Ein enzymatisches Verfahren zur mesenchymalen Stammzellen aus Knochenmarkproben Clotted Rettung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, geronnenes Knochenmark durch Verdauung der Gerinnsel mit Urokinase nutzbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Knochenmarkprobe über einen Zellfilter filtriert wird. Anschließend wird das Knochenmarkgerinnsel in kleine Stücke geschnitten.

Anschließend wird das Gerinnsel in ein Falcon-Röhrchen überführt und mit Urokinase verdaut. Schließlich wird das verdaute Gerinnselmaterial zur Vermehrung mesenchymaler Stammzellen oder MSCs ausgesät. Abschließend werden die Platten mithilfe von em sustain mit einer Kontrollplatte verglichen, um die Wirksamkeit des Verdauungsprozesses zu bewerten.

Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die autologe Stammzelltherapie oder -diagnostik. Denn für Transplantate ist die Vermehrung und Differenzierung einer großen Anzahl von Stammzellen erforderlich. Die Idee zu dieser Methode kam uns erstmals, als wir bemerkten, dass viele Knochenmarkproben von DOC bereits geronnen waren, als sie in unserem Labor eintrafen.

Wir wollten solch wertvolle Proben einfach nicht wegwerfen, um Urokinase wiederherzustellen. Geben Sie 10 Milliliter sterile PBS in die Septum-Einlassflasche und wirbeln Sie, um eine Konzentration von 50.000 Einheiten pro Milliliter zu erreichen. Portionieren Sie 500 Mikroliter mit jeweils 25.000 Einheiten in sterile Röhrchen und lagern Sie bei minus 20 Grad Celsius bis zu sechs Monate lang, um eine Verdauungsreaktion durchzuführen. Tauen Sie ein Aliquot Urokinase pro getrübter Knochenmarkaspiratprobe von bis zu 25 Milliliter auf.

Heizen Sie ein Wasserbad oder einen schüttelnden Inkubator unter einem laminaren Luftstrom-Biosicherheitsschrank auf 37 Grad Celsius vor. Legen Sie unter Einhaltung von Handschutz einen 100-Mikrometer-Zellfilter auf ein 50-Milliliter-Röhrchen. Gießen Sie das Knochenmarkaspirat vorsichtig durch den Zellfilter, wobei Sie den Filter kippen oder das Gerinnselmaterial bewegen.

Geben Sie das Knochenmarkaspirat vorsichtig durch den Zellfilter, ohne den Filter zu kippen oder das Gerinnselmaterial zu bewegen. Verwenden Sie eine sterile Pipette, um den Durchfluss durch das Filternetz mit sterilen Pinzetten zu verbessern. Überführen Sie das Knochenmark-Gerinnselmaterial in eine leere Zellkulturschale.

Verwenden Sie dann ein steriles Skalpell, um das Gewebe in zwei Kubikmillimeter große Stücke zu schneiden. Danach pipettieren Sie den Gerinnsel mit einer 5-Milliliter-Mikrotiterpipette fünfmal auf und ab, um ihn zu tritrieren. Fügen Sie anschließend eine Aliquotportion Urokinase zur Probe hinzu und inkubieren Sie diese 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad oder einem schüttelnden Inkubator.

Nach der Inkubation im Sicherheitswerkbank wird erneut titriert und für zusätzliche 30 Minuten inkubiert. Anschließend fünfmal erneut titrieren und die Probe über einen frischen 100-Mikrometer-Zellsieb geben und mit dem initialen Filtrat vereinigen. Die Zellsuspension bei 500 × g und Raumtemperatur 10 Minuten lang zentrifugieren. Nach dem Verwerfen des Überstandes den Pellet mit 50 Milliliter Basalmedium resuspendieren.

Verdünnen Sie mit Tripanblau-Lösung ein ALI-Quart einer resuspendierten Zellprobe im Verhältnis 1:10 und geben Sie die Suspension in eine Neubauer-Kammer, um die Zellen zu zählen. Nach der Zellzählung impfen Sie sie in Zellkulturgefäße mit einer Dichte von fünf mal 10 hoch sieben Zellen pro Kubikzentimeter für die CFU-Assay-Kontrollplatte aus.

10^9 Zellen in einer runden Zellkulturschale mit 10 cm Durchmesser in einer befeuchteten Kammer bei 37 °C inkubieren. Nach drei Tagen Kultivierung haften die MSCs an der Zellkulturschale, während andere Zellen in Suspension verbleiben. Verwenden Sie Basalmedium, das fünf Nanogramm pro Milliliter basischen Fibroblastenwachstumsfaktor enthält, um das Medium in den experimentellen und Kontrollplatten zu erneuern.

Kultivieren Sie weiter für insgesamt zwei Wochen. Ersetzen Sie das Medium dreimal pro Woche. Wenn die Zellen eine Konfluenz von mehr als 80 % erreichen, behandeln Sie die Kultur mit Trypsin und teilen Sie sie, um den CFU-Assay durchzuführen.

Bereiten Sie 10 Milliliter GSA-Lösung pro Platte vor, indem Sie die Stammlösung mit steriler Wasser im Verhältnis 1:10 verdünnen. Entfernen Sie das Medium aus der Zellkulturplatte und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit PBS und reinem Methanol.

Fixieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Danach entsorgen Sie das Methanol und geben die Gemsa-Lösung hinzu. Inkubieren Sie im feuchten Kammer bei 37 Grad Celsius für 60 Minuten nach der Inkubation.

Spülen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Anschließend lassen Sie die Platte an der Luft trocknen. Legen Sie sie zuerst auf ein Papierhandtuch mit einem Marker auf der Rückseite der Platte.

Die Kolonien für die adipogene Differenzierung manuell zählen. Kultivieren Sie MSCs in einer Monoschicht bei vier mal 10 hoch fünf Zellen pro Quadratzentimeter. Wechseln Sie zwischen zwei verschiedenen Kulturbedingungen für die erste Bedingung abwechselnd.

Kultivieren Sie die Zellen in einem Adipogenese-Erhaltungsmedium und für die zweite Bedingung in einem Adipogenese-Induktionsmedium mit Erhaltungsmedium gemäß den im Textprotokoll beschriebenen Rezepturen. Um die Lipidtröpfchen sichtbar zu machen, fixieren Sie die Zellen kurz mit 10 % Formaldehyd.

Waschen Sie die Zellen anschließend mit PBS, bevor Sie die Zellen mit 0,35 % Ölrot O in Isopropanol färben, um die osteogene Differenzierung von MSCs in einkacheliger Kultur bei sieben mal 10 der dritten Zellen pro Quadratzentimeter zu beurteilen. Nach Stimulation der Zellen mit dem im Textprotokoll beschriebenen Medium fixieren Sie die Zellen kurz mit 10 % Formaldehyd. Nachdem die Zellen mit PBS gewaschen wurden, verwenden Sie Von Kossa-Färbung, um Mineraleinlagerungen nachzuweisen, um die konogene Differenzierung aus einer schwammförmigen medizinischen Vorrichtung durchzuführen, die aus lyophilisierten Kollagen-Typ-I-Würfeln mit einer Kantenlänge von drei Millimetern besteht. Säen Sie MSCs mit einer Konzentration von vier mal 10 hoch acht Zellen pro Milliliter auf die Würfel auf, nachdem Sie die Zellen 30 Minuten bei Raumtemperatur an die Würfel anhaften ließen.

Die MSC-Kollagen-Konstrukte in kongenem Medium gemäß dem im Textprotokoll aufgeführten Verfahren kultivieren. Den Schnitten 0,4 % Ian-Blau-Lösung hinzufügen und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag die Zellen 30 Minuten lang mit 40 % DMSO und 0,05 molarer Magnesiumchloridlösung waschen, bevor mit Nuclear Fast Red eine Gegeneinfärbung der Zellen durchgeführt wird, wie hier gezeigt.

Mittels einer einfachen DAPI-Färbung von Schnitten des Gerinnselmaterials lässt sich die Anwesenheit von kernhaltigen Zellen in hoher Dichte nachweisen, was darauf hinweist, dass eine beträchtliche Anzahl von MSCs in den Gerinnseln eingeschlossen ist. Unter Verwendung des in diesem Video beschriebenen Protokolls ermöglichte die Behandlung mit Urokinase die Verdauung sämtlichen Materials bis auf 15 % nach Gewicht bei Hundegerinnseln und 9 % nach Gewicht bei menschlichen Gerinnseln, um die Wirksamkeit der Urokinase-Verdauung zu bestimmen. Zellen aus filtrierten Proben von geronnenem Material und verdauten Gerinnseln wurden getrennt angesiedelt und zwei Wochen lang inkubiert.

Die Em-Suspendierung der Zellen zeigte 3,8-mal mehr KBEs aus urokinaseverdauten kaninen Proben als aus den entsprechenden initialen Filtraten. Menschliche verdauten Proben zeigten 1,6-mal mehr KBEs als die undigierten Filtrate. In diesem Experiment wurden MSCs aus Knochenmarkproben mit Gerinnseln mit MSCs aus geronnenen Knochenmarkproben von UNC hinsichtlich ihrer Differenzierungsfähigkeit unter geeigneten Kulturbedingungen verglichen.

Nach vierwöchiger Kultur ließen sich MSCs aus digerierten Proben in adipogene, osteogene und kongenische Linien differenzieren. Darüber hinaus zeigten Färbungen mit von Kossa, Oil Red O und Azan-Blau keine Unterschiede im Differenzierungsgrad zwischen den Gruppen. Wenn man es einmal beherrscht, kann Mr. Nick in etwa anderthalb Stunden durchgeführt werden, wenn es ordnungsgemäß ausgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man me hemo Stammzellen für die Kultur zur Expansion isoliert, selbst wenn Ihre Proben geronnen sind, anstatt die Probe wegzuwerfen. Unser Protokoll verwendet das Enzym Kinase, um den Gerinnsel zu verdauen, und ES Stammzellen für die Kultur zur Expansion.