Morris Wasser-Labyrinth-Test: Optimierung für Mausstamm und Testumgebung

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, kognitive Defizite in einem Mausmodell der Alzheimer-Krankheit mithilfe eines Morris-Wasser-Labyrinth-Protokolls zu identifizieren, das für den Hintergrundstamm 1 2 9 6 FBB angepasst ist. Dies wird erreicht, indem die Mäuse zuerst an die Aufgabe gewöhnt werden, um stressbedingte Leistungsdefizite zu vermindern. Der zweite Schritt besteht darin, die visuelle Plattformaufgabe durchzuführen, bei der eine Plattform um einen Zoll über der Wasseroberfläche angehoben wird, um die visuelle und motorische Funktion zu bewerten.

Danach werden die versteckten Plattformversuche durchgeführt, bei denen die Plattform fünf Millimeter unter der Wasseroberfläche liegt. Der letzte Schritt besteht in der Durchführung von Probelauf-Versuchen, bei denen die Plattform entfernt wird, um das räumliche Bezugs­gedächtnis zu bewerten und die Art der verwendeten Suchstrategie zu bestimmen. Letztendlich ermöglicht dieses angepasste Verfahren der Wasser-MAs die Beurteilung des räumlichen Lernens und Gedächtnisses in einem gängigen Mausmodell der Alzheimer-Krankheit.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die Testverfahren – beispielsweise die Anzahl der Trainingsdurchgänge und verwendeten Testproben – je nach genetischem Hintergrund der Mauslinie und der Umgebung, in der die Mäuse getestet werden, optimiert werden müssen. In diesem Teil des Verfahrens gewöhnen sich die Mäuse an das Hinein- und Herausziehen. Zunächst wird die Box auf eine bequeme Höhe angehoben platziert und mit zwei Litern Wasser bei einer Temperatur von 21 Grad Celsius und einem Füllstand von etwa einem Zentimeter gefüllt.

Nachdem die Mäuse in den Versuchsraum gebracht wurden, entnehmen Sie ein Tier aus dem Käfig, überprüfen die Tieridentifikation und markieren anschließend den Schwanz mit einem ungiftigen Permanentstift, um es von Tieren zu unterscheiden, die das Verfahren noch nicht durchlaufen haben. Stellen Sie eine Maus etwa fünf Sekunden lang in den Transferbecher. Gießen Sie die Maus dann vorsichtig aus dem Becher in den Vortrainingbehälter und halten Sie die Maus 20 Sekunden lang im Behälter.

Nach Ablauf der Zeit vorsichtig eine Schaufel vor die Maus legen, ohne sie zu kippen. Die Maus in die Schaufel einsteigen und diese erkunden lassen. Falls erforderlich, kann die Maus dazu ermutigt werden, auf die Schaufel zu steigen, indem man diese vorsichtig unter die Maus schiebt und langsam anhebt. Dabei darauf achten, die Mäuse mit der Schaufel nicht zu erschrecken.

Wiederholen Sie diese Verfahren für jede Maus im Käfig einmal täglich über einen Zeitraum von 10 Tagen. Nach jedem Tier sammeln Sie mit einem Netz Fäkalienbolien und Einstreu aus dem Becken und verwenden dabei den Transferbecher beim Wechsel zwischen den Käfigen. Führen Sie am ersten, zweiten und dritten Testtag jeweils eine sichtbare Trainingseinheit mit sechs Durchläufen pro Tag durch, wobei zwischen jedem Durchlauf etwa 10 Minuten liegen sollten.

Stellen Sie zuerst die Software zur Leistungsüberwachung der Maus ein und erstellen Sie die Laufzettel gemäß den Anweisungen im Textteil des Protokolls. Sobald die Software konfiguriert ist, bereiten Sie den Raum vor, indem Sie zunächst Vorhänge aufhängen, um räumliche Hinweise zu verdecken. Bereiten Sie anschließend die Wanne vor, indem Sie sie mit Leitungswasser bei 21 Grad Celsius füllen.

Verwenden Sie ein Thermometer, um sicherzustellen, dass die Wassertemperatur während des gesamten Tests um nicht mehr als ein Grad von dieser Temperatur abweicht. Platzieren Sie die Plattform, die eine montierte Fahne trägt, welche eine Höhe von 13 Zentimetern erreicht und 4,5 mal 4,5 Zentimeter groß ist, mit einem fett gedruckten, geprägten S-förmigen Zeichen an der ersten vorgegebenen Stelle des Beckens, sodass sie etwa einen Zoll über die Wasseroberfläche hinausragt.

Nehmen Sie nun die erste Maus aus dem Käfig. Überprüfen Sie die Versuchstierkennung, markieren Sie den Schwanz mit einem dauerhaften Stift der richtigen Farbe und legen Sie die Maus in einen Transferbecher. Stellen Sie die Maus vorsichtig in die Wanne.

Starten Sie die Zeitschaltung und stellen Sie sicher, dass die Verfolgungssoftware das Tier verfolgt. Geben Sie der Maus bis zu zwei Minuten Zeit, um die Plattform zu finden. Sobald die Maus die Plattform gefunden hat, belassen Sie sie 20 Sekunden lang darauf.

Falls das Tier die Plattform innerhalb des zweiminütigen Zeitraums nicht findet, heben Sie die Maus vorsichtig auf und stellen Sie sie für 20 Sekunden auf die Plattform. Nach diesen 20 Sekunden wird die Maus wie im Akklimatisierungstraining von der Plattform genommen und für 30 Sekunden in einen beheizten Käfig mit Zeitungspapier-Auflage gestellt, der mithilfe einer Heizplatte und einer Wärmelampe auf etwa 31 Grad Celsius erwärmt wird. Anschließend wird die Maus in den Aufbewahrungskäfig mit nur einer Heizplatte, jedoch ohne Wärmelampe, überführt, um sich zwischen den Versuchen zu erholen.

Nachdem das Becken mit einem Netz von Ablagerungen befreit wurde, diese Schritte für jede Maus der Gruppe wiederholen. Wenn jede Maus die erste Versuchsdurchführung abgeschlossen hat, die Plattform an die zweite vorgegebene Position verschieben. Die Trainingseinheiten mit versteckter Plattform von Tag vier bis zehn nach dem Aufhängen der Vorhänge durchführen.

Wie zuvor platzieren Sie Hinweise strategisch an den Vorhängen. Stellen Sie sicher, dass die Hinweise groß sind und kontrastierende Farben enthalten, um die Sichtbarkeit zu verbessern, und dass sie in einer Entfernung und Höhe angebracht sind, sodass sie für die Mäuse von innen im Behälter sichtbar sind. Konfigurieren Sie die Software gemäß den Anweisungen im schriftlichen Teil des Protokolls.

Danach bereiten Sie das Becken vor, indem Sie es zunächst mit Wasser füllen, sodass sich die Plattform etwa fünf Millimeter unterhalb der Wasseroberfläche befindet. Stellen Sie die Plattform an der vorbestimmten Position ab. Die Position der Plattform bleibt für fast alle getesteten Tiere über alle Tage und Versuche hinweg gleich.

Es ist entscheidend, den Startpunkt zu variieren, damit die Tiere keine nicht-räumliche, nicht-hippocampale motorische Strategie entwickeln. Um das Labyrinth zu lösen, verwenden Sie ungiftige, weiße Temperafarbe, um das Wasser undurchsichtig zu machen. Tun Sie dies, um sicherzustellen, dass die Oberseite der Plattform für das Tier während des Schwimmens auf Augenhöhe nicht sichtbar ist.

Nachdem die Mäuse zuvor identifiziert und markiert wurden, das Tier vorsichtig in das Labyrinth geben, sodass die Nasenspitze (ENT) zur Wand zeigt. Jede Maus wird für einen einzelnen Versuchsdurchlauf an derselben Startposition platziert. Zum Zeitpunkt der Freigabe der Maus die Stoppuhr starten und sich in einem Bereich aufhalten, von dem aus der Versuchsleiter für die Mäuse nicht leicht sichtbar ist.

Sobald das Tier die Plattform erreicht, lassen Sie es 15 Sekunden lang auf der Plattform verbleiben, um seine räumliche Position im Raum zu orientieren. Falls die Maus die Plattform innerhalb von 60 Sekunden nicht findet, heben Sie sie vorsichtig auf und setzen Sie sie auf die Plattform. Nach 15 Sekunden auf der Plattform entfernen Sie die Maus aus dem Labyrinth und bringen Sie zurück in den beheizten Käfig.

Nachdem das Labyrinth vorher von Ablagerungen gereinigt wurde, wiederholen Sie diese Verfahren für die verbleibenden Mäuse der Gruppe. Führen Sie für die Testtage vier bis neun somit täglich vier Durchgänge mit Training am versteckten Plattformversuch durch, wobei zwischen den einzelnen Durchgängen etwa 20 Minuten liegen. Führen Sie die Probelauf-Versuche vor dem Plattformtraining am sechsten, siebten und achten Tag sowie den endgültigen Probelauf-Versuch durch.

Am Tag 10 führen Sie die Probetrans mit einer ähnlichen Vorgehensweise wie beim versteckten Plattformtraining durch, mit dem Unterschied, dass sich keine Plattform im Labyrinth befindet. Setzen Sie eine Maus von einem vorbestimmten Abgabepunkt frei und lassen Sie die Maus 60 Sekunden lang im Labyrinth schwimmen. Nach dem Probetrans am Tag 10 werden keine weiteren Versuche während der Probetrans durchgeführt. Verwenden Sie eine Tierverfolgungssoftware, um die zurückgelegte Wegstrecke des Tieres, den Prozentsatz der Zeit, die das Tier in jedem Quadranten des Labyrinths verbringt, sowie die Anzahl der Durchschwimmungen des zuvor platzierten Plattformbereichs zu erfassen.

Öffnen Sie die Registerkarte „Versuchsliste“ und rufen Sie die Messungen über die Registerkarten „Datenanalyse“ und „Wasserlabyrinth“ ab. Exportieren Sie die Daten direkt in eine Excel-Tabelle. Analysieren Sie anschließend die Daten gemäß den Anweisungen im schriftlichen Teil des Protokolls.

41 TP 3 0 1 L-Mäuse mit dem humanen P 3 0 1 LTL-Gen und 46 Kontrolltiere wurden im Alter von etwa 6,5 Monaten mit diesem Protokoll untersucht. Dies entspricht einer dreimonatigen Expression von Tau P 3 0 1 L bei den transgenen Tieren. Jede Gruppe enthielt ungefähr gleiche Anzahlen männlicher und weiblicher Tiere bezüglich der Pfadlänge.

Das Training mit der unsichtbaren Plattform unterschied sich nicht zwischen den Kontrolltieren und den TP301L-Mäusen. Dieser Mangel an Unterschieden weist darauf hin, dass Kontroll- und Tau-P301L-Mäuse sich weder in der Seh- noch in der motorischen Leistungsfähigkeit unterscheiden, und dass die Leistungseinbußen bei den verdeckten Versuchen daher auf Gedächtnisstörungen zurückzuführen sind. Während des Trainings mit der verdeckten Plattform zeigten die TP301L-Mäuse jedoch über alle Trainingsblöcke hinweg signifikant längere Wegstrecken.

Schließlich verbesserten sich die Kontrolltiere über die vier Probetraversen hinweg. Während die Tau P 3 0 1 L-Mäuse keine Verbesserung zeigten, konnten die Kontrolltiere besser eine räumliche Strategie anwenden, um die Aufgabe zu lösen, und hatten gelernt, die Plattform im Zielbereich zu lokalisieren. Bei der Anpassung dieses Verfahrens für den Einsatz mit anderen Mauslinien ist es wichtig, die Lernrate der Kontrolltiere zu bewerten, um die erforderliche Anzahl an Trainingsdurchläufen zu ermitteln und festzulegen, wann der erste Probelauf eingefügt werden sollte.