Name: Sauerstoff-Glukose Deprivation und Reoxygenierung als In-vitro- Ischämie-Reperfusion Injury Modell zum Studium der Blut-Hirnschranke Dysfunction (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Erfahren Sie, wie Sauerstoff-Glukose-Deprivation und Reoxygenierung als In-vitro-Modell für Ischämie-Reperfusionsverletzungen eingesetzt werden, um die Dysfunktion der Blut-Hirn-Schranke zu untersuchen.

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Wir erkennen an, Scott and White Hospital Research Grants Program für die finanzielle Unterstützung und die Texas A &amp; M Health Science Center College of Medicine Integrated Imaging Laboratory für die Verwendung des konfokalen Lasermikroskop. Wir erkennen an, Mr. Glen Cryer für die Hilfe bei Manuskriptbearbeitung.

1. Seeding von Endothelzellen <ol><li> Erhalten Primärkulturen von RBMEC die von erwachsenen Sprague Dawley Ratten (oder erhalten sie im Handel). </li><li> Kulti RBMECs in 100 cm Fibronectin (50 ug / ml) beschichtete Petrischalen unter Verwendung des Rattenhirn endothelialen Zellwachstumsmedium. Ändern Sie das Medium alle zwei Tage, bis Konfluenz erreicht ist. </li><li> Bei Erreichen von 80 bis 90% Konfluenz, vorsichtig waschen Sie die Zellen in 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch Schwenken. Die Zellen werden dann, indem man sie 1 ml warmem 0,25% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) -Lösung, auf 37 ° C äquilibriert abgelöst. </li><li> Inkubieren der Zellen bei 37 ° C für 2-5 min, bis die Zellen abgelöst und dispergiert. HINWEIS: Tippen Sie auf die Kulturschale, um die Zellen zu lösen. Ansicht Zellen unter dem Mikroskop, um eine vollständige Ablösung der Zellen von der Oberfläche der Schale zu bestätigen. </li><li> 5 ml vollständigem Medium in eine Petrischale, um Trypsin zu neutralisieren.Pipettieren Sie das Medium, das abgelösten Zellen und sammeln sie in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. . </li><li> Zentrifugieren Sie die Medien, die Endothelzellen bei 220 xg für 5 min. </li><li> Saugen Sie den Überstand und die Erhaltung der Pellet, das cells.Suspend das Pellet in 3-5 ml frischem Rattenhirn endothelialen Zellwachstumsmedium durch sanftes Mischen nach oben und unten mit Pipette Zellen werden dann unter Verwendung von automatisierten Zellzählers oder einer Zählkammer gezählt werden. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension in Fibronektin (50 ug / ml) vorbeschichtet 8 auch sterile Kammer Schlittensystem, 0,7 cm 2 / gut mit einer Aussaatdichte im Bereich von 10.000-15.000 Zellen pro Vertiefung. Wachsen die Zellen bei 37 ° C bis zur Konfluenz erreicht ist HINWEIS: Für die Durchführung Western Blots oder anderen Experimenten Zellen in 10 cm Zellkulturschalen oder spezielle Gerichte wie durch das Experiment erforderlich gehalten werden. </li></ol> 2. Sauerstoff und Glukose-Entzug-Reoxygenierung In-vitro-Modell HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde von Zulueta et al angepasst. 1997; Zhu H et al. 2012 8,9. <ol><li> Verwenden Sie die Hypoxie Zellkultursystem, um die Auswirkungen der OGD-R auf RBMECs in (siehe Abbildung 1) zu studieren. Eingestellt und justiert die Hypoxie Zellkultursystem vor Beginn des Experiments gemß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Entfernen der zusammenlaufenden Kammerobjektträgern (Schritt 1.8) von dem 37 ° C Inkubator. Ersetzen die Vollmedium in der Kammer Schlitten mit desoxygeniertem, keine Glucose, Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) und Hypoxie Kammer mit 95% N 2 und 5% CO 2 für 2 h bei 37 ° C vorgelegt, auf OGD Zustand darzustellen. </li><li> Verschieben Sie die Zellen zurück in den Inkubator mit 95% O 2, 5% CO 2 bei 37 ° C und mit frischem Rattenhirn Endothelzellenkomplettmedium vorgesehen und inkubiere für 1 weitere Stunde bei 37 ° C. Hinweis: Dieser Schritt stellt eine Reoxygenierung Situation. </li><li> Mithilfe der Kammer-Objektträgern für Immunfluoreszenzlokalisierung und Rhodamin-Phalloidin Kennzeichnung (siehe Kapitel 3). </li></ol> 3. Immunfluoreszenz Lokalisierung von ZO-1 und f-Actin-Labeling Mit Rhodamin Phalloidin <ol><li> Setzen Sie das Kammer-Objektträgern enthalten RBMEC Monoschichten zu 100 ul opti-MEM / reduzierter Serum Medien / well 1 h. 3-mal in 100 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,0 bis 7,2) Waschen Sie die Kammer-Objektträgern. </li><li> Fixieren die Zellen unter Verwendung von 100 ul 4% Paraformaldehyd in PBS (pH 7,0-7,2) für 15 min und Waschen der Kammer-Objektträgern für 3 weitere Male in PBS (pH 7,0-7,2). </li><li> Permeabilisierung der Zellen unter Verwendung von 100 ul 0,5% Triton X-100 in PBS (pH 7,0-7,2) für weitere 15 min. Blockieren mit 100 ul 2% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS für eine Stunde. Nach diesem Schritt entweder Fleck / Label Zellen entweder für ZO-1 oder F-Actin. <ol><li> Für die Immunfluoreszenz staining Inkubieren der Zellen mit einem Anti-Kaninchen primären Antikörper gegen ZO-1 in 1: 150 in 2% BSA-PBS für O bei 4 ° C hergestellt / N. In PBS Waschen Sie die Zellen 3-mal, (pH 7,0 bis 7,2). Inkubieren mit 100 &amp; mgr; l Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) -markierten anti-Kaninchen Sekundär-Antikörper für 1 h bei RT. </li><li> Rhodamin Phalloidin Kennzeichnung, nach Blockierung, setzen die Zellen zu 100 ul von Rhodamin-Phalloidin 1:50 Verdünnung in 2% BSA-PBS für 20 min. </li><li> Waschen Sie die Zellen von Immunfluoreszenzfärbung und Rhodamin-Phalloidin Kennzeichnung in PBS (pH 7,0 bis 7,2). Montieren Sie die Kammern mit Montage Medien, die anti-fade-Reagens mit DAPI. </li></ol></li><li> Visualisierung der Zellen unter Verwendung eines 60 X Wasser-Immersionslinse und die Zellen werden in einer einzigen optischen Ebene unter einem konfokalen Mikroskop gescannt. </li></ol>

<ol><li>Eltzschig, H. K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia+and+reperfusion--from+mechanism+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation.</a> Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).</li>
<li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).</li>
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<li>Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+generation+of+reactive+oxygen+species+in+endothelial+cellsexposed+to+anoxia-reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation.</a> Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).</li>
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<li>Gundimeda, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+tea+polyphenols+precondition+against+cell+death+induced+by+oxygen-glucose+deprivation+via+stimulation+of+laminin+receptor%2C+generation+of+reactive+oxygen+species%2C+and+activation+of+protein+kinase+Cepsilon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon.</a> J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).</li>
<li>Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+targets+in+cerebral+ischemia+for+developing+novel+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics.</a> Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).</li>
<li>Alluri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Oxygen+Species-Caspase-3+Relationship+in+Mediating+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cell+Hyperpermeability+Following+Oxygen-Glucose+Deprivation+and+Reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation.</a> Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).</li>
<li>Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+and+ROCK+signaling+in+VEGF-induced+microvascular+endothelial+hyperpermeability%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability.</a> Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).</li>
<li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP+actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin.</a> J Vis Exp. (57), (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

OGD-R als ein in vitro Modell für Ischämie-Reperfusion wurde auch für die Untersuchung Neuronen 10,11 hergestellt. Es gibt auch Studien, die die Wirkung auf OGD Hirnendothelzellen und Veränderungen der Permeabilität und TJ Integrität 9. Unsere Studie zeigt jedoch, die Wirkung von OGD und Reoxygenierung, die eine nähere Darstellung des ischämischen Reperfusionsschaden in In-vivo-Bedingungen, die folgende ischämischen Schlaganfalls auftreten. Hypoxisch-i...

Ischämie-Reperfusions (IR) Verletzung festgestellt wird, das häufige Ursache verschiedener schwächende Komplikationen und Todesfälle im Zusammenhang mit Schlaganfall, Myokardinfarkt, Trauma, periphere Gefäßkrankheit und traumatischer Hirnverletzung 1,2 zugeordnet werden. IR Verletzungen in Hirngefäße ist eine frühe sekundäre Verletzungen, die zu Entzündungen und Ödeme 3. Einer der schwerwiegenden Komplikationen, die als Folge der oxidativen und metabolischen Stress folgenden Entzündung auftritt ist der Verlust der homöostatischen Gleichgewicht, was zu Bildung von freien Radikalen, Veränderungen in der Blut-Hirn-Schranke (BHS) Tight Junctions (TJs) und mikrovaskuläre Permeabilität 4,5. Derzeit werden in-vivo-Modellen verwendet werden, um die Auswirkungen von IR Verletzung am BBB Studie sind mittleren Hirnarterie (MCAO), Mikroembolien und transgenen oder Knockout-Tieren. Jedoch hat jede ihre Nachteile und Einschränkungen durch Hossmann 6 diskutiert. MCAO-Modell verwendet die effec zu studierents von Redox-Stress, Veränderungen in der Junction-Kommunikation des BBB und die Interaktionen zwischen Gehirn und Immunzellen. Jedoch weisen sie verschiedene technische Herausforderungen, wie die Notwendigkeit für eine präzise Mikrochirurgie und die Schwierigkeiten darin. Mikroembolie sofort bricht die BBB, während die Verwendung von transgenen oder Knockout-Tieren zu zerebraler Ischämie studieren können Herausforderungen wie Gen-abhängige Molekular Einflüsse auf Infarktbildung, Veränderungen in der Gefäßanatomie und unterschiedlichen Körpergewichte 6 haben. Daher wird in vitro-Modellen von Ischämie haben gefunden zunehmendes Interesse in der letzten Zeit vor allem aufgrund ihrer Eignung bei der Durchführung mechanistische Studien für Medikamente. Allerdings können die Ergebnisse der in-vitro-Studien nicht vollständig repräsentieren eine in-vivo-Studie und müssen mit Vorsicht interpretiert werden 6. Gegenläufig wirkte der geringe Sauerstoffkonzentrationen auf die endotheliale Zellmonoschichten und mikrovaskuläre Permeabilität wurdenstudierte von Ogawa 7. Rattenhirn-mikrovaskulären Endothelzellen (RBMECs) wurden verwendet, um die in vitro BBB entwickeln. Die Sauerstoff-Glukose Deprivation und Reoxygenierung (OGD-R-Technik) in diesem Protokoll vorgestellt wurde von Studien, die von Zulueta et al und Zhu et al 8,9 angepasst. Wir exponierten Hirnendothelzellen auf OGD-R, indem sie in einer Hypoxie / Anoxie Raum mit 0% O 2, 5% CO 2 und 95% N 2. Die Zellen wurden später für die Veränderungen in TJ Integrität und Stressfaserbildung mittels Immunfluoreszenz-Lokalisierung und Rhodamin-Phalloidin Kennzeichnung bzw. beurteilt. Immunfluoreszenzfärbung für das Zonula-occludens-1 (ZO-1) durchgeführt, um festzustellen, TJ Integrität als ZO-1 eine wichtige Gerüst Membran gebunden TJ Protein. Rhodamin-Phalloidin Kennzeichnung bestimmt die filamentöse Aktin (F-Actin) in der Zelle Zytoskeletts und ist ein deutliches Zeichen von Aktin-Stressfaserbildung in Endothelzellen. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Das Ziel dieses Verfahrens ist, um einen Einblick in die Entwicklung OGD-R als in vitro-Modell zum Studium IR BBB Endothelzellen TJ Integrität und F-Actin Spannungsfaserbildung bereitzustellen. Die Ergebnisse werden Informationen über das Schicksal der TJ-Protein liefern, ZO-1 und Stressfaserbildung nach OGD-R. Das Verständnis dieser Zusammenhänge wird die Möglichkeit, die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen, die ausgelöst folgenden OGD-R sind zu ermitteln und entwickeln mögliche therapeutische Strategien, um die Störung BBB folgenden OGD-R Behandlung zu verbessern.

<table><tbody><tr><td>Proox Modell 110</td><td>Biospherix</td><td>Modell 110</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, ohne Glukose</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamin Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 Kaninchen Polyklonaler Antikörper</td><td>Life Technologies</td><td>617300</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab Tek II-CC 8&nbsp; gut steril, Glas&nbsp; Folien&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>177402</td><td></td></tr><tr><td>FITC-getaggter Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper&nbsp;</td><td>Santa cruz</td><td>sc-2090</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Thermo scientific</td><td>SH 30028.03</td><td>Jedes andere verfügbare PBS kann verwendet werden</td></tr></tbody></table>

sauerstoff-glukose deprivation und reoxygenierung als<em&gt; in-vitro-</em&gt; ischämie-reperfusion injury modell zum studium der blut-hirnschranke dysfunction

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischämie-Reperfusion (IR) Verletzung bekannt ist, wesentlich zur Morbidität und Mortalität bei ischämischen Schlaganfällen assoziiert beitragen. Ischämische Schlaganfälle machen 80% aller Schlaganfälle. Eine häufige Ursache für IR Verletzungen ist der schnelle Zustrom von Flüssigkeiten nach einer akuten / chronischen Verschluss von Blut, Nährstoffe, Sauerstoff zum Auslösen der Bildung von freien Radikalen Gewebe. Ischämischen Schlaganfall wird durch Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​Dysfunktion und vasogenic Hirnödem gefolgt. Strukturell Tight Junctions (TJs) zwischen den Endothelzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Integrität der Blut-Hirn-Schranke (BHS). IR Verletzungen ist eine frühe Sekundärverletzung führt zu einer unspezifischen Entzündungsreaktion. Oxidativen und metabolischen Stress folgenden Entzündung auslöst sekundären Hirnschäden einschließlich BBB Lässigkeit und Unterbrechung der Tight Junction (TJ) Integrität. Unser Protokoll stellt ein in vitro &lt;/ Em&gt; Beispiel von Sauerstoff-Glukose Deprivation und Reoxygenierung (OGD-R) auf Rattenhirn Endothelzellen TJ Integrität und Stressfaserbildung. Derzeit mehreren experimentellen in vivo-Modelle werden benutzt, um die Effekte von IR Schädigung zu untersuchen; sie haben jedoch mehrere Einschränkungen auf, wie die technischen Herausforderungen bei der Durchführung von Operationen, Gens abhängige Molekular Einflüsse und Schwierigkeiten bei der Untersuchung mechanistische Beziehungen. Jedoch kann in vitro Modellen in der Überwindung vieler dieser Einschränkungen zu unterstützen. Das vorgestellte Protokoll verwendet, um die verschiedenen molekularen Mechanismen und mechanistische Beziehungen zu studieren, um potentielle therapeutische Strategien bereitzustellen. Allerdings können die Ergebnisse der in-vitro-Studien von Standard-in-vivo-Studien unterscheiden und sollten mit Vorsicht interpretiert werden.

Zellen auf Fibronektin vorbeschichteten Nunc II Kammer-Objektträgern kultiviert wurden OGD-R, indem Sie in einem Biospherix ProOx Modell 110 Kammer unterzogen. Nach Aussetzen Zellen OGD-R, die sie für ZO-1 junctional Färbung mit Immunfluoreszenztechnik verarbeitet wurden, wie in Abbildung 2 und Zytoskelett Anordnung gezeigt anzeigt F-Aktin Bildung von Stressfasern mit Rhodamin-Phalloidin-Färbung Etikett, wie in Fig. 3 gezeigt, die Kontrollzellen waren nicht OGD-R unterzogen zeigte konti...

Ischämie-Reperfusion (IR)-Schädigung ist mit einer hohen Morbiditäts- und Mortalitätsrate verbunden. Das Ziel des hier beschriebenen in vitro-Modells des Sauerstoff-Glukose-Departions und der Reoxygenierung (OGD-R) ist es, die Auswirkungen einer Ischämie-Reperfusionsverletzung auf eine Vielzahl von Zellen zu bewerten, insbesondere in Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke (BHS).

Sauerstoff-Glukose Deprivation und Reoxygenierung als<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ischämie-Reperfusion Injury Modell zum Studium der Blut-Hirnschranke Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Rolle der Sauerstoff-Glukose-Deprivation als in-vitro-Modell für Ischämie-Reperfusionsschäden zur Untersuchung der Dysfunktion der Blut-Hirn-Schranke zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem Gehirnendothelzellen, die in Kammerobjektträgern kultiviert wurden, einer Sauerstoff-Glukose-Deprivation ausgesetzt werden, indem das Kulturmedium durch deoxygeniertes, glucosefreies Medium ersetzt wird, und die Zellen anschließend zwei Stunden lang einer hypoxischen Kammerumgebung ausgesetzt werden. Danach werden die Zellen für eine Stunde unter normale Bedingungen zurückversetzt, um eine Reoxygenierung zu erzielen. Nach der Aufarbeitung der Zellen erfolgt eine immunfluoreszenzchemische Färbung von Zona occludens-1 sowie eine Markierung filamentösen Aktins mittels Rhodamin-Phalloidin.Die Zellen werden anschließend mit einem 60x-Wasserimmersionsobjektiv an einem konfokalen Mikroskop abgebildet, um einzelne optische Schnitte zur Analyse zu erhalten. Das Verfahren wird von Hem Nega, einer Doktorandin in meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie primäre Kulturen von RBM-EECs, die aus adulten Sprague-Dawley-Ratten gewonnen wurden, bereithalten. Auch kommerziell verfügbare Zelllinien sind akzeptabel.Kultivieren Sie die R BM EECS in 100 cm²-Platten, die mit Fibronectin beschichtet sind, und pflegen Sie sie in Wachstumsmedium für endotheliale Zellen des Rattenhirns, wobei das Medium jeden zweiten Tag gewechselt wird. Züchten Sie die Zellen, bis sie 80 bis 90 % konfluent sind. Waschen Sie die Zellen anschließend vorsichtig mit fünf Millilitern PBS. Als Nächstes lösen Sie die Zellen von der Platte, indem Sie zunächst ein Milliliter warmer 0,25%iger Trypsin-EDTA-Lösung hinzufügen und die Platte schwenken. Inkubieren Sie die Zellen anschließend zwei bis fünf Minuten lang. Klopfen Sie leicht gegen die Seite der Schale, um die Ablösung der Zellen zu fördern, und überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellen sich abgelöst haben.Um die Trypsinisierung zu beenden, fügen Sie fünf Milliliter komplettes Medium hinzu, pipettieren Sie anschließend das Medium mit den abgelösten Zellen ab und sammeln Sie es in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie das Medium mit den Zellen bei 220 × g für fünf Minuten, aspirationsieren und entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie dann das Zellpellet in drei bis fünf Milliliter frischem Medium, indem Sie die Zellen vorsichtig durch eine 5-Milliliter-Pipette fließen lassen.Zählen Sie nun die Zellen und übertragen Sie 20.000 bis 30.000 in jede Vertiefung einer fibrin- und aktinbeschichteten Acht-Vertiefungs-Kammerplatte. Selbstverständlich können sie auch für andere Anwendungen anders kultiviert werden. Inkubieren Sie anschließend die Kammerplatte, bis die Zellen konfluent sind, zur Vorbereitung.Richten Sie das Hypoxie-Zellkultursystem ein und kalibrieren Sie es. Gemäß den Herstelleranweisungen sollte die Kammeratmosphäre 95 % Stickstoff und 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius betragen. Dekoxygenieren Sie nun das glucosefreie DMEM, indem Sie es vier bis sechs Stunden lang in die Hypoxiekammer stellen.Beginnen Sie mit der Belastung der Zellen, indem Sie deren Medium durch das deoxygenierte, glucosefreie DMEM ersetzen und die Zellen anschließend für zwei Stunden in die Hypoxiekammer geben. Nach zwei Stunden bringen Sie die Zellen zurück in das vollständige Medium für Rattenhirnendothelzellen. Anschließend reoxygenieren Sie die Zellen, indem Sie sie für eine Stunde unter normale Bedingungen zurückbringen.Beginnen Sie damit, jede Vertiefung von R-B-M-E-C-Monolagen 100 bis 200 Mikroliter optimiertes Medium mit reduziertem Serum auszusetzen und fahren Sie mit der Inkubation eine Stunde fort. Anschließend waschen Sie die Kammerobjektträger dreimal mit jeweils 100 bis 200 Mikroliter PBS pro Vertiefung und Waschgang. Fixieren Sie die Zellen mit 4 % Parafol in PBS und inkubieren Sie die Objektträger 15 Minuten bei Raumtemperatur, danach waschen Sie die Zellen dreimal wie zuvor mit PBS ab.Permeabilisieren Sie nun die Zellen, indem Sie 100 bis 200 Mikroliter einer 0,5 %igen Triton X-100-Lösung in PBS in jede Vertiefung geben und die Platte weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren lassen. Nach der Permeabilisierung die Blockierungslösung hinzufügen und eine Stunde bei Raumtemperatur einwirken lassen. Anschließend entweder eine Immunfluoreszenz für das ZO-1-Protein durchführen oder F-Aktin markieren.Um die Immunfluoreszenz der Zellen für ZO-1 durchzuführen, inkubieren Sie diese über Nacht bei vier Grad Celsius mit dem primären Antikörper. Am nächsten Tag waschen Sie die Zellen dreimal in PBS, beispielsweise beim Entfernen des Fixativs. Anschließend inkubieren Sie die Zellen eine Stunde bei Raumtemperatur in 100 bis 200 Mikrolitern fluoreszenzmarkiertem sekundärem Antikörper gegen Kaninchen, um die Zellen mit rDomäne Phin zu markieren.Nachdem die Blockierungslösung eine Stunde lang aufgetragen wurde, setzen Sie die Zellen 20 Minuten lang 100 bis 200 Mikroliter R domine Phin in einer Verdünnung von 1:50 mit 2 % B-S-A-P-B-S aus. Nach der Inkubation mit dem sekundären Antikörper oder R domine Phin waschen Sie die Zellen erneut dreimal mit PB S, wie zuvor beschrieben. Entfernen Sie anschließend die Kammer, indem Sie das elastische Material ablösen.Führen Sie das Aufbringen der Objektträger mit Medium, das Anti-Fade und DPI-Bild enthält, fort. Die Zellen werden mittels konfokaler Mikroskopie in einer einzelnen Ebene mit einem 60x-Objektiv untersucht. Die Zellen wurden in einer Kammer kultiviert, die mit Fibronectin beschichtet war.Die Objektträger wurden einer OGDR unterzogen, indem sie in eine Hypoxiekammer gegeben wurden. Anschließend wurden die Zellen für die ZO-1-junktionelle Analyse aufbereitet.Die Färbung der Kontrollzellen zeigte eine kontinuierliche Integrität der Zellkontaktzonen, während Zellen unter Sauerstoff- und Glukoseentzug diskontinuierliche Kontakte aufwiesen. Zusätzlich wurden zytoskelettale Veränderungen mittels Aero domine foid in label zur Darstellung von F-Aktin-Stressfasern beobachtet. Die Kontrollzellen zeigten keine oder minimale F-Aktin-Stressfasern, während Zellen, die einer OGDR ausgesetzt waren, eine erhöhte Bildung von Stressfasern aufwiesen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sauerstoff- und Glukoseentzug sowie Reoxygenierung durchgeführt werden. Dies kann als Modell für ischämische Reperfusionsverletzungen verwendet werden, um die Blut-Hirn-Schranke, die Integrität der Tight Junctions und Stress untersuchen zu können. Faserbildung.

oxygen-glucose-deprivation-reoxygenation-as-an-vitro-ischemia

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Quelle: Alluri, H., et.al. Sauerstoff-Glukose-Entzug und Reoxygenierung als In vitro Ischämie-Reperfusions-Verletzungsmodell zur Untersuchung der Blut-Hirn-Schranken-Dysfunktion. J. Vis. Exp. (2015). Das Video zeigt die Auswirkungen von Sauerstoff-Glukose-Entzug und anschließender Reoxygenierung auf mikrovaskuläre Endothelzellen (RBMECs) des Rattengehirns, indem hypoxische und nährstoffarme Bedingungen simuliert werden. Diese Bedingungen führen zu einer ATP-Depletion, einem erhöhten...

Einfluss von Sauerstoff-Glukose-Entzug und Reoxygenierung auf Zell-Zell-Interaktionen

Bilaterale Carotisokklusion mit systemischer Hypotonie gekoppelt produziert globales Gehirn Ischämie bei der Ratte, was zu einer Beschädigung des Hippocampus mit reproduzierbaren Schwere. Tier Probanden mit vorhersagbaren Mustern der Hirnschädigung beeinträchtigt sind, erholen sie zweckmäßig und Mortalitätsraten sind vergleichsweise gering.

2-Gefäßverschluss / Hypotonie: Eine Ratte Modell der globalen Hirnischämie

In-vitro-Schädel-Hirn-Verletzungen Modelle werden entwickelt, um in vivo Gehirn Verformung reproduzieren. Stretch-induzierte Schädigung für Astrozyten, Neuronen, Gliazellen, Aorten-und Endothelzellen des Gehirns eingesetzt. Allerdings nutzt unser System eine Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​Modell, das Eigenschaften ein zulässiger BBB-Modell ein in vitro-Modell herzustellen TBI besitzt.

Stretchlimousine in Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen (CEND) als<em&gt; In Vitro</em&gt; Traumatische Hirnverletzung Modell der Blut-Hirn-Schranke

Ein Protokoll für entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen, die Wiedergabe von vielen Aspekten der ischämischen Hirnschädigung ermöglicht, wird vorgestellt. Durch das Studium der Veränderungen der Leitungsbahnen in Zusätzlich zu den Veränderungen in den Nervenzellen ist dieses Protokoll ein vielseitiges Werkzeug, um plastische Veränderungen im Nervengewebe nach Verletzungen zu studieren.

Die Analyse der neurovaskuläre Remodeling in Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen

Dieses Protokoll beschreibt die wiederholte hypoxische Präkonditionierung oder kurze Exposition gegenüber systemischer Hypoxie, die das Infarktvolumen und die Störung der Blut-Hirn-Schranke nach einem vorübergehenden Verschluss der mittleren Hirnarterie bei Mäusen reduziert. Es wird auch die duale Quantifizierung des Infarktvolumens und der Störung der Blut-Hirn-Schranke nach einem Schlaganfall beschrieben, um die Wirksamkeit des neurovaskulären Schutzes zu bewerten.

Die Quantifizierung der neurovaskulären Schutz Nach Repetitive hypoxische Präkonditionierung und Transient mittleren Hirnarterie Occlusion in Mice

Ischämischen Schlaganfall ist schwer zu lernen ist ein komplexer Vorgang, in dem der spezifische Beitrag der Astrozyten, die betroffene Hirnregion Glukose Sauerstoffmangel (OGD) ausgesetzt. Dieser Artikel stellt eine Methode zur isolierte Astrozyten zu erhalten und ihre Reaktivität und Verbreitung unter OGD Bedingungen zu studieren.

Überwachung der Astrozyten Reaktivität und Proliferation in Vitro unter ischämischen-ähnlichen Bedingungen

Ziel des Protokolls ist eine optimierte Verfahren für die Einrichtung eines in-vitro- Blut - Hirn-Schranke (BBB) Modells basierend auf primäre porcinen Gehirn endothelial Zellen (pBECs) zu präsentieren. Das Modell zeigt hohe Reproduzierbarkeit, hohe Dichtigkeit und eignet sich für Studien der Transport- und intrazellulären Menschenhandel in der Wirkstoffforschung.

Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine hoch reproduzierbare Technik für in Vivo Beurteilung der Blut - Hirn-Schranke Störung in Ratte-Modelle des ischämischen Schlaganfalls liefern.

Eine In-Vivo -Bewertung der Störung der Blut - Hirn-Schranke in einem Rattenmodell des ischämischen Schlaganfalls

Hier präsentieren wir einen einfachen Ansatz mit spezifischen Kulturmedien, die die Etablierung von neuron- und astrozytenangereicherten Kulturen oder neuronglia-Kulturen aus dem embryonalen Kortex mit hoher Ausbeute und Reproduzierbarkeit ermöglichen.

Ein Zellkulturmodell zum Studium der Rolle von Neuron-Glia-Interaktionen in Ischämie

Hier beschreiben wir die Methode zur Etablierung eines Dreifachzellkulturmodells der Blut-Hirn-Schranke basierend auf primären mikrovaskulären Endothelzellen des menschlichen Gehirns, Astrozyten und Perizyten. Dieses multizelluläre Modell eignet sich für Studien zur neurovaskulären Einheitendysfunktion während eines ischämischen Schlaganfalls in vitro oder für das Screening von Arzneimittelkandidaten.

Ein dreifaches primäres Zellkulturmodell der menschlichen Blut-Hirn-Schranke zur Untersuchung des ischämischen Schlaganfalls in vitro

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung einer stabilen und gesunden Gehirnumgebung. Die BHS-Dysfunktion ist mit vielen neurologischen Erkrankungen verbunden. Wir haben ein 3D-Stammzellmodell der BHS entwickelt, um die zerebrovaskuläre Pathologie, die Integrität der BHS und die Veränderung der BHS durch Genetik und Krankheit zu untersuchen.

Rekonstruktion der Blut-Hirn-Schranke in vitro zur Modellierung und therapeutischen Behandlung neurologischer Erkrankungen

Erfahren Sie, wie Sauerstoff-Glukose-Deprivation und Reoxygenierung als In-vitro-Modell für Ischämie-Reperfusionsverletzungen eingesetzt werden, um die Dysfunktion der Blut-Hirn-Schranke zu untersuchen.

Sauerstoff-Glukose Deprivation und Reoxygenierung als In-vitro- Ischämie-Reperfusion Injury Modell zum Studium der Blut-Hirnschranke Dysfunction (Video) | JoVE Journal

Sauerstoff-Glukose Deprivation und Reoxygenierung als

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