Oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie Detektion von Biomolekülen Mit EBL Fabricated nanostrukturierte Substrate

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist die Herstellung und Charakterisierung konjugierter nanobiologischer Systeme, die feste nanostrukturierte Substrate mit immobilisierten Biomolekülen verbinden. Dies wird durch den Einsatz von ultrahochauflösender Elektronenstrahllithographie (EBL) erreicht, um Arrays winziger metallischer Nanostrukturen auf Quarzglasträgern zu erhalten. In einem zweiten Schritt werden die Substrate in Lösung gebracht und Biomoleküle auf ihren Oberflächen immobilisiert, wodurch die nanobiologischen Grenzflächen entstehen.

Als nächstes wird die oberflächenverstärkte Ramen-Spektroskopie (SIRS) eingesetzt, um die biologischen Moleküle an den Grenzflächen zu untersuchen. Die resultierenden Sir-Spektren zeigen die Charakteristik des Ramen-Modus für die jeweiligen Moleküle mit Intensitäten, die stark vom Substratdesign abhängen. Der Hauptvorteil unseres Ansatzes gegenüber bestehenden Techniken wie der Infrarotspektroskopie besteht darin, dass die Empfindlichkeit durch Oberflächenplasma und Resonanz innerhalb der Metallnanostrukturen stark erhöht werden kann.

Unser Ansatz erzeugt hochselektive Oberflächen, die sich durch die Kombination von molekularer Funktionalisierung und Elektronenstrahllithographie gut kontrollieren lassen. Diese Methode kann Schlüsselfragen in mehreren Bereichen beantworten, von der Explorationsforschung in der Strukturbiologie oder der durch Polymere mobilisierten Dienstleistungen bis hin zur Entwicklung verschiedener Bauelemente mit nanobiologischen Grenzflächen. Diese Methode kann in der Wissenschaft die strukturellen Eigenschaften von Biomolekülen untersuchen, mit Implikationen, die sich auf die medizinische Diagnose oder den Nachweis von Umwelteinflüssen erstrecken.

Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da sie Aspekte der Nanofabrikation, der Oberflächenfunktionalisierung, der Biochemie und der Spektroskopie umfasst, die traditionell nichts miteinander zu tun haben. Um mit dem Schleudern des Polymethylmethacrylats oder PMMA zu beginnen, resistieren und leitfähige Schichten auf den Substraten. Um dies zu erreichen, verwenden Sie einen Wafer-Spinner mit einem Vakuum-Chuck und platzieren Sie die Proben einzeln in der Mitte auf dem Chuck. Geben Sie einen Tropfen PMMA-Resist mit einer Glaspipette auf die Mitte der Proben.

Drehen Sie sich dann 60 Sekunden lang mit 3.500 U/min und einer Beschleunigungszeit von zwei Sekunden. Als nächstes backen Sie die Substrate nach dem Backen der Substrate drei bis fünf Minuten lang bei 180 Grad Celsius, kühlen Sie die Proben bei abgekühlten Substraten auf Raumtemperatur ab und kehren Sie zum Spinnerfutter zurück. Verteilen Sie einen Tropfen leitfähiges Polymer auf dem Substrat.

Drehen Sie das Substrat 40 Sekunden lang bei 3000 U/min mit einer Rampe von zwei Sekunden nach dem Schleudern. Die Proben werden nach der Elektronenstrahllithographie oder EBL-Belichtung, wie im Textprotokoll beschrieben, eine Minute lang bei 80 Grad Celsius gebacken und ein Becherglas mit dem ionisierten Wasser zur Entfernung des leitfähigen Polymers vorbereitet. Dann einen zweiten Becher mit einer Entwicklermischung zubereiten und fünf Minuten rühren, Zimmertemperatur einstellen.

Zum Schluss bereiten Sie Isopropanol in einem dritten Becherglas als Spülmittel mit einer Pinzette vor. Legen Sie die Proben drei Sekunden lang in das Wasser, um den leitfähigen Polymerfilm zu entfernen. Legen Sie dann die Probe in den Entwickler und bewegen Sie die Pinzette 20 Sekunden lang langsam auf und ab, übertragen Sie sofort die Substrate auf das Isopropanol und spülen Sie weitere 10 Sekunden lang, bevor Sie die Probe mit Stickstoff trocknen, laden Sie die Proben kopfüber in das Elektronenstrahlverdampfersystem, damit sich das verdampfte Metall auf der Vorderseite der Proben ablagern kann.

Für die Designs eins und drei wird eine 10 Nanometer dicke Goldschicht auf die Proben und für das Design eine 10 Nanometer dicke Silberschicht aufgetragen. Zwei mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,1 Nanometern pro Sekunde. Füllen Sie dann ein Beschallungssystem bis zur empfohlenen Höhe mit Wasser und füllen Sie ein separates Becherglas mit Aceton.

Legen Sie eine Probe mit der Vorderseite nach oben auf den Boden des Becherglases und lassen Sie die Probe 10 Minuten lang einweichen, während Sie das Becherglas halten. Legen Sie es in das Wasserbad und lassen Sie die Höhe des Acetons mit der Höhe des Wassers übereinstimmen. Schalten Sie dann das Beschallungssystem ein.

Lassen Sie die Beschallung bis zu 60 Sekunden lang stattfinden. Zur Vorbereitung der Design-Eins-Probe wird zunächst eine einmillimolare Lösung aus MUA und Ethanol bei Raumtemperatur hergestellt und 10 Minuten lang beschallt. Tauchen Sie das richtige nanostrukturierte Substrat 48 Stunden lang in die MUA-Lösung.

Spülen Sie die Probe dann dreimal mit Ethanol und trocknen Sie sie fünf Minuten lang. Stellen Sie die Raumtemperatur ein. Bereiten Sie als Nächstes eine 75 millimolare Lösung aus EDC und destilliertem Wasser vor.

Bereiten Sie auch eine 15 Millimolare Lösung von NHS in destilliertem Wasser mit einer Mikropipettenablagerung vor, geben Sie 100 Mikroliter NHS auf das Gold auf dem Substrat und fügen Sie sofort 100 Mikroliter EDC auf die gleiche Stelle hinzu. Inkubieren Sie eine Minute lang, um die selbstorganisierte Monoschicht von MUA zu aktivieren. Geben Sie dann einen 100-Mikroliter-Tropfen Protein, eine Lösung, auf die gleiche Fläche des Substrats.

Geben Sie die Probe in ein Fach einer Petrischale, in einem anderen Fach befindet sich ein Milliliter destilliertes Wasser. Verschließen Sie die Petrischale mit einem Deckel und lagern Sie die Probe 24 Stunden lang bei fünf Grad Celsius. Spülen Sie anschließend die Probe dreimal in destilliertem Wasser, indem Sie die Proben kontinuierlich 20 Sekunden lang in getrennten Bechern in jedem Becherglas trocknen lassen, lassen Sie die Proben nach dem Spülen oder während des Spülens für das Design zwei Proben nicht trocknen.

Bereiten Sie eine 0,9 millimolare Lösung des Glukosebindungsproteins oder GBP in Kaliumphosphatpuffer vor. Bereiten Sie auch eine 100 Millimolare Lösung von DG-Glukose im Puffer vor. Mischen Sie anschließend 30 Mikroliter der D-Glukoselösung und 30 Mikroliter der GBP-Lösung.

Inkubieren Sie mit einem Ein-Milliliter-Kunststoffbehälter für ein Mikroröhrchen und einer Mikropipette 30 Minuten lang, dann geben Sie 20 Mikroliter der ligandenfreien GBP-Lösung und 20 Mikroliter der ligandengebundenen GBP-Lösung auf die vorbereiteten Substrate. Lagern Sie die Proben mit einer Mikropipette 24 Stunden lang bei fünf Grad Celsius in einer Petrischale mit versiegeltem Deckel. Spülen Sie die Proben dreimal in der Kaliumphosphatpufferlösung bei Raumtemperatur Zur Zubereitung.

Entwerfen Sie drei Proben: Verdünnen Sie die Dopamin-Bindungs-Apre- oder DBA-Lösung auf eine Konzentration von einem Mikromolaren. Bereiten Sie unter Verwendung des Tris-EDTA-Puffers mit einem End-pH-Wert von 7,4 eine Dopaminlösung mit einer Konzentration von fünf Mikromolen her, indem Sie das Dopaminpulver auf einer Analysenwaage messen und fünf Minuten lang mit einer Rührkugel in die phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS mischen. Geben Sie dann einen 20-Mikroliter-Tropfen der DBA-Lösung auf die Oberfläche jedes Substrats und lassen Sie die Probe eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit einer Abdeckung über der Petrischale ruhen.

Nachdem Sie die Proben dreimal in einem Kaliumphosphatpuffer gespült haben, legen Sie die Proben aufrecht auf ein Reinraumtuch, um die Rückseite zu trocknen, während Sie einen Film auf der Vorderseite des Substrats beibehalten. Legen Sie eine Stichprobe als Steuerelement beiseite. Geben Sie als nächstes einen fünf Mikroliter der Dopaminlösung auf die Oberfläche des vorhandenen PBS.

Geben Sie die restlichen Proben ab. Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang, bevor Sie die Proben dreimal in der Kaliumphosphatpufferlösung spülen. Zur Durchführung von Ramen-Spektroskopie.

Legen Sie jede Probe in eine wasserdichte Kammer, um eine Verdunstung durch Laserbestrahlung zu vermeiden. Füllen Sie eine Kunststoffspritze mit chemisch inertem Hochvakuumfett. Legen Sie dann die Proben auf Objektträger und geben Sie einige Millimeter Fett auf, das die Proben umgibt, ohne die Proben zu berühren.

Legen Sie einen Mikroskop-Abdeckschirm auf die Substrate. Drücken Sie vorsichtig nach unten, um eine Versiegelung zu bilden, wodurch eine dünne Flüssigkeitsgrenzfläche zwischen den Substraten und den Deckgläsern entsteht, ohne dass der Puffer mit dem Vakuumfett in Berührung kommt. Mit einem optischen Raman-Mikroskopsystem erhalten Sie einen Fokus auf die Oberfläche des zu beprobenden Metall-Nanomusterbereichs, ohne den Laser einzuschalten.

Führen Sie die Raman-Probenahme durch, wie im gezeigten Textprotokoll beschrieben. Hier sind die Nanomuster-Punkt-Arrays aus Gold und Silbernickel auf Quarzglas. Die Verwendung von Elektronenstrahllithographie oder EBL ermöglicht eine hervorragende Position und Dimensionierung.

Die Größe und Spaltbreite des Kontrollpunkts wird durch die EBL-Belichtung gesteuert. Hier werden Dosis-Hexagon-Arrays aus Gold, Ende und Silber, Nickel angezeigt. Das Keimbildungsverhalten solcher sehr dünnen Metallschichten führt zu diskontinuierlichen Strukturen.

Hier ist das Serienspektrum des substratimmobilisierten Proteins A im Design eins, die Signalintensität von Array eins ist viel stärker als von Array zwei. Das Signal von Array drei war sehr schwach. Der Spaltabstand ist eindeutig ein kritischer Parameter für die Plasmaentkopplung und die Oberflächenverbesserung der dargestellten Ramen-Streuung.

Hier sind die Spektren des Glukose-bindenden Proteins, die die Auswirkungen verschiedener Substratdesigns im ligandenfreien und ligandengebundenen Zustand zeigen. Schließlich werden die Spektren des Dopamin-bindenden Aptamers für ligandenfreie und ligandengebundene Moleküle gezeigt. Als Referenz wird ein Spektrum von Dopaminpulver gezeigt.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, eine Kontamination der Substrate zu vermeiden. Da es sich um eine Spektroskopie handelt, ist die Technik sehr empfindlich und es kann zu falschen Messwerten kommen. Optimale Ausgangssubstratdesigns können für einen bestimmten Analyten identifiziert werden.

Dann können andere nphy-Methoden wie Non-Print-Phy durchgeführt werden, um die Skalierbarkeit der Substratherstellung nach ihrer Entwicklung zu verbessern. Diese Technik half Forschern auf dem Gebiet der Biochemie und Biosensorik, biologische Moleküle ohne bestimmte Oberflächen in sehr kleinen Mengen nachzuweisen, während sie in Lösung blieben. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie die Größe der Metallnanostruktur und die Schichteigenschaften mithilfe von Herstellungstechniken kontrollieren und wie Sie verschiedene biomolekulare Erkennungsstrategien nutzen können, um verschiedene Analyten anzusprechen.