Name: Oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie Detektion von Biomolekülen Mit EBL Fabricated nanostrukturierte Substrate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Lernen Sie die Herstellung nanostrukturierter Substrate mittels Elektronenstrahllithographie zur SERS-Detektion von Biomolekülen. Diese Methode ermöglicht hochsensitive Untersuchungen von Protein-Ligand-Interaktionen.

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Die Autoren danken David Wishart, Valentyna Semenchenko, Mark McDermott, Michael Woodside und Albert Cao für ihre Hilfe bei der Entwicklung und Vorbereitung der Proteinkonjugate sowie des DNA-Aptamers; T. M. Fahim Amin, Mosa Sharmin Aktar und Trevor Olsen für ihre Unterstützung bei der Probenvorbereitung, Jonathan Mane für seine Hilfe bei der Erstellung von Bildern der molekularen Strukturen; und den Finanzierungsquellen einschließlich des National Research Council of Canada – dem National Institute for Nanotechnology (NRC-NINT), dem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) und der University of Alberta für die Unterstützung der Arbeit.

1. Untergrundvorbereitung <ol><li> Verwenden Sie einen Halbleiter Trennsäge einen Quarzglas (FS) Wafer in 1 cm × 1 cm geschnitten oder kleiner Würfel. </li><li> Saubere Proben in einem Piranha-Lösung (H 2 SO 4: H 2 O 2, 3: 1; ACHTUNG: starkes Oxidationsmittel) Bad 28 für 15 Minuten, dann spülen Sie die Würfel in VE-Wasser und trocken in Stickstoff. </li><li> Platzieren Sie die Proben auf einer Heizplatte nach oben bei 180 ° C für 15 min. Kühlen Sie die Proben nach dem Entfernen von der Heizplatte auf RT. </li><li> Für Modelle 1 und 3, weiter mit Schritt 2. </li><li> Für Design 2, legen Sie die Probe in einem Elektronenstrahlverdampfungskammer und Mantel mit einem 10 nm-Schicht aus Ni. </li></ol> 2. Herstellung von Nano-strukturierte PMMA Masken mittels Elektronenstrahllithographie (EBL) <ol><li> Spin-Beschichtung der PMMA Resist und leitenden Schichten auf den Substraten. <ol><li> Verwenden Sie einen Wafer Spinner mit einer Unterdruckspannvorrichtung und Ort Proben einzeln in der Mitte auf dem Futter. Platz1 Tropfen von Polymethylmethacrylat (PMMA) Resist auf dem Zentrum der Proben unter Verwendung einer Glaspipette und Schleudern bei 3500 rpm für 60 s mit einem 2 sec Rampenzeit. </li><li> Backen Sie die Substrate bei 180 ° C für 3-5 min. Nach dem Backen wurden die Substrate, die Kühlung der Proben auf RT. </li><li> Wobei die Substrate abgekühlt und wieder in die Schleudereinrichtungs-Einspanneinrichtung, verteilen einen Tropfen leitenden Polymers auf dem Substrat. Drehen Sie das Substrat für 40 Sekunden bei 3000 Upm mit einem 2 s Rampenzeit. Bake Proben bei 80 ° C für 1 min. </li></ol></li><li> Führen EBL Exposition nach dem Standardverfahren 16,17,18,29. <ol><li> Mit den Anweisungen des Herstellers, bereiten eine Belichtungs Design beschäftigt Merkmal Dosen aus Tabelle 1 mit einer möglichst geringen Strahlenschrittweite. </li><li> Laden Sie die Probe in die Elektronenstrahllithographie Kammer. Wenn der EBL-System keine automatische Scharfeinstellung, mit einem kleinen Kratzer entfernt, wo das Muster zu belichten ist und weg von dem Wulstrand zum Schwerpunkting. </li><li> Mit den Anweisungen des Herstellers, führen Sie die erforderliche Fokussierung und Astigmatismus-Korrektur sowie Schreibfeld Ausrichtung entsprechend, und setzen die Probe. Um für die richtige Belichtung Profil und besten Musters Qualität ermöglichen, verwenden Sie ein 30 keV Elektronenstrahlenergie und 7,5 um Öffnung für die Aufnahmen. </li></ol></li><li> Entfernen Sie das leitfähige Polymer und entwickeln belichteten Proben. <ol><li> Vorbereiten einer Becherglas mit entionisiertem Wasser (DI) zum Entfernen des leitfähigen Polymers und einem zweiten Becherglas mit einem Entwicklergemisch (IPA: H 2 O, 7: 3) ​​und rühre für 5 Minuten bei RT. Bereiten Isopropanol (hohe Reinheit) in einem dritten Becherglas als Klarspülmittel. </li><li> Mit einer Pinzette, legen Sie die Proben in das Wasser für 3 Sekunden, um den leitenden Polymerfilm zu entfernen, dann die Probe in den Entwickler und bewegen Sie die Pinzette langsam auf und ab 20 Sek. Der Substrate mit dem Isopropanol Sofortüberweisung und spülen Sie für 10 Sekunden, dann trocknen Sie die Probe mit Stickstoff. </li> &lt;/ Ol&gt; </li></ol> 3. Edelmetallnanostrukturen Fabrication <ol><li> Laden der Proben auf den Kopf in die Elektronenstrahlverdampfersystem für das verdampfte Metall ermöglichen, sich auf der Vorderseite der Proben abgeschieden werden. Zahlen Sie 10 nm dicke Au-Schicht auf die Proben für Modelle 1 und 3, und einer 10 nm dicken Ag-Schicht für Design 2 mit einer Rate von etwa 0,1 nm / s. </li><li> Füllen Sie ein Beschallungssystem, um der empfohlenen Höhe mit Wasser und füllen einen separaten Becher mit Aceton. Legen Sie eine Musterseite nach oben in den Boden des Bechers und damit die Probe für 10 Minuten einweichen. Halten Sie den Becher, legen Sie sie in das Wasserbad und lassen Sie die Höhe des Aceton, um die Höhe des Wassers entsprechen und schalten Sie den Ultraschall-System. Zulassen Beschallung für bis zu 60 sec auf. </li><li> Nach dem gleichen Verfahren wie in Schritt 3.1 beschrieben, vorbereiten einheitliche Au und Ag-Pad Substraten durch Abscheidung von 10 nm dicken Metallschichten auf FS (Designs 1 und 3) und Ni-beschichtet FS (Design 2) substrates Überspringen Sie Schritt 2. </li></ol> 4. Bio-Funktionalisierung von Substraten <ol><li> Bereiten Design 1 Proben: <ol><li> Eine 1 mM Lösung von 11-mercaptodecanoic Säure (MUA) in Ethanol bei RT. Ultraschallbehandlung für 10 min. </li><li> Tauchen richtige nanostrukturierten Substrats in die Lösung von MUA für 48 Stunden. Mit Ethanol gründlich die Probe dreimal und trocken für 5 min bei RT. </li><li> Vorbereiten einer 75 mM Lösung von N-Ethyl-N &#39;- (3- (dimethylamino) propyl) carbodiimid (EDC) in DI-Wasser. Bereiten Sie eine 15 mM Lösung von N-Hydroxysuccinimid (NHS) in DI-Wasser. </li><li> Mit einer Mikropipette Kaution 100 ul NHS auf der Au auf dem Substrat, und sofort mit 100 ul von EDC in der gleichen Gegend. Inkubation für 1 min, um die selbstorganisierte Monoschicht (SAM) von MUA aktivieren. </li><li> Legen Sie eine 100 ul Tropfen Protein A-Lösung (47 &amp; mgr; M) auf derselben Fläche des Substrats und lagern Sie die Probe für 24 Stunden bei 5 ° C in einem Mehrkammer Petri dIsh mit 1 ml entionisiertem Wasser in einer anderen Kammer, und mit einer versiegelten Abdeckung. </li><li> Spülen Sie die Probe in DI-Wasser 3-mal durch kontinuierliches Rühren der Proben in getrennte Bechergläser für 20 Sekunden in jedem Becher. Lassen Sie die Proben trocken nach dem Spülen oder während der Spülung. </li><li> Fahren Sie mit Schritt 5. </li></ol></li><li> Bereiten Design 2 Proben: <ol><li> Vorbereiten einer 0,9 mM Lösung von Glucose-bindenden Proteins (GBP) in Kaliumphosphat-Puffer (K 2 HPO 4, 25 mM, pH 7,5). Vorbereiten einer 100 mM Lösung von D-Glucose in dem Puffer. </li><li> Mischungs 30 ul 100 mM D-Glucose-Lösung und 30 ul von 0,9 mM GBP-Lösung mit einer 1 ml Kunststoffmikroröhrchen Behälter und eine Mikropipette. Inkubieren für 30 min. </li><li> Beträgt 20 &amp; mgr; l des Liganden-freie GBP-Lösung und des Ligand-GBP jeder Lösung auf den vorbereiteten Untergrund mit einer Mikropipette. Lagern Sie die Proben bei 5 ° C für 24 Stunden in einer Petrischale mit einem Deckel verschlossen. </li><li> 3 mal in der Spülen Sie die ProbenKaliumphosphat-Puffer-Lösung bei RT. </li><li> Fahren Sie mit Schritt 5. </li></ol></li><li> Bereiten Design 3 Proben: <ol><li> Verdünne die Dopaminbindung Aptamer (DBA) auf eine Konzentration von 1 &amp; mgr; M unter Verwendung des TRIS-EDTA-Puffer mit einem End-pH von 7,4. </li><li> Vorbereiten eines Dopamin-Lösung auf eine 5 &amp; mgr; M-Konzentration durch Messen der Dopamin-Pulver auf einer Analysenwaage und Mischen in der phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einem Rührstäbchen Korn für 5 min. </li><li> Abscheidung einer 20 ul Tropfen der DBA-Lösung auf der Oberfläche jedes Substrates und ließ die Proben sitzen für 1 h bei RT mit einer Abdeckung über der Petrischale. </li><li> 3 mal in einem Kaliumphosphat-Puffer (K 2 HPO 4, 25 mM, pH 7,5) Spülen Sie die Proben. </li><li> Die Proben werden aufrecht auf einem Reinraum Grad wischen, um die Rückseite zu trocknen, während ein Film auf der Vorderseite des Substrates. Stellen Sie eine Probe als Kontrolle beiseite. </li><li> Legen Sie eine 5 ul Tropfen der Dopamin-Lösung on die Fläche der vorhandenen Tropfen der PBS-Pufferlösung auf den verbleibenden Proben mit den gewünschten Dopaminkonzentrationen. Inkubieren Sie die Probe für 10 min. </li><li> Geben Sie einen Tropfen des Dopamin-Lösung auf dem Au-Pad-Oberfläche ohne Aptamer. Inkubieren für 10 min. </li><li> Spülen der Proben in dem Kaliumphosphat-Pufferlösung 3-mal. </li></ol></li></ol> 5. Raman-Spektroskopie <ol><li> Platzieren jeder Probe in eine wasserdichte Kammer um die Verdampfung durch Laserbelichtung zu vermeiden. <ol><li> Füllen Sie eine Plastikspritze mit chemisch inert Hochvakuumfett, Ort Proben auf Objektträgern und verzichten einige Millimeter von Fett um die Probestücke ohne Berührung der Proben. </li><li> Platzieren eines Mikroskopdeckglas von den Substraten und nach unten drücken, um eine Dichtung zu bilden, wodurch ein dünner Flüssigkeitsgrenzfläche zwischen den Substraten und den Deckgläsern, ohne dass der Puffer in Kontakt mit dem Vakuumfett kommen sanft. </li></ol></li><li> Mit einoptische Raman-Mikroskopsystem, erhalten einen Fokus auf der Oberfläche des Metallnano strukturierten Gebiet ohne Einschalten des Lasers abgetastet werden. </li><li> Führen Raman Abtastrate 18,19 mit einer Laserintensität von 2,4 bis 3,1 mW mit einer Gesamtdauer von weniger als 20 sec, um eine Beschädigung der Probe mit einem Ziel 10-facher Vergrößerung zu verhindern. Erwerben Ramanspektren für Proben von Designs 1, 2 und 3 mit den Anregungswellenlängen, wie in Tabelle 1 angegeben. Auch erwerben Steuerramanspektren für Lösungen von Protein A, GBP und D-Glucose und für Dopamin-Pulver, die Glasobjektträger ohne Metall Nanostrukturen als Träger für den Vergleich. </li></ol>

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<li>Briand, E., Salmain, M., Compère, C., Pradier, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+Protein+A+on+SAMs+for+the+elaboration+of+immunosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Coll.+Surf.+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Immobilization of Protein A on SAMs for the elaboration of immunosensors.</a> Coll. Surf. B: Biointerfaces. 53, 215-224 (2006).</li>
<li>Lakowicz, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiative+decay+engineering%3A+2.+Effects+of+Silver+Island+Films+on+Fluorescence+Intensity%2C+Lifetimes%2C+and+Resonance+Energy+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Radiative decay engineering: 2. Effects of Silver Island Films on Fluorescence Intensity, Lifetimes, and Resonance Energy Transfer.</a> Analytical biochemistry. 301, 261-277 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

SERS gewinnt eine Anerkennung als äußerst leistungsfähige Technik der Bio-Erkennung bietet viele einzigartige Vorteile. Der Zusammenhang mit molekularen Schwingungen ermöglicht selektiv Identifizieren &quot;Fingerabdrücke&quot; von spezifischen Analyten von SERS-Spektren, während die extrem hohe Empfindlichkeit ermöglicht Erfassen sehr kleiner Mengen des Analyten 9,10,11,35. Weiterhin ist SERS eine zerstörungsfreie Technik, die auch relativ unempfindlich gegenüber Wasser ist, und somit ist es sehr gut für das Sondieren von biologischen Materialien in ihrem natürlichen wässrigen Umgebung 9 geeignet. Die vorgestellten Ergebnisse unterstreichen diese Vorteile sowie weitere starke Potenzial der SERS zu demonstrieren, wie sehr flexibel markierungsfreie Technik der Bio-Erkennung. In drei Ausführungen beschäftigt Monoschichten aus unterschiedlichen Substrat immobilisierten Biomoleküle, haben Raman-Modus erkannt wurde, das selbstbewusst auf die besonderen Analyten zurückgeführt werden könnten. Dass die Detektion dieser Biomoleküle, or ihren Liganden, nachgewiesen worden unter Verwendung planarer Oberflächen aus Quarzglas als Träger für SERS Substraten macht die Entwürfe mit Stromelektronik und Mikrofluidik Einstellungen kompatibel verspricht zahlreiche Anwendungen im Zusammenhang mit den Schwellen bioelektronische Architekturen Anbindung biologischer Materialien mit Oberflächen von elektronischen und elektrochemische Vorrichtungen, 2,3. Wichtig ist, dass in zwei der drei Ausführungen SERS Detektion für die spezifische Bindung von kleinen Molekülen, wie Glukose und Dopamin, Verwendung Monoschichten von der Oberfläche immobilisierte Protein und Aptamer jeweils gezeigt, wie die Erkennungselemente. Jedoch einige Aspekte kümmern sollten, um eine effiziente SERS bio-Detektion in der Einstellung &quot;on-chip&quot; Mittel aufzustellen. Zunächst wird eine bekannte Herausforderung, die für die meisten Biomoleküle gemeinsam ist, ist ihre Neigung, sich zu zersetzen, insbesondere wenn sie nicht-natürlichen Bedingungen wie trockene envi exponiertenwelt oder intensivem Laserlicht. Im gesamten Protokoll haben wir die Bedeutung der immer halten die bio-funktionalisierten Proben in geeigneten Lösungen getaucht während des gesamten Experiments, von der Vorbereitung der Proben für den Erwerb von Raman-Spektren betont. Für letztere hat eine benutzerdefinierte wasserdichte Kammer ausgelegt (Abbildung 7), um Verdampfung der Flüssigkeit bei der Laserbelichtungen zu vermeiden. Die Dauer der Belichtung und Laserintensität sollte begrenzt sein, wie in Schritt 5.3 beschriebenen Protokoll zu Schäden an den Proben zu vermeiden. Die Ergebnisse der SERS Detektion empfindlich auf die Geometrie des eingesetzten Substrats, insbesondere der inter Merkmal Trennung der metallischen Nanostrukturen gefunden. Wie aus den 8 und 9 folgt, die SERS Intensität Design 1 Proben hängt stark von der Breite der Lücken zwischen Au Nano Dots auf Quarzglas. Von drei Reihen von Au Nanopunkte getestet in diesem Design (Abbildung 8) wird die höchste Raman-Intensität mit Array I, der die engsten Lücken zwischen den Au-Funktionen verfügt und deshalb bietet eine effizientere elektromagnetischen Feldverstärkung erreicht. Wie 9 zeigt, wird die Steuerung der inter Merkmal Trennungen auf dem Niveau von 10-20 nm oder weniger erforderlich. Der Einsatz EBL zur Herstellung SERS Substrate, wie hier gezeigt, ist eine effiziente Lösung, die speziell für die Steuerung der Breite der inter Funktion Lücken. Mit einem Positiv-Resist EBL wie PMMA, kann die Größe der Löcher in PMMA Masken durch einfaches Ändern der Belichtungsdosen variieren. Nach dem Abheben führt dies zu verschiedenen Größen von Metall Punkte, und die Breite der Lücken zwischen den Punkten kann durch Auswahl der richtigen EBL Exposition gewünschten Dosen 18 abgestimmt werden. Die andere Herausforderung ist die Optimierung der SERS-Substrat-Geometrie für spezifische bio-Erkennungsanwendung. Obwohl der Verstärkungseffekt ierhöh mit einer Verringerung der inter-Merkmalsräume, die relativ große Größe der biologischen Moleküle Beschränkungen auferlegt, wie schmal die Lücken kann. Dies ergibt sich aus den Ergebnissen für Design 2, wobei die Immobilisierung Verfahren ist derart, dass das Protein effizient bindet nur an der Oberfläche zwischen Edelmetall Punkte, aber nicht über die Punkte selbst (siehe 3B). Wie aus Abbildung 10 folgt, haben die SERS-Spektren für unstrukturierte Ag Pads keine Bands aus dem Analyten zu zeigen. Obwohl die Pads weisen eine nanokristalline Struktur mit sehr dünnen interInselDurchBrüche (siehe Figur 6F), diese Lücken zu schmal sind, um ein Proteinmolekül aufzunehmen. Noch ein anderes Maß an Komplexität hinzugefügt wird, wenn Protein-Ligand-Bindungs ​​erfasst werden muss. In Abbildung 10 sind die SERS CH-Banden ausgeprägter in den Spektren von ligandgebundene GBP als in dem Liganden-freie, das hypothetisch von einer Änderung in dem GBP Konformation erläuterndenbei der Bindung von D-Glucose 2 7,27, was zu einer starren Struktur mit einer erhöhten Raman-Aktivität. Wenn man die beiden nanostrukturierten Substraten, die CH-Band aus ligandenfreien Proteins ist stärker in der SERS-Spektren mit dem Nanopunkte Substrat erhalten, während sowohl die Protein- und Glucose CH-Banden von Ligand-Protein ausgeprägter sind mit Nano-Hexagonen vergleicht Substrat. Zwei Faktoren sollen in diesen Unterschieden resultieren, die Verfügbarkeit von Raum zwischen Ag kennzeichnet, wo die GBP könnte zu Ni zu binden, und die Empfindlichkeit des Liganden-gebundenen Liganden und freien Proteins an die elektromagnetische Verstärkung der Raman-Streuung in &quot;hot spots&quot; zwischen diesen Funktionen. Auf der einen Seite bietet der Nano-Punktmuster einen relativ größeren inter Funktion Bereich, in dem Ni-Beschichtung ist für das Protein zu binden, was eine für die Glucose-frei GBP auf Ag Nano Punkte Substrat beobachtet ausgeprägter CH Band erklären kann. Auf der anderen Seite, aufgrund ihrer nicht einheitlichen Struktur (siehe 6D), Ag Nanosechsecke könnten anfällig für eine stärkere elektromagnetische Verstärkung in engen Spalten zwischen Ag-Inseln im Nanosechs was zu stärkeren CH-Schwingungsbanden aus Glucose gebundenen GBP auf der Nano-Sechsecke Substrat zu zeigen. Einige Details dieses Zusammenspiel erfordern weitere Überprüfung und Optimierung der SERS Substrate für komplexe Analyte, die große Proteine ​​wie das GBP ist immer noch in der Pipeline. Offensichtlich wird SERS Detektion Ligandbindung Verwendung immobilisierten Biomolekülen als Erkennungselement erleichtert wird, wenn nur der Ligand Raman in einem ausgewählten Bereich aktiv, während die anderen Komponenten nicht. Dies ist der Fall von Design 3, wo ausgeprägte SERS Bands Aptamer gebundenen Dopamin erhalten werden (Abbildung 11). Das Aptamer-Dopamin-Paar zeigt hervorragende Ergebnisse hinsichtlich Spezifität und der SERS-Spektrum umfasst ausgeprägte Bänder ohne nennenswerte Hintergrundsignal. <p class="jove_content"&gt; Future vor der Label-Gebühr SERS-Technologie würde bedeuten, umfangreiche Tests von Biomolekülen &quot;SERS Signalverstärkung mit einer breiten Palette von verschiedenen Oberflächennanostruktur-Designs. Die Verwendung von Direktschreibelektronenstrahllithographie verschiedene Nanostrukturen mit einem hervorragenden Grad an Kontrolle über Größe, Form, und inter-Funktion Trennung herzustellen, in Kombination mit den Probenvorbereitungsprotokollen hier vorgestellten, würden erleichtert den Vergleich und die Kreuzvalidierung der erzielten Ergebnisse die von verschiedenen Forschungsgruppen. Dies würde die große Herausforderung an Reproduzierbarkeit zu adressieren, wenn die SERS Substrate werden hergestellt unter Verwendung alternativer &quot;bottom up&quot; Verfahren 11,12,13, so dass für eine bessere Kontrolle der Größe Metallnanostruktur und Position zu einer zuverlässigen Identifizierung von optimalen Substrat Design für eine Vielzahl von Anwendungen. Skalierbarkeit dieser Techniken kann anschließend durch Vereinigen EBL mit komplementären nanolithography Methoden wie Nano verbessernImprint-Lithographie 19 auf zukünftige Massenproduktion von Nano Designs optimiert den Einsatz der abstimmbaren EBL-Techniken.

Fähigkeiten zu entwickeln und zu charakterisieren Konjugat Nano biologischen Systemen die Anbindung feste Nanostrukturen und biologische Polymere sind immer auf weitere Fortschritte in der nächsten Generation von Bio-Sensorik und bio-Betätigung Technologien 1,2 zunehmend an Bedeutung. Dies umfasst multidisziplinäre Studien in einer Reihe von Forschungsbereichen, wie zum Beispiel die Herstellung von relevanten Halbleiterkomponenten (Mikro-oder Nanoelektroden, nanotechnisch Beschichtungen, Nanodrähte oder Nanopartikel) 2,3,4; Immobilisierung von Biomolekülen an der Oberfläche, um die gewünschten Biokonjugate 5,6,7 schaffen; und Überwachungsnano biologischen Schnittstellen 1. In den meisten Fällen ist die Auswahl der optimalen Verarbeitung, Bio-Funktionalisierung und Charakterisierungsmethoden stark miteinander verknüpft. Selbstverständlich ist die Wahl der Nanotechniken von den Anforderungen der Halbleiterkomponenten des Systems angesteuert werden, wobei weitgehend auf das Nachweisverfahren, das in turn wird durch die Natur der beteiligten Biopolymeren und dem Zwecke der Überwachung der Grenzfläche bestimmt. Aus einer breiten Vielfalt von Techniken angewendet, um Biokonjugat Systeme 1,3, oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie (SERS) charakterisiert wurde als vielversprechende Methode zur Detektion von chemischen und biologischen Spezies auf Oberflächen 8,9,10,11 taucht. SERS beschäftigt unelastische Streuung von monochromatischem Licht von der Oberfläche immobilisierten Biomolekülen (Abbildung 1), was die Erfassung eindeutige Signaturen entsprechend Molekülschwingungen. Diese Fähigkeit, zwischen verschiedenen Molekülen ohne Einbeziehung Etiketten, Komplexchemie oder der zeitraubende Schritte zu unterscheiden, macht SERS eine potentiell sehr effizientes Verfahren zur biologischen Detektion. Ein weiterer wichtiger Vorteil der SERS ist die hohe Empfindlichkeit. Die Anregung der lokalisierten Oberflächenplasmonen durch Licht Interaktion mit Edelmetall-Nanostrukturen (SERS-Substrate) erhöht drastisch die intichte der Raman-Streuung durch den Analyten, um die Detektion von sehr geringen Mengen von Molekülen von Monoschichten auf der Einzelmolekülgrenze 8,9,10,11. Schließlich sind die meisten Biomoleküle erfordern wässrigen Lösungen stabil. Denn Wasser hat oft begrenzt Raman-Aktivität, wird Hintergrundsignal aus wässrigen Proben minimiert 9. Anwendungen der SERS haben einen exponentiellen Anstieg in der letzten Dekade 10 ausgestellt. Es ist ein viel diskutiertes Herausforderung SERS, dass die elektromagnetische Verstärkung der Raman-Streuung hängt entscheidend von der Größe, Form und Abstand der Metall-Nanostrukturen, wo plasmonischer Wellen induzierten 11,12,13. Um eine effiziente und reproduzierbare SERS-Messungen zu ermöglichen, die Kontrolle über die Substratgeometrie bei der nanoskaligen Dimensionen erforderlich. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig1.jpg" /> Abbildung 1. ScHäm oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie. Eingesetzt, um SERS Substrate 11,12,13 herzustellen sind zahlreiche Verfahren lassen sich grob in Bottom-up- und Top-down-Methoden klassifiziert werden. Verfahren der ersten Art verwenden verschiedene Verfahren der Selbstorganisation oder gerichtete chemische Synthese von Nanostrukturen zu erzeugen. Häufig angesprochen Beispiele sind Immobilisierung monodisperse Nanopartikel auf festen Trägern 11,12,13, thermische, Sputter oder elektrochemische Abscheidung von aufgerauten Metallfolien 11,12 und verschiedene chemische Syntheseverfahren 13. Obwohl solche Techniken in der Regel relativ einfach und preiswert zu sein, die meisten davon sind durch einen Mangel an Kontrolle über die Lage der Strukturen und begrenzte Probe zu Probe Reproduzierbarkeit in Frage gestellt. Im Gegensatz dazu von oben nach unten Lithographietechniken verwenden manipulierbaren Instrumente wie Teilchenstrahlen zu gewünschten Mustern auf den Oberflächen zu schaffen. Eines der am häufigsten verwendetenNanolithographie Methoden der Elektronenstrahllithographie (EBL), bietet eine hervorragende Kontrolle über kennzeichnet bis unter 10 nm und eine Flexibilität, um für verschiedene Substrat Designs auf festen Trägern 11,12 ermöglichen. In EBL, ein Elektronenstrahl fokussiert auf einen Fleck von wenigen Nanometern Durchmesser Scans über eine Oberfläche eines Elektronenempfindlichen Material (Resist) Bewirken einer chemischen Veränderung in den belichteten Bereichen. Bei positiven Ton wider wie Polymethylmethacrylat (PMMA), Elektronenstrahlbelichtung ergibt Spaltung der Polymerketten, aus denen die Resist, was zu einer erhöhten Löslichkeit in einem geeigneten Lösungsmittel (Entwicklung). Das Verfahren der Elektronenstrahllithographie umfasst Aufschleudern einer gleichmäßigen Schicht von Resist auf ein Substrat; Exposition der Zielresistmaterial in einer Vakuumkammer mit einem Elektronenstrahl; und Entwicklung der Probe, um die löslichen Bereiche zu entfernen. Dielektrische Pfosten darunter metallischen Nanostrukturen, wie beispielsweise Quarzglas, haben been gezeigt, um die Intensitäten in SERS deutlich erhöhen aufgrund Lokalisierungs plasmonischer Wellen im Vergleich zu anderen Materialien wie Silizium 14,15. Allerdings EBL Strukturierung auf dielektrischen Substraten, insbesondere im Nanobereich, eine wichtige Herausforderung aufgrund Aufbau während der Belichtung zu berechnen. Zuvor haben wir gezeigt, daß diese Schwierigkeiten 16,17 kann durch Platzieren leitfähigen Polymerschichten über das Resist überwunden werden. In Abbildung 2 ist ein Schema des gesamten Herstellungsprozesses mit EBL Belichtung und Entwicklung, gefolgt von der Metallabscheidung und Abheben zu metallischen Nanostrukturen auf fusioniert Siliciumdioxidträgern. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig2.jpg" /> Abbildung 2. Schema von eLectron Lithographie Metallabscheidung und Abhebeverfahren verwendet wird, um metallische Nanostrukturen auf dielektrischen Substraten 16-19 herzustellen Schritte. In dieser Arbeit wird die gesamte Abfolge von Verfahrensschritten, die SERS Substrate Herstellung von EBL, Biofunktionalisierung der Substrate zeigen wir, und Sammlung von Raman-Spektren. Drei Entwürfe in unserer jüngsten Arbeiten 18,19 erkundet werden angesprochen (siehe Abbildungen 3 und 4 und Tabelle 1). In Design 1 wird rekombinantes Protein A mit Bio-funktionalisierten Au-Nanostrukturen auf einem Quarzglas (FS) Träger 18 immobilisiert und SERS Nachweis des Proteins nachgewiesen wird. In Design 2, rekombinante Glucose-bindenden Proteins 21,26,27 mit und ohne Liganden (D-glucose) wird durch Histidin-Tags in Räumen zwischen Ag-Nanostrukturen auf Ni-beschichteten FS immobilisiert, und die Bindung von Glukose an das Protein detektiert. In Design 3, thiolierten Dopamin-bindenden DNEin Aptamer 19,23 auf Au-Nanostrukturen auf FS immobilisiert, und die Bindung von Dopamin durch immobilisierte Aptamer demonstriert. Inklusive aller relevanten experimentellen Schritte von Untergrundvorbereitung zu Raman-Spektren des Erwerbs sowie Vertreter verschiedener Biomoleküle und Strategien der Immobilisierung Diese Beispiele sind nützlich für eine Vielzahl von Anwendungen, von der Exploration Forschung Abfrage Nano biologischen Schnittstellen von SERS zur Entwicklung der SERS Biosensoren von kleinen Molekülen beschäftigt Protein- oder Aptamer-Ligandenbindung als Erkennungsverfahren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig3.jpg" /> Abbildung 3. Die Schemen der drei repräsentativen Designs mit verschiedenen Biomolekülen, Methoden der immobilization und Substratmaterialien: (A) Protein A an den Edelmetallnano Punkte durch einen selbstorganisierten Monoschicht (SAM) von 11-mercaptodecanoic Säure (MUA) in DI-Wasser funktionalisierten immobilisiert; (B) Histidin-markiertes Glukose-Bindungsprotein (GBP) mit D-Glucose auf der Substratoberfläche zwischen Edelmetallnanopunkte immobilisiert komplexiert; (C) Thiol-terminierten Dopaminbindung Aptamer mit Dopamin (DBA) abgeschlossen auf Edelmetallnanopunkte immobilisiert. Detaillierte Information finden Sie in Tabelle 1. In Design 2 von Platte (B) dargestellt, wurde eine Probe ohne die entsprechenden Liganden zum Vergleich vorbereitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig4.jpg" /> 4.Biomoleküle in drei Ausführungen verwendet: (A) Protein A; (B) Glucosebindungsprotein und D-Glucose; (C) Dopaminbindung DNA-Aptamer und Dopamin. Die Proteintertiärstrukturen in (a) und (b) sind aus Protein Data Bank, PDB-1BDD 20 und 2HPH 21 sind, und mit VMD erstellt für LINUXAMD64, Version 1.9.1 22 übernommen. Das Aptamer Sekundärstruktur in (c) wird aus der Sequenz 23 vorhergesagt unter Verwendung ValFold 24 Software und mit PseudoViewer 3.0 25 gezogen. Die Buchstaben G, A, T und C entsprechen Guanin, Adenin, Thymin, Cytosin und Nukleotide sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <table border="0" fo:keep-together.within-page="always" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Design 1 </td&gt; <td> Design 2 </td><td> Design 3 </td></tr><tr><td> Biopolymer </td><td> Protein-A- </td><td> Glucose-bindende Protein (EUR) </td><td> Dopaminbindungs ​​Aptamer (DBA) </td></tr><tr><td> Bindemittel </td><td> 11-Mercaptoundecansäure (MUA) selbstorganisierten Monoschicht (SAM) </td><td> Histidin-Tags </td><td> Thiollinker </td></tr><tr><td> Ligand </td><td> Die Sonne Geht Auf </td><td> D-Glucose </td><td> Dopamine </td></tr><tr><td> Lösung </td><td> Deionisiertes Wasser (DI) </td><td> Kaliumphosphatpuffer </td><td> Tris (hydroxymethyl) aminomethan (TRIS) und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) -Puffer; Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) </td></tr><tr><td> Substrat </td><td> Au Strukturen auf FS </td><td> Ag-Strukturen auf Ni-beschichtet FS </td><td> Au Strukturen auf FS </td></tr><tr><td> Gemusterte area </td><td> 4 &amp; mgr; m × 10 &amp; mgr; m </td><td> 4 um x 8 um </td><td> 4 &amp; mgr; m × 10 &amp; mgr; m </td></tr><tr><td rowspan="3"> Muster </td><td rowspan="3"> Au-Punkte, 50 nm Pitch </td><td> Ag Punkte, 40 nm Pitch </td><td> Au Sechsecken, 200 nm Pitch </td></tr><tr><td> Ag Sechsecken, 200 nm Pitch </td><td> Au unstrukturierten Pads </td></tr><tr><td> Ag unstrukturierten Pads </td><td></td></tr><tr><td rowspan="4"> EBL Belichtungsdosen </td><td> Punkte: </td><td> Punkte: 105 &amp; mgr; C / cm 2 </td><td rowspan="4"> Sechsecke: 180 &amp; mgr; C / cm 2 </td></tr><tr><td> Array I 120 &amp; mgr; C / cm 2 </td><td> Sechsecke: 170 &amp; mgr; C / cm 2 </td></tr><tr><td> Array II 96 &amp; mgr; C / cm 2 </td><td></td></tr><tr><td> Array III 72uC / cm 2 </td><td></td></tr><tr><td> Laser-Anregungswellenlänge </td><td> 532 nm </td><td> 532 nm </td><td> 780 nm </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Drei Designs Nano biologischen Systemen.

<table><tbody><tr><td>11-Mercaptoundecansäure (MUA)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma Aldrich</a></td><td>450561&amp;nbsp; ALDRICH</td><td>Wird zur Oberflächenfunktionalisierung in Design 1 verwendet</td></tr><tr><td>Leitfähiges Polymer</td><td><a href="http://www.mrc.co.jp" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Mitsubishi Rayon</a></td><td>aquaSAVE-57xs</td><td>Eine 70 nm dicke Schicht wird als Antiladungsbeschichtung für EBL-Belichtungen verwendet</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Zusammenarbeitslabor</td><td></td><td>Ligand in Design 2</td></tr><tr><td>Dopamin</td><td>Zusammenarbeitslabor</td><td></td><td>Ligand in Design 3</td></tr><tr><td>Dopamin-bindendes Aptamer (DBA)</td><td><a href="http://www.idtdna.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Integrated DNA Technologies Inc.</a></td><td>5'- /Thiol-Modifikator C6 S-S/&amp;nbsp;AAAAAAAAAA GTCTCTGTGT GCGCCAGAGA ACACTGGGGC AGATATGGGC CAGCACAGAA TGAGGCCC-3'&amp;nbsp;</td><td>Biopolymer in Design 3</td></tr><tr><td>Fusionskieselwafers</td><td><a href="http://www.markoptics.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Mark Optics&lt;br/&gt;</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose-bindendes Protein (GBP)</td><td><a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/gi%7C145579532" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zusammenarbeitslabor</a></td><td>&lt;a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/gi|145579532"&gt;PDB-ID 2HPH&lt;/a&gt;</td><td>Biopolymer in Design 2</td></tr><tr><td>Hochvakuumfett</td><td><a href="http://www.dowcorning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Dow Corning</a></td><td></td><td>Wird zum Versiegeln der wasserdichten Kammer verwendet</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid 30 %, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td></td><td>Wird für die Piranha-Lösung verwendet</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Ethyl-&lt;em&gt;N'&lt;/em&gt;-(3-(Dimethylamino)propyl)carbodiimid (EDC)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma Aldrich</a></td><td>03450 FLUKA</td><td>Wird zur Immobilisierung des Biopolymers in Design 1 verwendet</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Hydroxysuccinimid (NHS)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma Aldrich</a></td><td>130672 ALDRICH</td><td>Wird zur Immobilisierung des Biopolymers in Design 1 verwendet</td></tr><tr><td>Pufferlösung aus Kaliumphosphat</td><td>Zusammenarbeitslabor</td><td></td><td>Puffer, der bei der Raman-Probenahme verwendet wird</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte&amp;nbsp; Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Zusammenarbeitslabor</td><td></td><td>Lösungsmittel in Design 3</td></tr><tr><td>Polymethylmethacrylat (PMMA) 950 A2</td><td><a href="http://www.microchem.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> MicroChem&amp;nbsp;</a></td><td></td><td>Eine 90 nm dicke Schicht wird als positiver EBL-Lack verwendet</td></tr><tr><td>Rekombinantes Protein A</td><td><a href="http://www.proteinmods.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Protein Mods Inc</a></td><td>&lt;a href="http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1bdd"&gt;PDB-ID 1BDD&lt;/a&gt;</td><td>Biopolymer in Design 1</td></tr><tr><td>Schwefelsäure 96 %, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td></td><td>Wird für die Piranha-Lösung verwendet</td></tr><tr><td>Tris(Hydroxymethyl)aminomethan (TRIS)- und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Puffer</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma Aldrich</a></td><td>T9285 SIGMA</td><td>Puffer in Design 3
&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Geräte&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Firma&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Katalognummer&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Anmerkungen&lt;/strong&gt;&lt;br /&gt;</td></tr><tr><td>Trennsäge</td><td>Diamond Touch Technology Inc.&lt;br /&gt;(17301 W Colfax Ave #&amp;nbsp;152, Golden, CO)</td><td></td><td>Wird zum Schneiden des FS-Wafers verwendet</td></tr><tr><td>Elektronenstrahl-Verdampfer</td><td><a href="http://www.lesker.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Kurt J. Lesker</a></td><td></td><td>Wird zum Verdampfen von Au und Ag verwendet</td></tr><tr><td>Elektronenstrahl-Verdampfer</td><td><a href="http://www.ultrahivac.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Johnsen Ultravac (JUV)</a></td><td>JuV E-gun</td><td>Wird zum Verdampfen von Ni verwendet</td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckgläser (25 mm)</td><td><a href="http://www.fishersci.ca" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fisher Scientific</a></td><td>12-545-102</td><td>Wird in der wasserdichten Kammer verwendet</td></tr><tr><td>Mikroskop-Objektträger (3&amp;times;1 in.)</td><td><a href="http://www.fishersci.ca" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fisher Scientific</a></td><td></td><td>Wird in der wasserdichten Kammer verwendet</td></tr><tr><td>Raith 150&lt;sup&gt;TWO&lt;/sup&gt; EBL-Belichtungssystem</td><td><a href="http://www.raith.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Raith Inc.</a></td><td>Raith 150&lt;sup&gt;TWO&lt;/sup&gt;&amp;nbsp; System</td><td>Wird für EBL-Belichtungen verwendet</td></tr><tr><td>Raman-Mikroskop</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thermo Scientific</a></td><td>Nicolet Almega XR</td><td>Wird für die Raman-Spektroskopie verwendet</td></tr><tr><td>Sonikatorsystem</td><td><a href="http://www.bransonic.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Branson</a></td><td></td><td>Wird für das Ablösen und Mischen von Lösungen verwendet</td></tr><tr><td>Spinner</td><td><a href="http://www.brewerscience.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Brewer Spinner and Hotplate</a></td><td>Cee 200X und Cee 1300X</td><td>Wird zum Spin-Coaten von PMMA und leitfähigem Polymer verwendet</td></tr></tbody></table>

oberflächenverstärkte raman-spektroskopie detektion von biomolekülen mit ebl fabricated nanostrukturierte substrate

Surface Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Biomolecules Using EBL Fabricated Nanostructured Substrates

Herstellung und Charakterisierung von konjugierten Nano biologischen Systemen die Anbindung metallischen Nanostrukturen auf festen Trägern mit immobilisierten Biomolekülen berichtet. Die gesamte Sequenz der relevanten experimentellen Schritte beschrieben, denen die Herstellung von nanostrukturierten Substraten unter Verwendung der Elektronenstrahl-Lithographie, die Immobilisierung von Biomolekülen auf dem Substrat, und deren Charakterisierung unter Verwendung der oberflächenverstärkten Raman-Spektroskopie (SERS). Drei Ausführungen von Nano biologischen Systemen eingesetzt werden, einschließlich Protein A, Glukose-Bindungsprotein und einem Dopamin-bindende DNA-Aptamer. In den beiden letztgenannten Fällen wird die Bindung von entsprechenden Liganden, D-Glucose und Dopamin, ist ebenfalls enthalten. Die drei Arten von Biomolekülen auf nanostrukturierten Substraten durch verschiedene Verfahren immobilisiert, und die Ergebnisse der SERS Abbildungs ​​berichtet. Die Fähigkeiten des SERS Schwingungsmoden von der Oberfläche immobilisierten Proteine ​​zu erfassen, sowie um das Protein-Ligand ein einzufangend Aptamer-Ligand-Bindung demonstriert. Die Ergebnisse zeigen auch den Einfluss der Oberflächennanostrukturgeometrie Biomolekülen Immobilisierungsstrategie, Raman-Aktivität der Moleküle und Anwesenheit oder Abwesenheit der Ligandenbindung an der SERS-Spektren erfasst.

Sammeln Steuer Raman-Spektren für die Hauptkomponenten, einschließlich der freien Proteinen in Lösung und freien Liganden in Lösung oder in Pulverform ohne Verwendung von metallhaltigen Substraten, ist wichtig, um einen angemessenen Vergleich sowie zur Interpretation Zwecke zu ermöglichen. 5A zeigt eine typische Raman- Spektrum kostenlos Protein A in DI-Wasser auf einen Objektträger ohne nanostrukturierte Substrate. Zwei Banden mit den höchsten Raman Intensität der Bande bei 2.931 cm -1 und 1,091 cm -1, entsprechen Schwingungen mit CH und CS-Bindungen sind. Andere Bänder mit einer geringeren Intensität Raman wie 563 cm -1, 1.450 cm -1, 1.653 cm -1 und 2,426 cm -1, zu einer Überlagerung von Vibrationsmodi 18,32,33,34 zurückzuführen. Steuer Raman-Spektren für den Liganden frei GPB in Pufferlösung mit drei verschiedenen Konzentrationen, 0,3, 0,9 und 1,3 mm sind in 5B gezeigt. In t<html> er herauszufinden, das breite Band um 3400 cm -1 entspricht dem Lösungsmittel 35, während die Bande bei 2935 cm -1 darstellt Vibrationen mit CH-Bindungen des Proteins 32,33. 5C zeigt die hohe Wellenlängen-Raman-Spektrum für D-Glucose in Pufferlösung für die verschiedenen Konzentrationen: 1, 6, 100, 200 und 400 mM. Wenn die Konzentration der Glucose erhöht wird, entstehen CH Bindungen Schwingungsbanden bei 2890 cm -1 und 2960 cm -1. Steuer Raman-Spektren von Dopamin in Kristallform mit beiden 532 nm und 780 nm Anregungswellenlängen erhalten werden, in 5D gezeigt. Ein großer Teil des Raman-Spektrums kommt von dem Benzolring Biegen und CH-Bindungsabschnitte des Moleküls 19,36. Einige der Banden bei ca. 3000 cm -1 nur an der 532 nm beobachtet, aber nicht 780 nm Anregungswellenlänge. pload / 52.712 / 52712fig5.jpg &quot;/&gt; Abbildung 5. Steuer Raman-Spektrum von Protein A in DI-Wasser bei 532 nm Anregungswellenlänge 18 (A) erhalten wird; Raman-Spektren von ligandenfreien Glucose-bindenden Proteins in einer Pufferlösung bei 532 nm Anregungswellenlänge (B) erhalten wird; Raman-Spektren von D-Glucose in Pufferlösung bei 532 nm Anregungswellenlänge (C) erhalten wird; und Spektren von Dopamin-Pulver bei 532 nm und 780 nm Anregungswellenlänge 19 (D) erhalten. All die Spektren regelmäßigen Raman-Spektren von Lösungen (a, b, c) und Pulver (d) auf Glasobjektträger ohne nanostrukturierten Substraten. In (D) wurde die Zuordnung der Raman-Verschiebung Regime auf verschiedene Molekülschwingungen mit Hilfe Allgemeine Atom- und Molekül Elektronische Struktur System (GAMESS) 30 und 31 MacMolPlt Software wie anderswo 19 beschrieben durchgeführt. Nachdruck Platte (a) mit Genehmigung von 18 Americeine Vakuumgesellschaft. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> Um SERS-Spektren für oberflächenimmobilisierten Biomoleküle zu erhalten, werden Substrate mit metallischen Nanostrukturen auf Quarzglasträger hergestellt wie in den Schritten 1-3 beschrieben. Die Qualität der hergestellten Substrate mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie (SEM) beobachtet. Die Standard-SEM-Verfahren werden an anderer Stelle 16,17,18, 19 beschrieben, und im vorliegenden Protokoll enthalten. Abbildung 6 zeigt repräsentative REM-Aufnahmen von Au und Ag Nanopunkten und Nanosechsartigen Strukturen (Platten ad), sowie nicht -structured Au und Ag-Pads (Platten e und f jeweils). Die nächsten Schritte beinhalten die Immobilisierung von biologischem Material auf die nanostrukturierten Substraten, bei dem drei Designs in Tabelle 1 aufgeführt sind, und Erwerb ihrer SERS Spektren. In o<html> rder um eine wässrige Umgebung während Raman-Bildgebung zu erhalten, wird jede Probe in ihrer entsprechenden Lösung (siehe Tabelle 1), verschlossen mit einem dünnen Glasabdeckung und abgedichtet, wie in Figur 7 dargestellt. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig6.jpg" /> Abbildung 6: Rasterelektronenmikroskopische (REM) von 10 nm dicke Au und Ag Oberfläche als SERS-Substrate eingesetzt Nanostrukturen: (A, B) Arrays von Nanopunkte; (C, D) Anordnungen von Nano Hexagone; (E, F) unstrukturierte Pads. Substrate mit Au-Strukturen (links) beschäftigen FS unterstützt, während Substrate mit Ag-Strukturen (rechts) mit einem 10 nm dicken Ni-Beschichtung auf der FS. Die Bilder wurden wie anderswo 16,17,18 beschrieben.pg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig7.jpg" /> Abbildung 7. Schema der wasserdichten Kammer für die Raman-Bildaufnahme von Bio-funktionalisierten Proben in Lösung. In Design 1 wird rekombinantes Protein A auf den Substraten durch eine selbstorganisierte Monoschicht aus 11-mercaptodecanoic Säure (MUA) in DI-Wasser 18 funktionalisiert immobilisiert. Die Substrate in dieser Ausführung aus drei Anordnungen von Au Punkte mit einem 50 nm-Abstand und variierender Zwischenpunktabstände auf Quarzglas (siehe 6A und 8). Das Verfahren der Immobilisierung von Proteinen beginnt mit der Bildung einer SAM auf den Substraten. Um die kovalente Bindung zwischen dem SAM und dem Protein zu erhalten, die Carbonsäuregruppen der SAMs in Amin reaktive NHS-Ester durch Behandlung mit einem Gemisch von N transformierten </em&gt; Ethyl-N &#39;- (3- (dimethylamino) propyl) carbodiimid (EDC) -Lösung und N-Hydroxysuccinimid (NHS) Lösung in entionisiertem Wasser. Immobilisierung von Protein A erfolgt durch Verschiebung der NHS-Gruppe von Lysin-Resten des Proteins 37. Ein Beispiel einer Abbildungsproben für Design 1 mit Protein A auf Au-Nanostrukturen immobilisiert ist in 9 gezeigt. 9A zeigt ein optisches Mikroskopbild der Proben, die drei Reihen von biologisch funktionalisierten Au Nanopunkte mit unterschiedlichen Zwischenpunktlücken aufweisen (siehe auch Abbildungen 3Aa und 8), und 9B zeigt die Raman-Spektralsignal Zuordnung über diesen Arrays. Es kann gesehen werden, dass die höchsten Raman-Intensitäten werden für Array I in der die Zwischenpunktlücken der engste, während niedrigere Intensitäten für Array III mit den breitesten Zwischenpunktlücken erhalten gefunden. Dies kann durch eine höhere elektrische FIE stärker Plasmonkopplungseffekt erklärenlds in die engen Zwischenräume zwischen den Punkten 18. 9C zeigt die stärkste SERS-Spektren für Arrays I und II erhalten. Die Spektren weisen mehrere Bänder (1.630 cm -1, 1.964 cm -1, 2.280 cm -1, 2.577 cm -1 und 2,916 cm -1) in der Nähe der Raman-Linien von freiem Protein A in Lösung in 5A zu sehen. Zuzuschreiben Schwingungen verschiedener Bindungen in Proteinen gefunden wird, diese Banden erscheinen entweder in ähnlichen Positionen in beiden immobilisierten Protein und in Lösung oder werden so versetzt, dass etwas höhere Wellenzahlen bei immobilisiert. Im Gegensatz dazu SERS-Spektren von ähnlichen nanostrukturierte Substrate durch MUA SAM ohne das Protein funktionalisierten zeigen ein ganz anderes Muster 18, bestätigt, dass die 9 stellt SERS Kartierung der Oberfläche immobilisierten Protein A <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um einen Blick</a><html> Größere Version der Abbildung. <img alt="8" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig8.jpg" /> Bild 8. REM-Aufnahmen von drei Reihen von Au Nanopunkte auf FS Substrat in Design 1 18 verwendet. Die Arrays haben dieselbe 50 nm Pitch und etwas anderen Punkt Radien was zu unterschiedlichen Breiten der Zwischenpunktlücken. Dies erfolgt durch Anlegen unterschiedlicher EBL Belichtungsdosen zu PMMA Masken für die drei Arrays erzeugen erreicht (siehe Tabelle 1). Höhere Belichtungsdosen führen zu größeren Löcher in PMMA Masken, so dass für größere Au Punktgrößen nach der Metallisierung und Abheben. Mit freundlicher Genehmigung von 18 American Vacuum Society Nachdruck. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> les / ftp_upload / 52.712 / 52712fig9.jpg &quot;/&gt; Abbildung 9. SERS Bildgebung Substrat immobilisiertem Protein A in Design 1. 18 (A) Lichtmikroskopbild der Probe, die aus drei Reihen von Au Nanodots mit 50 nm-Abstand und unterschiedliche Zwischenpunktspalten auf einem Quarzglassubstrat (siehe auch Abbildung 6), biofunktionalisiert wie in 3A gezeigt. (B) Raman-Mapping der Probe. (C) SERS-Spektren von Punkt Array I und II. In Tafel (B) stellt die vertikale Achse die Distanz über das Substrat, ist auf der horizontalen Achse die Raman-Verschiebung, und die Legende Balken zeigt die Raman-Intensitäten. Vertikale gestrichelte Linien in Platten (B) und (C) stellen Vergleichs Raman-Banden von freiem Protein A in der Lösung und (*) in der Platte (C) zeigt SERS Bands Array I. Die Raman-Spektren wurden von 532 nm Anregung erhaltenenWellenlänge. Mit freundlicher Genehmigung von 18 American Vacuum Society Nachdruck. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig9large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> In Ausführung 2 wird rekombinantes Glucose-bindenden Proteins (GBP) 21, komplexiert mit D-Glucose (Ligand) an den entsprechenden Substraten in Kaliumphosphatpufferlösung immobilisiert. Proben mit immobilisierten Liganden-freie GBP sind zum Vergleich ebenfalls hergestellt. In dieser Ausführung ist Glukose-bindende Protein gebunden ist, um die Oberfläche mittels einer Histidin-Markierung, die gut an Ni, jedoch nicht Edelmetalle 6 bindet. Da die Substrate Arrays von Ag Nanopunkte, Nano-Sechsecke und unstrukturierten Ag Pads auf Ni-beschichteten FS (Figuren 6B, 6D und 6F jeweils), kann man erwarten, dass die meisten der immobilisierten Proteinmoleküle in Lücken zwischen befinden Ag Nanostrukturen, wo Ni Beschichtung avTENBLÄTTER. Die Raman-Spektren für erhaltenen immobilisierten glucosefreien und Glukose gebundene GBP sind in den 10A bzw. 10B gezeigt. Alle diese Spektren zeigen eine breite Bande bei etwa 3.300 cm -1, die der Pufferlösung 35 entspricht. Die mit einer unstrukturierten Ag Pad erhaltenen Spektren enthalten nur diese einzelne Bande und keine Proteinschwingungsmoden zeigen, die bestätigt, dass immobilisiertem Protein nicht auf der Ag-Oberfläche zu finden, wie erwartet. Im Gegensatz dazu sind die Spektren mit Arrays von Ag Nanopunkte und Nano Hexagonen zeigen Banden um 1550 cm -1 bis 2900 cm -1, die den Analyten 32,33 repräsentieren erhalten. Insbesondere das breite Band um 1550 cm -1, als Amid-II-Band bekannt, auf Schuldverschreibungen Schwingungen in Proteine ​​33,34 Peptid. Im betrachteten Fall ist diese Bande stellt eine Überlagerung der Schwingungsmoden von GBP auf Ni Fläche zwischen Ag Merkmal immobilisierts, und ist ein Hinweis auf SERS-Verstärkung dieser Moden in der Nähe der Edelmetallnanostrukturen, wenn die Substrate enthaltenden Nanopunkte oder Nano Hexagonen verwendet. Dieses Band ist sehr schwach für das Protein in der Lösung in Abwesenheit von SERS-Verstärkung (5B) und außerhalb des auf Ag Pads ohne Ni Fläche für die Proteinbindung vor, aber es ist für nanostrukturierten Substraten mit einigen Ni Fläche für das Protein zugänglich ausgeprägt zu binden. Noch wichtiger für die vorliegende Studie sind jedoch die anderen, schmaleren Bänder um ca. 2900 cm -1, die CH-Bindung zurückzuführen ist wibrations 32,33. Das Spektrum der glucosefreien GBP eine ausgeprägte Bande bei 2.933 cm -1 mit dem Nanopunkte Substrat und eine schwache, aber erkennbare Bande bei einer ähnlichen Wellenlänge mit der Nano Hexagonen Substrat (10A). Unterscheidet sich von dem Fall von Glucose freien Protein, das SERS-Spektren von Glukose gebundene GBP in Figu gezeigten<html> Wieder 10B zeigen zwei Banden, die CH-Bindungen Vibrationen Regime, bei 2850 cm -1 und 2910 cm -1. Die Bänder sind in dem Spektrum von Glukose gebundene GBP nano Hexagonen Substrat ausgeprägt, und sie können auch im Spektrum des GBP auf Nano dots Substrat gesehen werden. Die Bande bei 2.850 cm -1 ist ziemlich nahe an der 2.890 cm -1 ein in der Steuer Raman-Spektrum von D-Glucose in Lösung ist, und daher entfallen, die an das Protein gebunden Glucose, wohingegen das andere Band (bei ​​2.910 cm -1) auf die CH-Bindung Schwingungen sowohl des Proteins als Glucose. Man kann diese Differenz der SERS Signaturen aus glucosefreien und Glukose gebundene Substrat immobilisiertem GBP abzuschließen beobachtbar ist in diesem Bereich, und CH-Bindung Schwingungen proteingebundener Glucose nachweisbar Verwendung der beschriebenen Ausgestaltung. 10.jpg &quot;/&gt; Abbildung 10. SERS-Spektren von ligandenfreien (A) und Liganden-gebundenen (B) Glucose-bindende Protein an drei verschiedenen Substraten in Design 2 immobilisiert. Die Spektren wurden mit 780 nm Anregungswellenlänge erhalten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig10large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen dieser Zahl.</a> In Ausführung 3 ist die kundenDopaminBindung Aptamer (DBA) mit Thiol Terminierung 23, die auf dem Substrat in Tris (hydroxymethyl) aminomethan (TRIS), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Pufferlösung immobilisiert, und die Dopamin wird dann mit dem immobilisierten Aptamer 19 gebunden. Die Substrate für dieses Design enthalten Arrays von Au-Nanosechsecke auf FS (6C). Unstrukturierte Au-Pads (6E) werden auch zur Steuerung verwendet. Da die DNA ist selbstfluoreszierenden 38, 780 nm Anregung waveleng<html> th ist in Design 3 verwendet werden, um diesen Faktor zu reduzieren. Bei dieser Konstruktion wird das Erkennungselement (Aptamer) nicht Raman im Bereich der Ramanverschiebungen in der 11 als aktiv, während Dopamin zeigt eine signifikante Raman-Aktivität in diesem Bereich. Da das Signal von den Proben nur Dopamin ohne immobilisierten Aptamer ausgesetzt zeigt keine resultierende Dopamin Bänder 19 werden die beobachtete SERS Bänder soll von Aptamer-gebundenen Dopamin stammen, Fig. 11 vergleicht die SERS-Spektren von immobilisierten Aptamer auf Gold-Nanostrukturen vor und nach der Zugabe von Dopamin. Wie erwartet, hat immobilisiert Dopamin freie Aptamer nicht zeigen Raman-Banden. Im Gegensatz dazu ist eine Anzahl von ausgeprägten Raman-Banden für Dopamin-gebundenen immobilisierten Aptamer beobachtet. Die Positionen der meisten Bands in Figur 11 sind in der Nähe in kristallinem Dopamin, wenn auch mit Unterschieden in der Amplitude. ild 11 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52.712 / 52712fig11.jpg &quot;/&gt; Abbildung 11. SERS-Spektren von ligandenfreien (lila Linie) und ligandengebundenen (blaue Linie) Dopamin-bindenden Aptamer auf Au Nanosechs Substrate in der Entwurfs immobilisiert 3 19. Die rote Linie zeigt eine Steuer SERS-Spektrum von Dopamin-Pulver. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig11large.jpg" target="_blank">Bitte Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Wir beschreiben die Herstellung und Charakterisierung nanobiologischer Systeme, indem wir nanostrukturierte Substrate mit immobilisierten Proteinen und Aptameren verbinden. Die relevanten experimentellen Schritte, die die lithographische Herstellung nanostrukturierter Substrate, die Biofunktionalisierung und die charakterisierte oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie (SERS) umfassen, werden berichtet. Die SERS-Detektion von oberflächenimmobilisierten Proteinen und die Untersuchung der Protein-Liganden- und Aptamer-Liganden-Bindung wird demonstriert.

Oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie Detektion von Biomolekülen Mit EBL Fabricated nanostrukturierte Substrate

Fabrication and characterization of conjugate nano-biological systems interfacing metallic nanostructures on solid supports with immobilized biomolecules ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist die Herstellung und Charakterisierung konjugierter nanobiologischer Systeme, die feste nanostrukturierte Substrate mit immobilisierten Biomolekülen verbinden. Dies wird durch den Einsatz von ultrahochauflösender Elektronenstrahllithographie (EBL) erreicht, um Arrays winziger metallischer Nanostrukturen auf Quarzglasträgern zu erhalten. In einem zweiten Schritt werden die Substrate in Lösung gebracht und Biomoleküle auf ihren Oberflächen immobilisiert, wodurch die nanobiologischen Grenzflächen entstehen.Als nächstes wird die oberflächenverstärkte Ramen-Spektroskopie (SIRS) eingesetzt, um die biologischen Moleküle an den Grenzflächen zu untersuchen. Die resultierenden Sir-Spektren zeigen die Charakteristik des Ramen-Modus für die jeweiligen Moleküle mit Intensitäten, die stark vom Substratdesign abhängen. Der Hauptvorteil unseres Ansatzes gegenüber bestehenden Techniken wie der Infrarotspektroskopie besteht darin, dass die Empfindlichkeit durch Oberflächenplasma und Resonanz innerhalb der Metallnanostrukturen stark erhöht werden kann.Unser Ansatz erzeugt hochselektive Oberflächen, die sich durch die Kombination von molekularer Funktionalisierung und Elektronenstrahllithographie gut kontrollieren lassen. Diese Methode kann Schlüsselfragen in mehreren Bereichen beantworten, von der Explorationsforschung in der Strukturbiologie oder der durch Polymere mobilisierten Dienstleistungen bis hin zur Entwicklung verschiedener Bauelemente mit nanobiologischen Grenzflächen. Diese Methode kann in der Wissenschaft die strukturellen Eigenschaften von Biomolekülen untersuchen, mit Implikationen, die sich auf die medizinische Diagnose oder den Nachweis von Umwelteinflüssen erstrecken.Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da sie Aspekte der Nanofabrikation, der Oberflächenfunktionalisierung, der Biochemie und der Spektroskopie umfasst, die traditionell nichts miteinander zu tun haben. Um mit dem Schleudern des Polymethylmethacrylats oder PMMA zu beginnen, resistieren und leitfähige Schichten auf den Substraten. Um dies zu erreichen, verwenden Sie einen Wafer-Spinner mit einem Vakuum-Chuck und platzieren Sie die Proben einzeln in der Mitte auf dem Chuck. Geben Sie einen Tropfen PMMA-Resist mit einer Glaspipette auf die Mitte der Proben.Drehen Sie sich dann 60 Sekunden lang mit 3.500 U/min und einer Beschleunigungszeit von zwei Sekunden. Als nächstes backen Sie die Substrate nach dem Backen der Substrate drei bis fünf Minuten lang bei 180 Grad Celsius, kühlen Sie die Proben bei abgekühlten Substraten auf Raumtemperatur ab und kehren Sie zum Spinnerfutter zurück. Verteilen Sie einen Tropfen leitfähiges Polymer auf dem Substrat.Drehen Sie das Substrat 40 Sekunden lang bei 3000 U/min mit einer Rampe von zwei Sekunden nach dem Schleudern. Die Proben werden nach der Elektronenstrahllithographie oder EBL-Belichtung, wie im Textprotokoll beschrieben, eine Minute lang bei 80 Grad Celsius gebacken und ein Becherglas mit dem ionisierten Wasser zur Entfernung des leitfähigen Polymers vorbereitet. Dann einen zweiten Becher mit einer Entwicklermischung zubereiten und fünf Minuten rühren, Zimmertemperatur einstellen.Zum Schluss bereiten Sie Isopropanol in einem dritten Becherglas als Spülmittel mit einer Pinzette vor. Legen Sie die Proben drei Sekunden lang in das Wasser, um den leitfähigen Polymerfilm zu entfernen. Legen Sie dann die Probe in den Entwickler und bewegen Sie die Pinzette 20 Sekunden lang langsam auf und ab, übertragen Sie sofort die Substrate auf das Isopropanol und spülen Sie weitere 10 Sekunden lang, bevor Sie die Probe mit Stickstoff trocknen, laden Sie die Proben kopfüber in das Elektronenstrahlverdampfersystem, damit sich das verdampfte Metall auf der Vorderseite der Proben ablagern kann.Für die Designs eins und drei wird eine 10 Nanometer dicke Goldschicht auf die Proben und für das Design eine 10 Nanometer dicke Silberschicht aufgetragen. Zwei mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,1 Nanometern pro Sekunde. Füllen Sie dann ein Beschallungssystem bis zur empfohlenen Höhe mit Wasser und füllen Sie ein separates Becherglas mit Aceton.Legen Sie eine Probe mit der Vorderseite nach oben auf den Boden des Becherglases und lassen Sie die Probe 10 Minuten lang einweichen, während Sie das Becherglas halten. Legen Sie es in das Wasserbad und lassen Sie die Höhe des Acetons mit der Höhe des Wassers übereinstimmen. Schalten Sie dann das Beschallungssystem ein.Lassen Sie die Beschallung bis zu 60 Sekunden lang stattfinden. Zur Vorbereitung der Design-Eins-Probe wird zunächst eine einmillimolare Lösung aus MUA und Ethanol bei Raumtemperatur hergestellt und 10 Minuten lang beschallt. Tauchen Sie das richtige nanostrukturierte Substrat 48 Stunden lang in die MUA-Lösung.Spülen Sie die Probe dann dreimal mit Ethanol und trocknen Sie sie fünf Minuten lang. Stellen Sie die Raumtemperatur ein. Bereiten Sie als Nächstes eine 75 millimolare Lösung aus EDC und destilliertem Wasser vor.Bereiten Sie auch eine 15 Millimolare Lösung von NHS in destilliertem Wasser mit einer Mikropipettenablagerung vor, geben Sie 100 Mikroliter NHS auf das Gold auf dem Substrat und fügen Sie sofort 100 Mikroliter EDC auf die gleiche Stelle hinzu. Inkubieren Sie eine Minute lang, um die selbstorganisierte Monoschicht von MUA zu aktivieren. Geben Sie dann einen 100-Mikroliter-Tropfen Protein, eine Lösung, auf die gleiche Fläche des Substrats.Geben Sie die Probe in ein Fach einer Petrischale, in einem anderen Fach befindet sich ein Milliliter destilliertes Wasser. Verschließen Sie die Petrischale mit einem Deckel und lagern Sie die Probe 24 Stunden lang bei fünf Grad Celsius. Spülen Sie anschließend die Probe dreimal in destilliertem Wasser, indem Sie die Proben kontinuierlich 20 Sekunden lang in getrennten Bechern in jedem Becherglas trocknen lassen, lassen Sie die Proben nach dem Spülen oder während des Spülens für das Design zwei Proben nicht trocknen.Bereiten Sie eine 0,9 millimolare Lösung des Glukosebindungsproteins oder GBP in Kaliumphosphatpuffer vor. Bereiten Sie auch eine 100 Millimolare Lösung von DG-Glukose im Puffer vor. Mischen Sie anschließend 30 Mikroliter der D-Glukoselösung und 30 Mikroliter der GBP-Lösung.Inkubieren Sie mit einem Ein-Milliliter-Kunststoffbehälter für ein Mikroröhrchen und einer Mikropipette 30 Minuten lang, dann geben Sie 20 Mikroliter der ligandenfreien GBP-Lösung und 20 Mikroliter der ligandengebundenen GBP-Lösung auf die vorbereiteten Substrate. Lagern Sie die Proben mit einer Mikropipette 24 Stunden lang bei fünf Grad Celsius in einer Petrischale mit versiegeltem Deckel. Spülen Sie die Proben dreimal in der Kaliumphosphatpufferlösung bei Raumtemperatur Zur Zubereitung.Entwerfen Sie drei Proben: Verdünnen Sie die Dopamin-Bindungs-Apre- oder DBA-Lösung auf eine Konzentration von einem Mikromolaren. Bereiten Sie unter Verwendung des Tris-EDTA-Puffers mit einem End-pH-Wert von 7,4 eine Dopaminlösung mit einer Konzentration von fünf Mikromolen her, indem Sie das Dopaminpulver auf einer Analysenwaage messen und fünf Minuten lang mit einer Rührkugel in die phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS mischen. Geben Sie dann einen 20-Mikroliter-Tropfen der DBA-Lösung auf die Oberfläche jedes Substrats und lassen Sie die Probe eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit einer Abdeckung über der Petrischale ruhen.Nachdem Sie die Proben dreimal in einem Kaliumphosphatpuffer gespült haben, legen Sie die Proben aufrecht auf ein Reinraumtuch, um die Rückseite zu trocknen, während Sie einen Film auf der Vorderseite des Substrats beibehalten. Legen Sie eine Stichprobe als Steuerelement beiseite. Geben Sie als nächstes einen fünf Mikroliter der Dopaminlösung auf die Oberfläche des vorhandenen PBS.Geben Sie die restlichen Proben ab. Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang, bevor Sie die Proben dreimal in der Kaliumphosphatpufferlösung spülen. Zur Durchführung von Ramen-Spektroskopie.Legen Sie jede Probe in eine wasserdichte Kammer, um eine Verdunstung durch Laserbestrahlung zu vermeiden. Füllen Sie eine Kunststoffspritze mit chemisch inertem Hochvakuumfett. Legen Sie dann die Proben auf Objektträger und geben Sie einige Millimeter Fett auf, das die Proben umgibt, ohne die Proben zu berühren.Legen Sie einen Mikroskop-Abdeckschirm auf die Substrate. Drücken Sie vorsichtig nach unten, um eine Versiegelung zu bilden, wodurch eine dünne Flüssigkeitsgrenzfläche zwischen den Substraten und den Deckgläsern entsteht, ohne dass der Puffer mit dem Vakuumfett in Berührung kommt. Mit einem optischen Raman-Mikroskopsystem erhalten Sie einen Fokus auf die Oberfläche des zu beprobenden Metall-Nanomusterbereichs, ohne den Laser einzuschalten.Führen Sie die Raman-Probenahme durch, wie im gezeigten Textprotokoll beschrieben. Hier sind die Nanomuster-Punkt-Arrays aus Gold und Silbernickel auf Quarzglas. Die Verwendung von Elektronenstrahllithographie oder EBL ermöglicht eine hervorragende Position und Dimensionierung.Die Größe und Spaltbreite des Kontrollpunkts wird durch die EBL-Belichtung gesteuert. Hier werden Dosis-Hexagon-Arrays aus Gold, Ende und Silber, Nickel angezeigt. Das Keimbildungsverhalten solcher sehr dünnen Metallschichten führt zu diskontinuierlichen Strukturen.Hier ist das Serienspektrum des substratimmobilisierten Proteins A im Design eins, die Signalintensität von Array eins ist viel stärker als von Array zwei. Das Signal von Array drei war sehr schwach. Der Spaltabstand ist eindeutig ein kritischer Parameter für die Plasmaentkopplung und die Oberflächenverbesserung der dargestellten Ramen-Streuung.Hier sind die Spektren des Glukose-bindenden Proteins, die die Auswirkungen verschiedener Substratdesigns im ligandenfreien und ligandengebundenen Zustand zeigen. Schließlich werden die Spektren des Dopamin-bindenden Aptamers für ligandenfreie und ligandengebundene Moleküle gezeigt. Als Referenz wird ein Spektrum von Dopaminpulver gezeigt.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, eine Kontamination der Substrate zu vermeiden. Da es sich um eine Spektroskopie handelt, ist die Technik sehr empfindlich und es kann zu falschen Messwerten kommen. Optimale Ausgangssubstratdesigns können für einen bestimmten Analyten identifiziert werden.Dann können andere nphy-Methoden wie Non-Print-Phy durchgeführt werden, um die Skalierbarkeit der Substratherstellung nach ihrer Entwicklung zu verbessern. Diese Technik half Forschern auf dem Gebiet der Biochemie und Biosensorik, biologische Moleküle ohne bestimmte Oberflächen in sehr kleinen Mengen nachzuweisen, während sie in Lösung blieben. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie die Größe der Metallnanostruktur und die Schichteigenschaften mithilfe von Herstellungstechniken kontrollieren und wie Sie verschiedene biomolekulare Erkennungsstrategien nutzen können, um verschiedene Analyten anzusprechen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Engineering

Ingenieurwesen

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Dieses Protokoll beschreibt ein unkompliziertes Verfahren, bei dem praktische Kunststoff-Mikroformen für einfache Mikroprägevorgänge verwendet werden, um Mikrokanäle auf nanofibrilliertem Zellulosepapier herzustellen, wobei eine Mindestbreite von 200 μm erreicht wird.

Mikroprägung: Ein praktisches Verfahren zur Herstellung von Mikrokanälen auf Mikrofluidik auf Nanozellulosepapier

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Analyse einzelner kleiner extrazellulärer Vesikel (sEVs) mittels label-freier, oberflächenverstärkter Raman-Spektroskopie (SERS), was minimalinvasive Krankheitsdiagnostik und Bewertung von sEVs als therapeutische Verabreichungsmittel ermöglicht.

Erforschung der Anwendung oberflächenverstärkter Raman-Streuung-basierter Biosensierung einzelner sEVs in der Krankheitsdiagnose und -therapie

Lernen Sie die Herstellung nanostrukturierter Substrate mittels Elektronenstrahllithographie zur SERS-Detektion von Biomolekülen. Diese Methode ermöglicht hochsensitive Untersuchungen von Protein-Ligand-Interaktionen.

Oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie Detektion von Biomolekülen Mit EBL Fabricated nanostrukturierte Substrate

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