Name: Ein enzymatisches Verfahren zur mesenchymalen Stammzellen aus Knochenmarkproben Clotted Rettung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Lernen Sie ein enzymatisches Verfahren zur Rettung mesenchymaler Stammzellen aus geronnenen Knochenmarkproben mittels Urokinase. Diese Methode ermöglicht eine schnelle und kostengünstige Zellkultur für die regenerative Medizin.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Schweizerische Nationalstiftungsstipendium CR3I3_140717/1 und die Schweizer Paraplegiker-Stiftung.

HINWEIS: Human Knochenmarkaspiraten aus dem Beckenkamm wurden vom mündigen Spender mit Zustimmung der Ethikkommission des Kantons Luzern gesammelt. Canine Knochenmarkaspiraten aus dem Beckenkamm wurden mit Hundebesitzers consent.Human gesammelt (ca. 20 ml) und Hunde (ca. 10 ml) Knochenmarkaspiraten waren antikoaguliert durch Zugabe von 15 ml 3,8% Natriumcitrat unmittelbar nach dem Rückzug im Operationssaal. Die Proben wurden auf die Laborumgebung zum Verarbeiten der gleiche Tag wie zurückführt. 1. Herstellung von Urokinase (Vor dem 1. Verwenden) <ol><li> Rekonstituieren Urokinase mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) nach den Anweisungen des Herstellers: 10 ml PBS zu dem Septum-Einlaß Kolben unter Verwendung einer 10 ml Spritze. Lösen Sie die Trockensubstanz durch Verwirbelung zu 50.000 Einspritzeinheiten (U) pro ml zu erhalten. </li><li> Bereiten Sie 500 ul Aliquots (jeweils 25.000 U) in sterile Rohre. Speicher Aliquots -20 ° C und verwenden es, wenn sie für mindestens 6 Monate benötigt. </li></ol> 2. Präparative Schritte (Vor jeder Knochenmarkbehandlung) <ol><li> Auftauen ein Aliquot von Urokinase (25.000 U) pro geronnen Knochenmarkaspirat (Aspirate Volumina bis zu 25 ml wurden erfolgreich unter Verwendung eines einzigen Aliquot 25.000 U behandelt wurde). </li><li> Heizen Sie ein Wasserbad oder Schüttelinkubator bis 37 ° C. </li></ol> 3. Enzymatische Digest des Clot <ol><li> Alle Arbeiten in einer laminaren Strömung Biosicherheitswerkbank, um eine mikrobielle Kontamination der Knochenmarkproben während der Verarbeitung zu vermeiden. Bei der Arbeit mit potenziell infektiöses humanes Material ist die Verwendung von Schutzhandschuhen sowie sorgfältige Umgang beraten. </li><li> Legen Sie eine 100 um Zellsieb auf einem sterilen 50 ml-Tube. Gießen Sie das Knochenmarkaspirat durch die Zelle Sieb, Kippen des Schmutzfänger oder bewegen das Gerinnungsmaterial. Verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze fürbessere Durchströmung des Filtergitter. Hinweis: Vermeiden Sie jede Verdünnung des Gerinnsels, beispielsweise durch Waschen der Gerinnsel mit PBS. Urokinase wirkt indirekt und erfordert Komponenten des Serums (dh., Plasminogen) von der Biopsie zur wirksamen verdauen. Während der Fortsetzung des Verfahrens mit dem Gerinnungsmaterial, kann das Filtrat bei Raumtemperatur bis zur weiteren Verwendung in Schritt 3.6 gehalten werden. </li><li> Übertragen Sie die Knochenmark Blutgerinnsel Material in einen leeren Zellkulturschale mit einer sterilen Pinzette. Schneiden Sie den Schmutz in kleine Stücke von etwa 2 mm 3 mit einem sterilen Skalpell. </li><li> Übertragen der kleinen Stücke des Gerinnsels in einen 50 ml Reaktionsgefäß unter Verwendung der sterilen Pinzette. Stellen Sie sicher, dass das Hackfleisch Gerinnsel hat eine Wet-Optik. Wenn es trocken zu sein scheint, verwenden Sie etwas von dem Filtrat aus Schritt 3.1 zu befeuchten. </li><li> Man reibt das Gerinnsel durch Auf- und Abpipettieren für 5-mal mit einer 5 ml Pipette Mikrotiterplatten. 1 Aliquot von Urokinase an der Probe. Inkubieren für 30 min bei 37 ° C entweder in einem Wasserbad oder inein Schütteln (sanft) Inkubator. </li><li> Verreiben durch Auf- und Abpipettieren für 5 mal mit einer 5-ml-Pipette. Führen Sie diesen Schritt in einer Biosicherheitswerkbank. Inkubieren für weitere 30 min bei 37 ° C. Nach der Inkubation verreiben wieder 5-mal mit einer 5 ml Pipette. Fahren Sie über eine neue 100 um Zellsieb mit dem Filtrat aus Schritt 3.2 zu bündeln. </li><li> Zentrifuge die Zellsuspension bei Raumtemperatur für 10 min bei 500 x g. Überstand verwerfen. Re-suspend das Zellpellet in Medien wie unten oder nach dem Standardverfahren Ihres Labors für MSC Expansion Kultur beschrieben. </li></ol> 4. Seeding für Expansion Zellkultur und CFU-Platten <ol><li> Resuspendieren der Zellen (die aus Erythrozyten und mononukleäre Zellen) in 50 ml Basalmedium: Alpha-MEM mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 100 U / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin und 2,5 mg / ml Amphotericin B supplementiert . Zählen Sie die Zellen 1:10 in Trypanblau Lösung unter Verwendung einer Neubauer chamber. </li><li> Platte, die Zellen in Zellkulturflaschen in einer Dichte von 5 × 10 7 Zellen / cm 2 und Inkubation in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C. Falls vorhanden, hypoxische (5% Sauerstoff) Bedingungen. Für den CFU-Assay Steuerung Platte 10 9 Zellen in einer Zellkulturschale von 10 cm Durchmesser. </li><li> Nach 3 Tagen Kultur werden die mesenchymalen Stammzellen an der Zellkulturschale befestigt ist, während andere Zellen in Suspension verbleiben. Ändern der Medien mit Basalmedium mit 5 ng / ml basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) ergänzt. Für die CFU-Test Kontrolle, Behandlung der Zellkulturschale ebenfalls. </li><li> Weiterhin Zellkultur für insgesamt 2 Wochen Austausch von Medien dreimal wöchentlich. Wenn die Zellen 80% Konfluenz überschreiten, durch Trypsinierung aufgeteilt. Für den CFU-Assay Steuerung, tauschen die Medien ebenfalls, doch spalten nicht die Zellen im Verlauf der zwei Wochen. </li></ol> 5. Giemsa Stain für CFU-Assay <ol><li> Bereiten Sie 10 ml Giemsa-Lösung pro Schale: dilute die Stammlösung (7,6 g / l Giemsa in Glycerin: Methanol) 1:10 in sterilem Wasser (immer eine neue Arbeitsverdünnung). </li><li> Druckmaterial aus der Zellkulturschale und waschen Sie die Zellen mit PBS. Seien Sie sehr vorsichtiger bei der Anwendung von Flüssigkeit auf die Petrischale und vermeiden Abwaschen der Zellen. </li><li> Fix Zellen in reinem Methanol für 5 min bei RT. Entsorgen Sie die Methanol. Hinzufügen die Giemsa-Lösung und Inkubation für 60 min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C. </li><li> Zweimal mit PBS waschen. Air zuerst trocknen Sie die Platte Kopf auf einem Papiertuch. Die Kolonien manuell. Dies wird am besten mit einem Filzstift auf der Rückseite der Platte erreicht. </li></ol> 6. MSC Differenzierung <ol><li> Canine MSCs Differenzierung HINWEIS: Canine MSCs wurden in chondrogene, knochenbildende und adipogene Linien durch Stimulation mit den entsprechenden Medien über vier Wochen differenziert. </li><li> Für Adipogene Differenzierung, Kultur MSCs in Monolayer bei 4 x 10 5 cells / cm 2 abwechselnd zwei unterschiedliche Kulturbedingungen wie folgt; <ol><li> Kultur in Adipogenese Erhaltungsmedium, das DMEM + GlutaMAX, 3% FBS, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin, 2,5 ug / ml Amphotericin B und 170 mM Insulin. </li><li> Kultur in Adipogenese Induktionsmedium mit Erhaltungsmedium mit 3% FBS, 5% Kaninchenserum, 1 uM Dexamethason ergänzt, 500 uM 3-Isobutyl-1-Methylxanthin, 33 uM Biotin, 5 uM Rosiglitazon und 17 uM Pantothenat 16. </li><li> Schwelgen Sie die Lipidtröpfchen durch Färbung mit Oil Red-O. Kurz gesagt, reparieren Zellen mit 10% Formaldehyd, mit PBS waschen und färben mit 0,35% Oil red O in Isopropanol. </li></ol></li><li> Für osteogene Differenzierung Kultur MSCs in Monoschicht auf 7 x 10 3 Zellen / cm 2 und in der folgenden zu stimulieren: <ol><li> Erweiterte DMEM (GIBCO) + GlutaMAX, 5% FBS, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin, 2,5 ug / ml Amphotericin B, 501; M L-Ascorbinsäure-2-phosphat, 10 mM ß-Glycerophosphat und 100 nM Dexamethason. </li><li> Identifizieren Sie die Mineralisierung Einlagen von Von Kossa-Färbung (5% AgNO 3). Kurz gesagt, fixieren Sie die Zellen mit 10% Formaldehyd, Waschen mit PBS und Fleck mit 5% AgNO 3 in destilliertem Wasser. </li></ol></li><li> Chondrogene Differenzierung <ol><li> Cut Würfel (3 mm je Seite) von einem Schwamm geformt Medizinprodukt, gebildet aus lyophilisierten Kollagen Typ I, und als Gerüstmaterial verwendet, um Zellen 17 zu unterstützen. </li><li> Seed MSCs auf der Oberseite der Würfel in einer Konzentration von 4 x 10 6 Zellen / ml (~ 70.000 Zellen / Cube). </li><li> Vor der Zugabe der Medien, um die Zellen, die den Würfel 30 Minuten einzuhalten. </li><li> Pflegen MSC-Kollagenstrukturen in chondrogenem Medium aus DMEM / F12 + GlutaMAX, 2,5% FBS, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin, 2,5 ug / ml Amphotericin B, 40 ng / ml Dexamethason, 50 ug / ml Ascorbinsäure -2-phosphat,50 ug / ml L-Prolin, 1x Insulin-Transferrin-Selen-X, und 10 ng / ml transformierender Wachstumsfaktor-β1. </li><li> Verwenden Alcianblau Färbung, um die Ansammlung von Proteoglykanen in Konstrukte Abschnitte zu visualisieren. Kurz gesagt, färben die Abschnitte O / N mit 0,4% Alcianblau in 0,01% H 2 SO 4 und 0,5 M Guanidinhydrochlorid. Anschließend wurden die Schnitte waschen für 30 min in 40% DMSO und 0,05 M MgCl 2 gewaschen. Die Zellen wurden mit Kernechtrot gegengefärbt. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Routinemäßig wir probieren Knochenmark, während der Patient in der Chirurgie (in unserem Fall vor allem Wirbelsäulenchirurgie), mit dem Vorteil, dass nur wenig zusätzliche Arbeit muss durch das Personal im Operationssaal durchgeführt werden. Auch wenn die Proben mit Natriumcitrat sofort nach Entnahme gemischt wurden viele Proben teilweise geronnen, wenn sie im Labor zur Verarbeitung angekommen. Zu diesem Zeitpunkt würde Resampling zu Clotted Exemplare zu ersetzen eine separate zusätzliche Intervention erforderlich wiede...

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) spielen eine wichtige Rolle in der regenerativen Medizin und des Tissue Engineering. Sie können Migration, Differenzierung in verschiedene Zelltypen 1 und einprägen, die ihnen die idealen Kandidaten für autologe Therapien 2,3 macht. In letzter Zeit, klinischen Studien mit MSCs für Knochen- und Knorpelreparatur, Graft-versus-Host-Erkrankung oder Herzerkrankung wurden eingeführt 4. Diese MSCs aus der Nabelschnur oder Fettgewebe gewonnen werden, sondern die vielversprechendsten Ergebnisse wurden aus dem Knochenmark stammenden Stammzellen 5 erhalten. Der Beckenkamm ermöglicht, eine beträchtliche Menge von Knochenmark gesammelt und dient daher als Hauptstelle der Aspiration 6. Die Qualität des Aspirat nimmt jedoch mit zunehmendem Volumen von Knochenmark entnommen. Während die ersten 5 ml Knochenmarkaspirat enthält MSCs von hoher Qualität, Entzug von größeren Mengen führt zu einer Verwässerung des absaugen mit peripheren Blut fROM Die gefäßKnochen 7. Aufgrund der gegenwärtigen Megakaryozyten-Plättchen sind Knochenmarkaspiraten anfällig für die Blutgerinnung, es sei denn, Antikoagulanzien eingesetzt werden. Aber auch mit Antikoagulantien kann Blutgerinnsel auftreten. Im Knochenmark-MSCs stellen nur einen kleinen Anteil der Gesamtzellpool 8 und haben in Kultur für die meisten Gewebezüchtung oder therapeutische Anwendungen 4 erweitert werden. Die Qualität einer solchen Kultur hängt weitgehend von der ursprünglichen Zellpool, dh., Vielfalt und eine hohe Startnummer 9. Niedrige Werte von MSCs aus Entnahmen kann teilweise durch Spendervariabilität erklärt werden. Auf der anderen Seite, MSCs von niedriger Qualität Proben erfordern längere Zeit in der Kultur und erweitert Passage, um die gewünschte Anzahl von Zellen zu erreichen. In jedem Fall ist verlängert Passagierung eine Quelle von Zellalterung und kann zum Verlust der Differenzierungspotential 10 führen. Daher optimierte Protokolle, Zell y maximieren könnenield und verhindert nachteilige Effekte entwickelt 11,12 werden müssen. Als wir begannen, mit Hunde-MSCs zu arbeiten, waren wir erstaunt zu sehen, dass etwa drei von vier Hundeknochenmarkproben enthalten Blutgerinnsel, während glücklicherweise geronnen Humanproben (jede zehnte) wurden weniger häufig. Auf der anderen Seite war es keine Überraschung, dass wir viel niedrigeren Renditen von MSCs aus geronnenen Proben beobachtet. Um die wiederkehrende Frage der geronnenen Proben zu lösen, haben wir das Protokoll entwickelt, mit dem Thrombolytikum Urokinase anstelle von Resampling. Thrombolytische Therapien lebensbedrohlichen Situationen wie Verschluss von Blutgefäßen verursacht Herzinfarkt, Schlaganfall oder Embolien aufgrund unerwünschter Blutgerinnung entgegenwirken. Sie wirken, indem sie den Abbau der Thromben durch enzymatische Spaltung von Fibrin durch Plasmin und Enzym Plasminogenaktivatoren. Trotz der breiten Verwendung zur Behandlung von Patienten, existieren nur sehr wenige Veröffentlichungen, die verwendet thrombolytischen Aktivitätenfür Laboranwendungen bis geronnenen Proben zu retten, vor allem mit Schwerpunkt auf Lymphozyten. 1987 Nikus et al. beschrieben die Verwendung von Streptokinase zur Auflösung von Blutgerinnseln, was zu Funktions Lymphozyten 13 und vier Jahre später, De Vis et al. erweitert die Verwendung von Streptokinase Leukämiezellen aus Blut und Knochenmark für die Durchflusszytometrie-Anwendungen 14 zu isolieren. Eine neuere Veröffentlichung schlägt die Verwendung von Alteplase für die Krebsdiagnostik 15. Während der Verwendung des gleichen Enzym Ansatz konzentriert sich unser Protokoll für die Isolierung von multi MSCs Form Knochenmark, um ein Werkzeug für Forscher in der Stammzell-Bereich bieten.

<table><tbody><tr><td>Basal Medium Komponenten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PenStrep 100X</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Human FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>MEM Alpha mit Nukleosid, mit stabilem Glutamin</td><td>Amimed</td><td>1-23S50-I</td><td></td></tr><tr><td>FBS Hitzeinaktiviertes</td><td>Amimed</td><td>2-01F36-I</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Applichem</td><td>A1907</td><td></td></tr><tr><td>Adipogene Mediumkomponenten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM-HAM F12 + GlutaMAX</td><td>Amimed</td><td>1-26F09-I</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Serum&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>16120099</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Applichem</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthin</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Biotin &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazon&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R2408</td><td></td></tr><tr><td>Pantothenat&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5155</td><td></td></tr><tr><td>Öl Rot-O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr>Komponenten <td></td><td></td><td></td><td>des osteogenen Mediums</td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure 2-phosphat</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-glycerophosphat</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Silbernitrat (AgNO3)</td><td>Sigma</td><td>S6506</td><td></td></tr><tr><td>Komponenten des chondrogenen Mediums</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biopad - schwammförmiges Medizinprodukt&nbsp;</td><td>Euroresearch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Prolin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5607</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selen X</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>Menschlicher transformierender Wachstumsfaktor-&beta; 1&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Sigma</td><td>A3157</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear Fast Red</td><td>Sigma</td><td>N8002</td><td></td></tr><tr><td>Generisches</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tri-Natriumcitrat-Dihydrat</td><td>Applichem</td><td>A3901</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Applichem</td><td>964.9100</td><td></td></tr><tr><td>Urokinase</td><td></td><td>Medac 1976826</td><td></td></tr><tr><td>0,5% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Färbung</td><td>Applichem</td><td>A0885</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Applichem</td><td>A0877</td><td></td></tr><tr><td>Schwefelsäure (H2SO4)</td><td>Applichem</td><td>A0655</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Applichem</td><td>A1584</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid (MgCl2)</td><td>Applichem</td><td>A3618</td><td></td></tr><tr><td>Guanidinhydrochlorid</td><td>Applichem</td><td>A1499</td><td></td></tr><tr><td>Verbrauchsmaterial</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Reaktionsröhrchen</td><td>Axygen</td><td>SCT-50ML-25-S</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Spritze</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>Sterican Nadel (22G)</td><td>Braun</td><td>4657624</td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml Mikroröhrchen</td><td>Brunschwig</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m Zellsieb</td><td>Falcon</td><td>6.05935</td><td></td></tr> sterile <tr><td>Pinzette</td><td>Bastos Viegas, SA</td><td>489-001</td><td></td></tr><tr><td>steriles Skalpell</td><td>Braun</td><td>5518059</td><td></td></tr><tr><td>Primaria Zellkulturschale</td><td>Falcon</td><td>353803</td><td></td></tr><tr><td>C-Chip Neubauer Improved</td><td>Bioswisstech</td><td>505050</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturflasche - Flask T300</td><td>TPP</td><td>90301</td><td></td></tr><tr><td>Ausstattung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrobiologische Sicherheitswerkbank Klasse II</td><td>Skan</td><td>82011500</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Memmert</td><td>1305.0377</td><td></td></tr><tr><td>Stripettes Serologische Pipette 5ml</td><td>Corning</td><td>4487-200ea</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>befeuchteter Inkubator Heracells 240</td><td>Thermo wissenschaftliche</td><td>51026331</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 1S-R</td><td>Thermo wissenschaftliche</td><td>75004331</td><td></td></tr></tbody></table>

ein enzymatisches verfahren zur mesenchymalen stammzellen aus knochenmarkproben clotted rettung

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) - normalerweise aus Knochenmark gewonnen - benötigen oft eine Expansionskultur. Unser Protokoll verwendet Urokinase in klinischer Qualität, um Gerinnsel im Knochenmark abzubauen und MSCs für die weitere Verwendung freizusetzen. Dieses Protokoll bietet eine schnelle und kostengünstige Alternative zur Knochenmarkprobenahme. Knochenmark ist eine wichtige Quelle für MSCs, die für das Tissue Engineering und autologe Stammzelltherapien interessant sind. Bei der Entnahme kann das Knochenmark gerinnen, da es das gesamte hämatopoetische System umfasst. Die resultierenden Gerinnsel enthalten auch MSCs, die für die Expansionskultur oder die direkte Stammzelltherapie verloren gehen. Wir stellten fest, dass 74 % der Knochenmarkproben von Hunden Gerinnsel enthielten und weniger als die Hälfte der Stammzellzahl ergaben, die von nicht geronnenen Proben erwartet wird. Daher haben wir ein Protokoll für den enzymatischen Verdau dieser Gerinnsel entwickelt, um arbeitsintensive und kostspielige Knochenmark-Neuproben zu vermeiden. Urokinase - ein klinisch zugelassenes und leicht verfügbares Thrombolytikum - beseitigt die Knochenmarkgerinnsel fast vollständig. Infolgedessen ergeben behandelte Knochenmarkaspirate eine ähnliche Anzahl von MSCs wie ungeronnene Proben. Auch nach der Urokinase-Behandlung behielten die Zellen ihre Stoffwechselaktivität und die Fähigkeit, sich in chondrogene, osteogene und adipogene Linien zu differenzieren. Unser Protokoll rettet geronnene Blut- und Knochenmarkproben, ohne die Qualität der Zellen zu beeinträchtigen. Dies macht die erneute Probenahme überflüssig, reduziert die Probenahmekosten erheblich und ermöglicht die Verwendung von geronnenen Proben für Forschung oder Therapie.

Die Tatsache, dass 74% der Hundeknochenmarkproben (n = 54) enthalten sind Blutgerinnsel, wenn sie in unserem Labor (1A) kam zusammen mit verringerter MSC Erträge aus diesen Proben, hat uns davon überzeugt, dass eine beträchtliche Anzahl von MSCs wurde innerhalb der Blutgerinnsel gefangen . Tatsächlich ist ein einfaches DAPI-Färbung des geschnittenen Nungsmaterial bestätigt die Anwesenheit von kernhaltigen Zellen in hoher Dichte (1B). Dies führt letztlich zu geringe Zahl von MSCs für die...

Mesenchymale Stammzellen werden normalerweise aus Knochenmark gewonnen und benötigen eine Expansionskultur. Wenn Proben vor der Verarbeitung gerinnen, kann ein Protokoll mit dem (enzymatischen) thrombolytischen Medikament Urokinase angewendet werden, um das Gerinnsel abzubauen. So werden Zellen freigesetzt und stehen für die Expansionskultur zur Verfügung. Dieses Protokoll bietet eine schnelle und kostengünstige Alternative zur erneuten Probenahme.

Ein enzymatisches Verfahren zur mesenchymalen Stammzellen aus Knochenmarkproben Clotted Rettung

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, geronnenes Knochenmark durch Verdauung der Gerinnsel mit Urokinase nutzbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Knochenmarkprobe über einen Zellfilter filtriert wird. Anschließend wird das Knochenmarkgerinnsel in kleine Stücke geschnitten.Anschließend wird das Gerinnsel in ein Falcon-Röhrchen überführt und mit Urokinase verdaut. Schließlich wird das verdaute Gerinnselmaterial zur Vermehrung mesenchymaler Stammzellen oder MSCs ausgesät. Abschließend werden die Platten mithilfe von em sustain mit einer Kontrollplatte verglichen, um die Wirksamkeit des Verdauungsprozesses zu bewerten.Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die autologe Stammzelltherapie oder -diagnostik. Denn für Transplantate ist die Vermehrung und Differenzierung einer großen Anzahl von Stammzellen erforderlich. Die Idee zu dieser Methode kam uns erstmals, als wir bemerkten, dass viele Knochenmarkproben von DOC bereits geronnen waren, als sie in unserem Labor eintrafen.Wir wollten solch wertvolle Proben einfach nicht wegwerfen, um Urokinase wiederherzustellen. Geben Sie 10 Milliliter sterile PBS in die Septum-Einlassflasche und wirbeln Sie, um eine Konzentration von 50.000 Einheiten pro Milliliter zu erreichen. Portionieren Sie 500 Mikroliter mit jeweils 25.000 Einheiten in sterile Röhrchen und lagern Sie bei minus 20 Grad Celsius bis zu sechs Monate lang, um eine Verdauungsreaktion durchzuführen. Tauen Sie ein Aliquot Urokinase pro getrübter Knochenmarkaspiratprobe von bis zu 25 Milliliter auf.Heizen Sie ein Wasserbad oder einen schüttelnden Inkubator unter einem laminaren Luftstrom-Biosicherheitsschrank auf 37 Grad Celsius vor. Legen Sie unter Einhaltung von Handschutz einen 100-Mikrometer-Zellfilter auf ein 50-Milliliter-Röhrchen. Gießen Sie das Knochenmarkaspirat vorsichtig durch den Zellfilter, wobei Sie den Filter kippen oder das Gerinnselmaterial bewegen.Geben Sie das Knochenmarkaspirat vorsichtig durch den Zellfilter, ohne den Filter zu kippen oder das Gerinnselmaterial zu bewegen. Verwenden Sie eine sterile Pipette, um den Durchfluss durch das Filternetz mit sterilen Pinzetten zu verbessern. Überführen Sie das Knochenmark-Gerinnselmaterial in eine leere Zellkulturschale.Verwenden Sie dann ein steriles Skalpell, um das Gewebe in zwei Kubikmillimeter große Stücke zu schneiden. Danach pipettieren Sie den Gerinnsel mit einer 5-Milliliter-Mikrotiterpipette fünfmal auf und ab, um ihn zu tritrieren. Fügen Sie anschließend eine Aliquotportion Urokinase zur Probe hinzu und inkubieren Sie diese 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad oder einem schüttelnden Inkubator.Nach der Inkubation im Sicherheitswerkbank wird erneut titriert und für zusätzliche 30 Minuten inkubiert. Anschließend fünfmal erneut titrieren und die Probe über einen frischen 100-Mikrometer-Zellsieb geben und mit dem initialen Filtrat vereinigen. Die Zellsuspension bei 500 × g und Raumtemperatur 10 Minuten lang zentrifugieren. Nach dem Verwerfen des Überstandes den Pellet mit 50 Milliliter Basalmedium resuspendieren.Verdünnen Sie mit Tripanblau-Lösung ein ALI-Quart einer resuspendierten Zellprobe im Verhältnis 1:10 und geben Sie die Suspension in eine Neubauer-Kammer, um die Zellen zu zählen. Nach der Zellzählung impfen Sie sie in Zellkulturgefäße mit einer Dichte von fünf mal 10 hoch sieben Zellen pro Kubikzentimeter für die CFU-Assay-Kontrollplatte aus.10^9 Zellen in einer runden Zellkulturschale mit 10 cm Durchmesser in einer befeuchteten Kammer bei 37 °C inkubieren. Nach drei Tagen Kultivierung haften die MSCs an der Zellkulturschale, während andere Zellen in Suspension verbleiben. Verwenden Sie Basalmedium, das fünf Nanogramm pro Milliliter basischen Fibroblastenwachstumsfaktor enthält, um das Medium in den experimentellen und Kontrollplatten zu erneuern.Kultivieren Sie weiter für insgesamt zwei Wochen. Ersetzen Sie das Medium dreimal pro Woche. Wenn die Zellen eine Konfluenz von mehr als 80 % erreichen, behandeln Sie die Kultur mit Trypsin und teilen Sie sie, um den CFU-Assay durchzuführen.Bereiten Sie 10 Milliliter GSA-Lösung pro Platte vor, indem Sie die Stammlösung mit steriler Wasser im Verhältnis 1:10 verdünnen. Entfernen Sie das Medium aus der Zellkulturplatte und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit PBS und reinem Methanol.Fixieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Danach entsorgen Sie das Methanol und geben die Gemsa-Lösung hinzu. Inkubieren Sie im feuchten Kammer bei 37 Grad Celsius für 60 Minuten nach der Inkubation.Spülen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Anschließend lassen Sie die Platte an der Luft trocknen. Legen Sie sie zuerst auf ein Papierhandtuch mit einem Marker auf der Rückseite der Platte.Die Kolonien für die adipogene Differenzierung manuell zählen. Kultivieren Sie MSCs in einer Monoschicht bei vier mal 10 hoch fünf Zellen pro Quadratzentimeter. Wechseln Sie zwischen zwei verschiedenen Kulturbedingungen für die erste Bedingung abwechselnd.Kultivieren Sie die Zellen in einem Adipogenese-Erhaltungsmedium und für die zweite Bedingung in einem Adipogenese-Induktionsmedium mit Erhaltungsmedium gemäß den im Textprotokoll beschriebenen Rezepturen. Um die Lipidtröpfchen sichtbar zu machen, fixieren Sie die Zellen kurz mit 10 % Formaldehyd.Waschen Sie die Zellen anschließend mit PBS, bevor Sie die Zellen mit 0,35 % Ölrot O in Isopropanol färben, um die osteogene Differenzierung von MSCs in einkacheliger Kultur bei sieben mal 10 der dritten Zellen pro Quadratzentimeter zu beurteilen. Nach Stimulation der Zellen mit dem im Textprotokoll beschriebenen Medium fixieren Sie die Zellen kurz mit 10 % Formaldehyd. Nachdem die Zellen mit PBS gewaschen wurden, verwenden Sie Von Kossa-Färbung, um Mineraleinlagerungen nachzuweisen, um die konogene Differenzierung aus einer schwammförmigen medizinischen Vorrichtung durchzuführen, die aus lyophilisierten Kollagen-Typ-I-Würfeln mit einer Kantenlänge von drei Millimetern besteht. Säen Sie MSCs mit einer Konzentration von vier mal 10 hoch acht Zellen pro Milliliter auf die Würfel auf, nachdem Sie die Zellen 30 Minuten bei Raumtemperatur an die Würfel anhaften ließen.Die MSC-Kollagen-Konstrukte in kongenem Medium gemäß dem im Textprotokoll aufgeführten Verfahren kultivieren. Den Schnitten 0,4 % Ian-Blau-Lösung hinzufügen und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag die Zellen 30 Minuten lang mit 40 % DMSO und 0,05 molarer Magnesiumchloridlösung waschen, bevor mit Nuclear Fast Red eine Gegeneinfärbung der Zellen durchgeführt wird, wie hier gezeigt. Mittels einer einfachen DAPI-Färbung von Schnitten des Gerinnselmaterials lässt sich die Anwesenheit von kernhaltigen Zellen in hoher Dichte nachweisen, was darauf hinweist, dass eine beträchtliche Anzahl von MSCs in den Gerinnseln eingeschlossen ist. Unter Verwendung des in diesem Video beschriebenen Protokolls ermöglichte die Behandlung mit Urokinase die Verdauung sämtlichen Materials bis auf 15 % nach Gewicht bei Hundegerinnseln und 9 % nach Gewicht bei menschlichen Gerinnseln, um die Wirksamkeit der Urokinase-Verdauung zu bestimmen. Zellen aus filtrierten Proben von geronnenem Material und verdauten Gerinnseln wurden getrennt angesiedelt und zwei Wochen lang inkubiert.Die Em-Suspendierung der Zellen zeigte 3,8-mal mehr KBEs aus urokinaseverdauten kaninen Proben als aus den entsprechenden initialen Filtraten. Menschliche verdauten Proben zeigten 1,6-mal mehr KBEs als die undigierten Filtrate. In diesem Experiment wurden MSCs aus Knochenmarkproben mit Gerinnseln mit MSCs aus geronnenen Knochenmarkproben von UNC hinsichtlich ihrer Differenzierungsfähigkeit unter geeigneten Kulturbedingungen verglichen.Nach vierw&ouml;chiger Kultur lie&szlig;en sich MSCs aus digerierten Proben in adipogene, osteogene und kongenische Linien differenzieren. Dar&uuml;ber hinaus zeigten F&auml;rbungen mit von Kossa, Oil Red O und Azan-Blau keine Unterschiede im Differenzierungsgrad zwischen den Gruppen. Wenn man es einmal beherrscht, kann Mr. Nick in etwa anderthalb Stunden durchgef&uuml;hrt werden, wenn es ordnungsgem&auml;&szlig; ausgef&uuml;hrt wird.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man me hemo Stammzellen für die Kultur zur Expansion isoliert, selbst wenn Ihre Proben geronnen sind, anstatt die Probe wegzuwerfen. Unser Protokoll verwendet das Enzym Kinase, um den Gerinnsel zu verdauen, und ES Stammzellen für die Kultur zur Expansion.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Rat MSCs wurden aus Oberschenkel-und Unterschenkelknochen isoliert und dann durch magnetische Zellsortierung angereichert. Sortiert Zellen wurden für die Expression der Oberflächenmarker durchflusszytometrisch bestätigt. Diese Zellen wurden auch bei klonaler Dichte kultiviert werden, um einzelne Kolonien bilden, und dann dieser Kolonien wurden durch Klonen Zylinder getrennt.

Isolierung und Anreicherung von Rat mesenchymalen Stammzellen (MSCs) und Separation von Single-Kolonie Derived MSCs

Verfahren, um die Verteilung von Knochenmark hämatopoietischen Vorläuferzellen in Durchflusszytometrie sowie effizient zu isolieren hochgereinigten hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Analyse beschrieben. Die Isolierung Verfahren im wesentlichen auf magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen und Zell-Sortierung, um HSK für zelluläre und molekulare Studien zu reinigen bezogen.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) haben ein Differenzierungspotenzial in Richtung osteoblastischer Linie, wenn sie mit löslichen Faktoren oder spezifischen Biomaterialien stimuliert werden. Diese Arbeit stellt eine neuartige Option für die Verabreichung von MSCs aus der humanen Amnionmembran (AM-hMSCs) vor, die die bovine Knochenmatrix Nukbone (NKB) als Gerüst verwendet.

Isolierung von humanen mesenchymalen Stammzellen und deren Anbau an der porösen Knochenmatrix

Die Kultivierung von humanen mesenchymalen Stromazellen (hMSCs) mit autologem Serum, reduziert das Risiko der Abstoßung durch xenogene Material und andere negative Auswirkungen. Es ermöglicht auch die Rückgewinnung von einer Untergruppe von mesodermalen Vorläufern, die frische hMSCs liefern kann. hMSCs in einem Eigen Fibringerinnsels Einbetten ermöglicht eine einfache Handhabung und effektive chirurgische Implantation.

Mesenchymale Stromazellen Zellkultur und Lieferung in Autologe Bedingungen: Ein intelligenter Ansatz für orthopädische Anwendungen

Dieses Protokoll zeigt ein sicheres und effizientes Verfahren zur CD133 ändern+ Hämatopoetischen Stammzellen. Der vorgestellte nicht-viralen, magnetische Polyplex basierenden Ansatz kann eine Grundlage für die Optimierung der therapeutischen Stammzellen Effekte sowie für die Überwachung der verabreichten Zelle Produkt per Magnet-Resonanz-Tomographie bilden.

Protokoll für MicroRNA Transfer an adulten Knochenmark gewonnenen Hämatopoetischen Stammzellen Zelle Engineering kombiniert mit magnetischen Ausrichtung ermöglichen

Dieses Protokoll bietet eine enzymfreie Methode zur Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus abdominoplastischen und lipoaspiratischen Proben mit einer Explant-Methode. Das Fehlen harter Enzyme oder Zentrifugationsschritte sieht klinisch relevante Stammzellen vor, die für Studien in vitro verwendet oder in die Klinik zurückgebracht werden können.

Eine enzymfreie Methode zur Isolierung und Expansion von humanen Adsetzen-abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung von humanen mesenchymalen Stammzellen unter Verwendung der Einzelzellsortierungsmethode. Insbesondere kann durch den Einsatz der Einzelzellsortierung eine Reinheit von 99 % der immunphänotypisierten Zellen aus einer heterogenen Population erreicht werden, wenn sie mit einem multiparametrischen Durchflusszytometrie-basierten Ansatz kombiniert wird.

Einzelzellsortierung von immunphänotypisierten mesenchymalen Stammzellen aus humanen abgeblätterten Milchzähnen

Hier stellen wir Protokolle vor, die die Isolierung von Stromazellen aus murinem Knochen, Knochenmark, Thymus und menschlichem Thymusgewebe ermöglichen, die mit Einzelzell-Multiomics kompatibel sind.

Isolierung von Stromazellen aus hämatopoetischen Organen

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein kostengünstiges Verfahren zur Reinigung, Erweiterung und Charakterisierung von hochhomogenen mesenchymalen Stammzellen (BMSCs) des Knochenmarks von Mäusen. Dieser Ansatz ermöglicht die Gewinnung großer Mengen von BMSCs mit hohem Proliferations- und Differenzierungspotenzial, unterstützt Mausmodelle und fördert die präklinische Forschung.

Aufreinigung, Expansion und durchflusszytometrische Phänotypisierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark der Maus

Dieses Protokoll beschreibt eine magnetische perlenbasierte Sortiermethode, bei der phycoerythrin-(PE)-markierte Flusszytometrie-Antikörper und Anti-PE-Mikroperlen verwendet werden, um spezifische mesenchymale Stammzellsubpopulationen mit hoher Postsort-Zielmarker-Positivität und erhaltener CCK-8-basierter Proliferation/Stoffwechselaktivität unter den getesteten Bedingungen zu isolieren, ohne teure Zellsortierer oder zielspezifische individuelle Perlen zu benötigen.

Isolierung und Validierung von Podoplanin-positiven mesenchymalen Stammzellsubpopulationen mit einer indirekten magnetischen Perlenstrategie

Lernen Sie ein enzymatisches Verfahren zur Rettung mesenchymaler Stammzellen aus geronnenen Knochenmarkproben mittels Urokinase. Diese Methode ermöglicht eine schnelle und kostengünstige Zellkultur für die regenerative Medizin.

Ein enzymatisches Verfahren zur mesenchymalen Stammzellen aus Knochenmarkproben Clotted Rettung

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