration von zweimal 10 bis 10 Krebszellen pro 100 Mikroliter Medium aufrechtzuerhalten. Nehmen Sie die netzbeschichtete Platte und saugen Sie die Blockierungslösung vorsichtig an.

Geben Sie dann 100 Mikroliter der Krebszellsuspension in jede Vertiefung und lassen Sie die Zellen 90 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid an der Platte haften, saugen Sie die Flüssigkeit vollständig ab und fügen Sie 1000 DNA-Einheiten hinzu, eine davon 10 Minuten lang in einige Vertiefungen, um die Netze in anderen Vertiefungen abzubauen. Fügen Sie 100 Mikroliter steriles Wasser pro Vertiefung für 10 Minuten als Fahrzeugkontrolle hinzu. Saugen Sie anschließend die Flüssigkeit vorsichtig aus jeder Vertiefung an und waschen Sie sie mit 100 Mikrolitern PBS, um nicht anhaftende Elemente zu entfernen.

A 5 49 Zellen aspirieren und verwerfen die gesamte Lösung in den Vertiefungen, so dass nur die Netze und die anhaftenden Krebszellen am Boden übrig bleiben. Fügen Sie dann 100 Mikroliter einer 4%igen Formaldehydlösung pro Vertiefung hinzu, um die Zellen sofort zu fixieren, übertragen Sie die Platte in ein Fluoreszenzmikroskop, um den Assay abzulesen und dann die Ergebnisse darzustellen und zu analysieren. Mit der Datenanalyse-Software.

Zellfreie Netze wurden in statischen Adhäsionsassays mit 5 49 Krebszellen verwendet. Die Lichtmikroskopie zeigte, dass Krebszellen stark an der Netto-Monoschicht haften. In vitro.

Diese Adhäsion nahm ab, nachdem die Netto-Monoschicht durch DNA abgebaut wurde; eine Fluoreszenzmikroskopie von markierten 5 49 Krebszellen bestätigte diese Ergebnisse. Die Bindung von 5 49 Zellen an die Netto-Monoschicht wurde durch Zählen der Anzahl der Zellen pro Hochleistungsfeld quantifiziert. Wie hier gezeigt, gab es in der Vehikelkontrolle keine Veränderung der Adhäsion von Krebszellen an Netzen.

Es gab jedoch eine signifikante Abnahme der Adhäsion von Krebszellen an Netzen in Gegenwart von DNA eins. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man Netze aus menschlichem Vollblut isoliert und handhabt. Diese zellfreien Netzisolate können dann in einer Vielzahl von Techniken verwendet werden, darunter Immunfluoreszenz, konfokale Mikroskopie, Elektronenmikroskopie und Western Blotting.