Isolierung von mononukleären Zellen aus dem zentralen Nervensystem von Ratten mit EAE

Okay. Hallo, ich bin Christine Beaton. Ich bin wissenschaftliche Mitarbeiterin im Labor von George Chen am Department für Physiologie und Biophysik der University of California Irvine. Heute zeige ich Ihnen, wie man mononukleäre Zellen aus dem zentralen Nervensystem von Ratten isoliert.

Bei diesem Verfahren wird die Ratte tief anästhesiert, um eine Herzperfusion durchzuführen, sodass keine kontaminierenden Blutbestandteile im zentralen Nervensystem verbleiben. Danach entnehmen wir das Gehirn, sowie das Rückenmark, stellen eine Einzelzell-Suspension mithilfe eines Zellfilters her und isolieren anschließend mittels eines zweilagigen Percoll-Gradienten die mononukleären Zellen. Beginnen wir also.

Ich bin nun bereit, die Herzperfusion durchzuführen, daher werde ich nun alles Material zeigen, das ich dafür benötige. Das Erste, was wir brauchen, ist ein Bell-Glas, und hier unten haben wir Papiertücher platziert, die mit einem flüchtigen Anästhetikum getränkt sind. Sie können Halan oder Isofluran verwenden.

Als Nächstes benötigen wir etwas, um die Ratte zu halten, und etwas, um das Blut zu sammeln. Dazu verfügen wir über diese provisorische Vorrichtung zur Perfundierung der Ratten. Sie verwenden eine 21-Gauge-Kanüle und führen eine Kochsalzlösung über ein intravenöses Perfusionsystem mit Schwerkraftzufuhr zu.

Wenn Sie nicht auf eines dieser Systeme zugreifen können, können Sie auch mehrere Spritzen mit Kochsalzlösung füllen und manuell perfundieren. Aber das hier ist viel einfacher. Und außerdem benötigen wir einen 10-ml-Spritzenzylinder, in den wir Kim-Tücher eingefüllt haben.

Und ich werde das Anästhetikum, etwas von dem Anästhetikum, hineingeben, um es auf die Nase der Ratte aufzutragen, um sicherzustellen, dass sie während des Eingriffs tief anästhesiert bleibt. Und natürlich benötigt man Instrumente. Heute werde ich jedoch keinen sterilen Eingriff durchführen, da ich die Zellen nicht in Kultur bringen werde.

Die von mir verwendeten Instrumente sind also keimfrei. Wenn Sie jedoch Ihre Zellen in Kultur bringen möchten, sollten Sie natürlich sterile Instrumente verwenden. Für die Zwecke dieses Videos werde ich eine Ratte verwenden, die tatsächlich tot ist.

Ich kann das Verfahren daher langsam durchführen, um es Ihnen Schritt für Schritt zu zeigen. Bei einem echten Eingriff benötigen Sie jedoch eine stark anästhesierte Ratte, die nicht tot ist. Das Herz sollte weiterhin schlagen.

Beginnen wir also mit dieser Ratte. Ich habe die Ratte so platziert, dass sie mit dem Rücken zu mir liegt, und die angefeuchteten Tücher über ihre Nase gelegt. Als Erstes werde ich überprüfen, ob die Ratte ausreichend anästhesiert ist.

Sie müssen dies vor jedem dieser Eingriffe tun. Ich nehme also meine Pinzette und zwicke die Ratte, und es erfolgt keinerlei Reaktion. Falls eine Reaktion auftritt, müssen Sie die Ratte zurück in die Belger-Vorrichtung legen, um sicherzustellen, dass sie tief anästhesiert ist.

Dann werde ich 70 % Ethanol verwenden, um die obere Hälfte der Ratte einzutunken. Danach werde ich die Brusthöhle öffnen. Zuerst schneide ich die Haut ab und öffne sie an der Seite.

Dann öffne ich die eigentliche Körperhöhle. Diese Masse hier ist das Herz. Hier sehen Sie das rechte Vorhof.

Das werde ich durchtrennen, um das Austreten des Blutes zu ermöglichen. Und um den gesamten Körper zu perfundieren, muss ich meine Nadel in den linken Ventrikel einführen. Ich werde die Nadel also genau hier einführen.

Und sobald die Nadel eingeführt ist, öffne ich den Infusionschlauch, um die Kochsalzlösung durchfließen zu lassen, und lasse sie fünf bis zehn Minuten lang laufen. Wenn die Perfusion gut ist, werden Sie eine Verfärbung des roten Pulses sowie der roten Nase und der Augen der Ratte sehen, was natürlich zeigt, dass das Blut den Körper der Ratte verlässt. Das bedeutet, dass die Perfusion gut sein sollte.

Hier ist die Maus nach der Herzperfusion. Wie Sie sehen können, sind die Nase, die Ohren und die Augen dieser Maus nicht mehr rosa oder rot. Sie sind vollständig weiß, was zeigt, dass die Perfusion gut funktioniert hat.

Das gesamte oder größte Teil des Blutes hat die Rattentupfer verlassen. Da die Ratte nun kardial perfundiert wurde, muss ich ihr den Kopf abtrennen. Ich muss die Ratte enthaupten.

Dafür werde ich normale Laborausrüstung verwenden. Nun werde ich das Gehirn aus der Ratte entfernen. Dazu werde ich das gesamte Fell mit 70 % Ethanol durchnässen, um zu verhindern, dass Fell herumfliegt.

Dann werde ich zuerst die Haut entfernen. Da ich das Gehirn nicht für die Histologie verwenden möchte und es in kleine Stücke schneiden werde, achte ich nicht besonders darauf, es sauber und in einem Stück herauszunehmen. Ich werde hier meine Schere am Schädelbasisansatz einsetzen, dort, wo das Gehirn mit dem Rückenmark verbunden ist.

Und ich werde den Knochen auf jeder Seite durchtrennen und dann die Oberseite entfernen. Und das werde ich immer wiederholen. So ist das Gehirn vollständig freigelegt.

Und wie Sie sehen können, hat die Perfusion gut funktioniert, da das Gehirn vollständig klar ist. Bei einem nicht perfundierten Tier wäre die oberste Schicht des Gehirns vollständig mit roten Kapillaren, roten Blutgefäßen, bedeckt, sodass man sie überhaupt nicht sehen würde. Das bedeutet, dass die Perfusion erfolgreich war. Nun werde ich das Gehirn herausschöpfen und darauf achten, dass ich den Riechkolben nicht zurücklasse, und es in ein Gefäß mit etwas Eis namens PBS geben.

Jetzt werde ich das Gehirn, ohne besonders vorsichtig darauf zu achten, es intakt zu halten, in das Röhrchen mit PBS geben und die Sehnerven durchtrennen. Anschließend lässt es sich mithilfe eines Spatels ziemlich leicht herausnehmen. Nun werde ich das Rückenmark derselben Ratte entfernen. Auch hier, da wir es in kleine Stücke schneiden werden, achte ich nicht allzu sehr darauf, es besonders sauber zu entnehmen, solange ich es vollständig herausbekomme.

Ich schneide zunächst die Haut entlang der Wirbelsäule auf, sodass die Wirbelsäule hier sichtbar wird. Dann werde ich das Fleisch hier entfernen, damit die Wirbelsäule über ihre gesamte Länge freigelegt ist. Und genau hier können Sie das Rückenmark sehen.

Bei einer Maus können Sie beide Enden abschneiden und PBS mit der Spritze einfüllen, sodass das Rückenmark fast vollständig herauskommt. Bei Ratten ist dies jedoch nicht so einfach. Ich muss es öffnen und das Rückenmark herausnehmen.

Jetzt schneide ich auf beiden Seiten und entferne, wie bereits beim Gehirn, das Gehirn und den Knochen, um das Rückenmark freizulegen. Wie beim Gehirn ist auch das Rückenmark vollständig weiß, was zeigt, dass die Herzperfusion gut funktioniert hat. Dies führe ich entlang der gesamten Wirbelsäule durch.

Und ich gehe bis etwa auf die Höhe der rechten Hüfte, also genau hier. Dann nehme ich die Pinzette und ziehe einfach das Rückenmark heraus – das sieht nicht besonders schön aus – und lege es in mein Röhrchen mit dem Gehirn. Nun befinden sich im Röhrchen sowohl das Gehirn als auch das Rückenmark der Ratte, und jetzt bin ich bereit, meine Einzelzell-Suspension herzustellen.

Jetzt bin ich bereit, eine Einzelzell-Suspension aus meinem zentralen Nervensystem herzustellen. Dazu benötige ich eine 10 cm große Petrischale, in die ich einen 70-Mikron-Zellsieb lege. Außerdem verwende ich den Kolben eines 1-mL-Spritzen, sowie eine Pinzette und eine Schere.

Ich werde nun meine Probe in den Zellfilter geben und sicherstellen, dass nichts im Reagenzglas zurückbleibt. Anschließend werde ich sie in kleine Stücke schneiden, sowohl das Gehirn als auch das vermischt vorliegende Rückenmark. Wenn schließlich alles fein zerkleinert ist, werde ich den Kolben der Einmalspritze verwenden und die Probe damit durch den Filter pressen.

Sie werden sehen, dass das PBS außerhalb des Zelltrichters zunehmend trüber wird, während einzelne Zellen hindurchtreten. Wenn ich meine Zellsuspension steril halten wollte, würde ich dies natürlich in einer Zellkulturbank durchführen und meine Finger nicht hineinlegen. Da das PBS nun trüb ist, werde ich es zum ersten Mal sammeln und in ein 50-ml-Gefäß geben.

Doch ich werde auch weiterhin aufmerksam beobachten, und ich werde etwas mehr PBS zu meinem Zelltrichter hinzufügen und erneut durchquetschen. Da das ZNS so viel Fett enthält, ist es eines der Organe, die ich mit dieser Technik am schwierigsten in eine Zellsuspension überführen kann. Daher habe ich mein gesamtes ZNS mehrfach durch den Zelltrichter gedrückt und die gesamte Einzelzell-Suspension gesammelt.

Und hier ist die Röhre, die ich bis zu 50 ml mit PBS aufgefüllt habe, das meine Einzelzell-Suspension enthält, die aus dem ZNS der rechten Seite vorbereitet wurde. Nun werde ich diese Röhre abzentrifugieren, um sie für die Dichtegradientenzubereitung vorzubereiten, damit die Zellen fertig sind mit dem Zentrifugieren. Wir haben nun ein Pellet, daher werde ich den Überstand verwerfen und meine Zellen in 20 Milliliter Perkol mit 30 % Perkol in PBS resuspendieren.

Und ich werde dies auf 10 ml 70 % Perkol in PBS überlagern, um die Migration zu ermöglichen. Ich entsorge das Überstandmedium, löse das Pellet auf, um sicherzustellen, dass die Zellen einzeln suspendiert und nicht zu einem Klumpen im Pellet agglomariert sind.

Jetzt habe ich meine Suspension von ZNS-Zellen in Einzelzell-Suspension. Ich werde diese Zellen in 20 ml 30 %iger Percoll in PBS suspendieren und dann diese 20 ml auf 10 ml 70 %iger Percoll in PBS aufschichten. Anschließend werde ich die Probe abzentrifugieren.

Jetzt nehme ich meine 20 ml CNS-Suspension und werde sie langsam vorsichtig auf die 70%ige Perkol-Schicht auftragen, um es einfacher zu machen. Man kann auch einen Farbstoff wie Phenolrot in eine der Schichten geben, aber ich bin mir nicht sicher, welche Wirkung dies auf die Zellen hat, falls überhaupt eine vorhanden ist. Daher versuche ich, ihn zu vermeiden.

Sie sollten langsam genug vorgehen, damit sich die beiden Schichten nicht vermischen, und daher keine starke Turbulenz in der unteren Schicht verursachen. Und je dicker die obere Schicht wird, desto schneller können Sie vorgehen. Nun habe ich meine Zellen dem Gradienten hinzugefügt.

Die klare Schicht hier unten ist die 70 % Perkol-Schicht, und die trübe Schicht oben ist eine 30 % Perkol-Schicht, die meine Einzelzell-Suspension enthält. Nun werde ich dieses Röhrchen für 20 Minuten in die Zentrifuge geben und anschließend die Schicht der Monozyten-Zellen sichtbar machen können, falls ich sorgfältig gearbeitet habe. Jetzt haben wir die Gradientenzentrifugation abgeschlossen.

Wie immer, nachdem Sie einen Gradienten zentrifugiert haben, achten Sie darauf, die Bremse auszuschalten, damit diese den Gradienten nicht stört, indem sie zu schnell abbremst. Nun haben wir unsere Schichten. Auf dem Gradienten befindet sich eine Fettschicht, die ich entfernen werde, um die Kontamination meiner Zellsuspension zu vermeiden.

Und an der Grenzfläche zwischen den beiden Schichten mit 30 und 70 % Perkol sehen Sie, dass die Grenzfläche nicht scharf, sondern verschwommen ist, und genau dort befinden sich die Zellen. Sobald ich die Zellen entfernt habe, werden Sie sehen, dass die Grenzfläche deutlich schärfer wird. Ich werde nun den größten Teil des Fetts in der oberen Schicht entfernen und einfach in den Abfall geben.

Ich muss nicht alles entfernen, aber ich möchte genügend entfernen, damit es meine Pipette nicht vollständig benetzt, wenn ich nach unten gehe, um die Monocle-Zellen zu entnehmen. Nun werde ich mit einer anderen Transferpipette auf die Ebene der Phasengrenze gehen und meine Zellen gewinnen. So habe ich nun mehrere Milliliter an der Grenzfläche gesammelt.

Ich habe also wahrscheinlich alle Zellen erhalten, die möglich waren. Die Anzahl der Monocle-Zellen im ZNS war wirklich gering. Jetzt habe ich also meine mononukleären Zellen im Reagenzglas.

Ich werde das Gefäß mit PBS bis auf 50 ml auffüllen und die Zellen abzentrifugieren, um sie zu pelletieren, wodurch das Perle entfernt wird. Ich empfehle, die Zellen mindestens zwei- bis dreimal mit einem vollen Gefäß PBS zu waschen, um sicherzustellen, dass sämtliches Perle entfernt ist. Danach sind die Zellen bereit für jeden gewünschten weiteren Eingriff.

Heute habe ich Ihnen gezeigt, wie man mononukleäre Zellen aus dem zentralen Nervensystem von Ratten isoliert. Wenn Sie diese mononukleären Zellen einmal erhalten haben, können Sie sie natürlich weiter aufreinigen, um beispielsweise T-Lymphozyten aus der Population zu isolieren. Mit diesen Zellen werde ich einen Durchflusszytometrie-Test durchführen, um die Zellpopulationen nachzuweisen, die in meinem Gehirn vorhanden waren.

Viel Erfolg bei Ihrer Zellisolierung.