Name: Immunfärbung zu Murine enterische Nervensystem Entwicklung visualisieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Lernen Sie Immunfärbung zur Visualisierung des murinen enterischen Nervensystems. Diese Methode zeigt Neurotransmitterexpression in Darmneuronen und erleichtert die Erforschung von Neuralleisten-Differenzierung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Arbeit wurde vonThe amerikanischen Pediatric Surgical Association Foundation Award (AG) und den National Institutes of Health K08DK098271 (AG) unterstützt.

Die University of Wisconsin Animal Care und Verwenden Committee genehmigt alle Verfahren. 1. Herstellung der Lösungen <ol><li> Verwenden 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) als Puffer und Dissektion Spüllösung. </li><li> Bereiten Sie 30% Saccharose von einem Gewicht von 30 g Saccharose und Ort in eine Flasche. In 99 ml 1x PBS und 1 ml 10% Natriumazid. Es wird gründlich gemischt, bis die gesamte Saccharose gelöst. Lagerung bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Vorbereitung Blockierungslösung durch Mischen 1x PBS, 3% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% Triton-X-100. Gründlich mischen und im Kühlschrank aufbewahren, bis sie benötigt. </li><li> Vorbereitung 8% Paraformaldehyd (PFA) Lösung in 1x PBS durch Wiegen der entsprechenden Menge an PFA in 1x PBS gewaschen und dann bei 65 ° C inkubieren, bis es vollständig gelöst ist. Shop in 25 ml-Teilmengen in dem -20 ° C Gefrierschrank bis zum Gebrauch. Verdünnt auf 4% PFA in 1x PBS am Tag der Verwendung. </li></ol> 2. Embryo und Gut DissectIon <ol><li> Gemäß Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt Protokolle, einschläfern zeitlich schwangere Maus und übertragen Sie die Gebärmutter in eine 60 mm Petrischale mit eiskaltem 1x PBS. </li><li> Unter einem Dissektionsmikroskop mit einer scharfen Schere, schneiden Sie die Gebärmutterwand geöffnet, um die Embryonen aus. Entfernen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter und der Ort in ein sauberes 60 mm Petrischale mit eiskaltem 1x PBS. </li><li> Euthanize jedem Embryo durch Enthauptung in eiskaltem 1x PBS. Wenn Sie mit transgenen Mäusen, fluoreszierende Proteine ​​enthalten, werden unter Fluoreszenzbeleuchtung, identifizieren die positive transgenen Embryos. </li><li> Präparieren Sie die GI-Trakt von jedem Embryo mit einem Dissektionsmikroskop. Verwendung einer feinen Pinzette, richten den Embryo, so dass die linke Seite nach oben gerichtet ist und die rechte Seite ist an dem Boden der Petrischale. Entfernen Sie die obere Körperwand aus dem Embryo, die inneren Organe aus. Legen feinen Pinzette zwischen der dorsalen Körperwand und der inneren Organe. Cross die Zange gegeneinander in einer scherenartigen Schneidwirkung auf die inneren Organe aus dem Embryo zu entfernen. </li><li> Weitere Unter sezieren die GI-Trakt entfernt von den umliegenden Organe und legen Sie dann jedes GI-Trakt in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit eiskaltem 1x PBS. </li></ol> 3. Fixierung der GI Tracts <ol><li> Mit eiskaltem 1x PBS spülen jedes GI-Trakt 3 mal und dann mit 4% PFA ersetzen. Befestigen Sie die Verdauungstrakt in den 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf einem Wippschüttler bei RT für 1,5 Std. Spülen Sie den Verdauungstrakt 3 mal für 5 min bei RT und dann für 1 Stunde auf dem Wippschüttler. In dieser Phase speichert die Verdauungstrakt bei 4 ° C in 30% Saccharose in 1 × PBS mit 0,1% Natriumazid, bis sie benötigt. HINWEIS: Sie speichern die Embryonen in 30% Sucrose für bis zu einem Jahr ohne irgendeine Wirkung auf die Integrität der Gewebe. Lagerung der Proben in 30% Saccharose ermöglicht die spätere Verarbeitung der Proben entweder Immunofärbung oder in OCT für Cryo-sectioning. Alternativ fahren Sie mit dem unten beschriebenen Immunfärbung Protokoll. </li></ol> 4. Immunfärbung Protocol <ol><li> Wenn Proben in 30% Saccharose gespeichert worden ist, spülen Sie sie 3-mal für 20 min in 1x PBS auf einem Wippschüttler. </li><li> Legen Sie die Verdauungstrakt in Blocking-Lösung auf einem Wippschüttler für 1 h bei RT. </li><li> Entfernen Sie die Blockierlösung und Inkubation der Verdauungstrakt mit der entsprechenden Menge des primären Antikörper in Blockierungslösung entweder für 4 h bei RT oder O / N bei 4 ° C auf einem Wippschüttler verdünnt. Verwenden Sie 1: 1000-Verdünnung von menschlichen Anti-Hu-Antikörper (Serum von Patienten gewonnen), 1: 1000-Verdünnung von Huhn anti-grün fluoreszierende Protein (GFP) Antikörper und 1: 100 Verdünnung von Ziegen-Anti-ChAT-Antikörper. ANMERKUNG: Wir verwenden einen menschlichen Anti-Hu-Antikörper, der lokal von einem Patienten erhalten wurde, jedoch sind Anti-Hu-Antikörper im Handel erhältlich, beispielsweise Maus-Anti-Hu, (Einsatz bei 1: 500 Verdünnung). </li><li> Spülen Sie die Verdauungstrakt in 1x PBS3 mal für 5 min und dann für 1 h bei RT auf einer Schüttelplattform. </li><li> Ersetzen Sie die 1x PBS mit Sekundärantikörper 1: 500 verdünnt in Blockierungslösung auf einem Wippschüttler für entweder 4 h bei RT oder O / N bei 4 ° C. Verwenden Esel anti-human aminreaktiven Farbstoff wie DyLight, Esel anti-Huhn Cy2 und Esel anti-Ziege Cy5. Bei Verwendung der Maus-Anti-Hu-Antikörper dann mit einem 1: 500 Verdünnung der Esel anti-Maus-Amin-Reaktivfarbstoff 405. HINWEIS: Die Intensität des endogenen GFP und tdTomato Expression und die Klarheit der Immunsteigerung mit Entwicklungsalter. Wir typischerweise um die Antikörpervolumen zu reduzieren und auch um eine effiziente Färbung des Gewebes sicherzustellen Immunfärbung embryonalen Eingeweide einzeln in 0,2 ml-Röhrchen mit 150 &amp; mgr; l Färbelösung. </li><li> Spülen Sie die Verdauungstrakt in 1x PBS 3 mal für 5 Minuten und dann für 1 h bei RT auf einem Wippschüttler. </li><li> Legen Sie ein paar Tropfen Fluoreszenz Eindeckmedium mit DAPI auf einen Objektträger. Tauchen Sie die GI-tract in die Fluoreszenz Eindeckmedium und fügen Sie ein Deckglas direkt auf das Gewebe. Die Fluoreszenz Eindeckmediums -G eine wasserlösliche Verbindung, die eine semi-permanente Abdichtung bietet. HINWEIS: Verwenden Sie Fluoreszenz Eindeckmedium wie Vectashield das eine Glycerin basierte Einschlussmittel, das Verblassen und Photobleichen von Antikörpern verhindert ist. Beide dieser Produkte ermöglichen Gewebe für längere Zeiträume bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Machen Sie Bilder von jedem Fluorophor mit einem konfokalen Mikroskop. Verwenden Anregungswellenlängen für Fluorophore und verwendeten Filter in Tabelle 3 dargestellt. </li><li> In die computergestützte Bildanalyse unter Verwendung geeigneter Software in Abhängigkeit von der Art des konfokalen verwendet, um Bilder zu erfassen. </li></ol>

<ol><li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+determinants+of+the+independence+and+complexity+of+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system.</a> Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).</li>
<li>Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirschsprung+disease%2C+associated+syndromes+and+genetics%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review.</a> J Med Genet. 45 (1), 1-14 (2008).</li>
<li>Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonic+enteric+nervous+system+analysis+during+parenteral+nutrition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition.</a> J Surg Res. 184 (1), 132-137 (2013).</li>
<li>Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sacral+neural+crest-derived+cells+enter+the+aganglionic+colon+of+Ednrb%28-%2F-%29+mice+along+extrinsic+nerve+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers.</a> J Comp Neurol. 20 (3), 620-632 (2011).</li>
<li>Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+neuronal+density+and+neurotransmitter+expression+in+the+ganglionated+region+of+Ednrb+null+mice%3A+implications+for+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung's disease.</a> Neurogastroenterol Motil. , (2013).</li>
<li>Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neuronal+density+contributes+to+the+severity+of+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation.</a> Gastroenterology. 141 (2), 588-598 (2011).</li>
<li>Qu, Z. -D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagyánszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+analysis+of+neuron+types+in+the+mouse+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine.</a> Cell Tissue Res. 334 (2), 147-161 (2008).</li>
<li>Bian, X. -C., Bornstein, J. C., Bertrand, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+transmission+at+functionally+distinct+synapses+in+descending+reflex+pathways+of+the+rat+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Nicotinic transmission at functionally distinct synapses in descending reflex pathways of the rat colon.</a> Neurogastroenterol Motil. 15 (2), 161-171 (2003).</li>
<li>Johnson, C. D., Epstein, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+and+polyvalent+antiserum+to+chicken+choline+acetyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies and polyvalent antiserum to chicken choline acetyltransferase.</a> J Neurochem. 46 (3), 968-976 (1986).</li>
<li>Tooyama, I., Kimura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+encoded+by+an+alternative+splice+variant+of+choline+acetyltransferase+mRNA+is+localized+preferentially+in+peripheral+nerve+cells+and+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers.</a> J Chem Neuroanat. 17 (4), 217-226 (2000).</li>
<li>Koga, T., Bellier, J. -P., Kimura, H., Tooyama, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoreactivity+for+Choline+Acetyltransferase+of+Peripheral-Type+%28pChAT%29+in+the+Trigeminal+Ganglion+Neurons+of+the+Non-Human+Primate+Macaca+fascicularis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+histochemica+et+cytochemica%22%5BJournal%5D)">Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis.</a> Acta histochemica et cytochemica. 46 (2), 59-64 (2013).</li>
<li>Sang, Q., Young, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+and+chemical+coding+of+cholinergic+neurons+in+the+small+and+large+intestine+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse.</a> Anat Rec. 251 (2), 185-199 (1998).</li>
<li>Lei, J., Howard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+deletion+of+Hand2+in+enteric+neural+precursor+cells+affects+its+functions+in+neurogenesis%2C+neurotransmitter+specification+and+gangliogenesis%2C+causing+functional+aganglionosis%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis.</a> Development (Cambridge, England). 138 (21), 4789-4800 (2011).</li>
<li>Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+of+cholinergic+myenteric+neurons+during+enteric+nervous+system+development%3A+comparison+of+different+ChAT+fluorescent+mouse+reporter+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines.</a> Neurogastroenterol Motil. 26 (6), 874-884 (2014).</li>
<li>Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiology+of+Hirschsprung%27s-associated+enterocolitis%3A+importance+of+histologic+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr+Surg%22%5BJournal%5D)">The pathophysiology of Hirschsprung's-associated enterocolitis: importance of histologic correlates.</a> J Pediatr Surg. 24 (12), 1271-1277 (1989).</li>
<li>Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Children+with+Hirschsprung%27s+disease+have+an+abnormal+colonic+mucus+defensive+barrier+independent+of+the+bowel+innervation+status%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr+Surg%22%5BJournal%5D)">Children with Hirschsprung's disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status.</a> J Pediatr Surg. 32 (8), 1206-1210 (1997).</li>
<li>Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+Pten+in+the+mouse+enteric+nervous+system+induces+ganglioneuromatosis+and+mimics+intestinal+pseudoobstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction.</a> J Clin Invest. 119 (12), 3586-3596 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Labor und andere haben gezeigt, dass Darmfehlern HSCR sind nicht auf die aganglionären Kolon sogar ins ganglionated Dünndarm 5,15,16 beschränkt, sondern proximal verlängert. Diese Veränderungen umfassen Veränderungen der ENS neuronalen Dichte und Neurotransmitter-Phänotyp und können für Motilitätsstörungen, die bei Patienten mit HSCR beobachtet wurde, Rechnung zu tragen. Wir haben die oben genannten Techniken in unseren Bemühungen, die Determinanten der ENS Bildung verstehen genutzt. Insbesondere diese Techni...

Eine funktionierende enterische Nervensystem (ENS), der Motilität, Nährstoffaufnahme, und lokale Durchblutung steuert, ist lebens 1. Die ENS wird von Neuralleistenzellen (NCC), die Proliferation, Migration und besiedeln den Darm, wo sie in die Ganglien enthalten Neuronen und Gliazellen differenzieren gebildet. Hirschsprung-Krankheit (HSCR, Online Mendelian Inheritance in Man), ein multigeneic angeborene Störung mit einer Inzidenz von 1 in 4.000 Lebendgeburten, kann als das prototypische Krankheiten für das Studium unterbrochen ENS Bildung werden. In HSCR, NCC nicht zu migrieren und zu kolonisieren variabler Länge des distalen Enddarm 2. Zusätzlich sind andere gemeinsame gastrointestinale (GI) Entwicklungsstörungen bei Kindern und Jugendlichen, wie anorektalen Fehlbildungen, Darmatresien und Motilitätsstörungen mit Störungen im Grund ENS Funktionen verbunden, und werden wahrscheinlich mit subtilen, unterschätzt, anatomischen Veränderungen und funktionelle Veränderungen in assoziiertdie ENS 3-6. Daher können Techniken, die uns, die Entwicklungs Determinanten der ENS Bildung verstehen lassen das Licht auf die Entstehung und mögliche Behandlung von GI-Trakt Erkrankungen pädiatrischen vergießen. Nach der Migration und Besiedlung, unterscheidet NCC in Neuronen mit bestimmten für ihre Neurotransmitter-Phänotyp-Marker. Cholinergen Neuronen umfassen etwa 60% des enterischen Neuronen 7 und kann durch Färbung auf Cholinacetyltransferase (ChAT), dem synthetisierenden Enzyms zur exzitatorischen Neurotransmitter Acetylcholin nachgewiesen werden. Historisch versucht visualisieren cholinergen Neuronen wurden von unterschiedlichen Antigen-Spezifität von Antikörpern gegen das zentrale Nervensystem gerichtet verwechselt (CNS) ChAT gegen peripheren Nervensystem (PNS) ChAT 8-10. Jedoch Antikörper gegen Plazenta ChAT gerichtet erkennen sowohl zentrale und periphere ChAT 11-13, und wir haben vor kurzem beschriebenen Techniken, die für Visualisierungs ermöglichensierung von ENS cholinergen Neuronen mit hoher Empfindlichkeit früher in Entwicklung, als es mit Chat Reporter Linien 14 erreicht. Hier präsentieren wir eine Technik zum Präparieren, Fixierung und Immunfärbung des murinen embryonalen GI-Trakt zu ENS Neurotransmitter Expression in Neuronen zu visualisieren. FloxSTOP:: tdTomato Tiere zu produzieren Chat Cre; R26R: Für diese Studien haben wir ChAT-Cre Mäusen mit R26R gepaart genutzt floxSTOP: tdTomato Mäusen (zB Chat-Cre tdTomato ganzen Manuskript definiert). Diese Tiere wurden dann mit homozygot ChAT-GFP-Reporter Mäusen gepaart, um Mäuse, die sowohl fluoreszierenden Reportern, dass ChAT Ausdruck 14 erkennen zu erhalten. Diese beiden Reporter Tiere sind auf einem C57BL / 6J Hintergrund und im Handel erhältlich (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).

<table><tbody><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher</td><td>S2</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Fisher</td><td>BP9221</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Fisher</td><td>BP1605</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petrischalen</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ-18 Stereoskop</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ-18 Stereoskop</td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>Feine wissenschaftliche Werkzeuge</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorf Röhren</td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech, Birmingham, AL</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>VWR</td><td>16004-330</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Nikon</td><td>Nikon A1</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immunfärbung zu murine enterische nervensystem entwicklung visualisieren

Immunostaining to Visualize Murine Enteric Nervous System Development

Das enterische Nervensystem wird von Neuralleistenzellen gebildet, die sich vermehren, wandern und den Darm besiedeln. Nach der Besiedlung müssen sich die Neuralleistenzellen dann zu Neuronen differenzieren, deren Marker für ihren Neurotransmitter-Phänotyp spezifisch sind. Cholinerge Neuronen, ein wichtiger Neurotransmitter-Phänotyp im enterischen Nervensystem, werden durch Färbung auf Cholinacetyltransferase (ChAT), das synthetisierende Enzym für Acetylcholin, identifiziert. Historische Bemühungen, cholinerge Neuronen sichtbar zu machen, wurden durch Antikörper mit unterschiedlichen Spezifitäten für ChAT des Zentralnervensystems und des peripheren Nervensystems behindert. Wir und andere haben diese Einschränkung überwunden, indem wir einen Antikörper gegen plazentares ChAT verwendet haben, der sowohl zentrales als auch peripheres ChAT erkennt, um embryonale enterische cholinerge Neuronen erfolgreich sichtbar zu machen. Darüber hinaus haben wir diesen Antikörper mit genetischen Reportern für ChAT verglichen und gezeigt, dass der Antikörper während der Embryogenese zuverlässiger ist. Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zum Präparieren, Fixieren und Immunfärben des embryonalen Magen-Darm-Trakts der Maus, um die Expression von Neurotransmittern des enterischen Nervensystems sichtbar zu machen.

Wir haben bereits beschrieben die Erzeugung von Mäusen, die sowohl GFP und tdTomato fluoreszierenden Reportern, dass ChAT Ausdruck 14 zu erkennen. FloxSTOP:: Kurz gesagt, wurden Chat Cre Mäusen mit R26R gepaart tdTomato Tiere zu produzieren Chat Cre; R26R: floxSTOP: tdTomato Mäusen (genannt ChAT-Cre tdTomato). Diese Tiere wurden dann mit homozygot ChAT-GFP-Reporter Mäusen gepaart. Embryos wurden isoliert und Gewebe wurden vor ihrer festen seziert ...

Das enterische Nervensystem wird von Neuralleistenzellen gebildet, die sich vermehren, wandern und den Darm besiedeln. Neuralleistenzellen differenzieren sich in Neuronen mit Markern, die spezifisch für ihren Neurotransmitter-Phänotyp sind. Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zum Präparieren, Fixieren und Immunfärben des embryonalen Magen-Darm-Trakts der Maus, um die Expression von Neurotransmittern des enterischen Nervensystems sichtbar zu machen.

Immunfärbung zu Murine enterische Nervensystem Entwicklung visualisieren

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must ...

immunostaining-to-visualize-murine-enteric-nervous-system-development

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieser Artikel beschreibt eine optimierte Abfolge der Ereignisse für multimodale Bildgebung von zellulären Transplantaten im Gehirn von Nagetieren mit: (i) In-vivo-Biolumineszenz-und Kernspintomographie, und (ii) post mortem histologische Analyse. Die Kombination dieser bildgebenden Verfahren auf einem einzigen Tier erlaubt zelluläre Transplantat Auswertung mit hoher Auflösung, Empfindlichkeit und Spezifität.

Multimodale Bildgebung von Stem Cell Implantation in das zentrale Nervensystem der Mäuse

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung enterischer Gliazellen aus der Submukosa und der Lamina propria des Mausdarms. Es werden die Schritte beschrieben, die bei der Extraktion von Submukosa- und Lamina propria-Gewebe, der Isolierung der enterischen Gliazellen und der Kultivierung der Zellen auf einer beschichteten Well-Platte zur Etablierung einer enterischen Gliazellkultur erforderlich sind.

Isolierung enterischer Gliazellen aus der Submukosa und der Lamina propria einer Maus

Dieses Video zeigt das Verfahren zum Färben neu proliferierter neuraler Stammzellen in Hirngewebeschnitten mittels EdU-Inkorporation, gefolgt von Immunfluoreszenz zur Visualisierung spezifischer Proteine, was das Verständnis der Zelldynamik und -proliferation verbessert.

Immunfluoreszenzfärbung zur Visualisierung proliferierter neuraler Stammzellen in Hirnschnitten von Mäusen

Dieses Video zeigt die Immunfärbung des embryonalen murinen Magen-Darm-Trakts, um die Verteilung der neuronalen Population mittels Immunfluoreszenz und konfokaler Mikroskopie zu visualisieren und zu analysieren.

Immunfluoreszenzfärbung neuronaler Populationen im embryonalen gastrointestinalen Trakt der Maus

Wir stellen ein ex vivo-Assay, der die Zellmigration präzise Quantifizierung der ente Neuralleistenzellen Migrationspotential in Gegenwart von verschiedenen Wachstumsfaktoren ermöglicht.

Eine quantitative Assay für Zellmigration Murine Enteric neuralen Vorläuferzellen

Verbesserte Bildgebungstechnologie ermöglicht die dreidimensionale Bildgebung von Organen während der Entwicklung. Hier beschreiben wir ein ganzes Organkultursystem, das eine Live-Bildgebung der sich entwickelnden Zotten im fötalen Mausdarm ermöglicht.

Maus Fetal ganze Darm-System für Kultur Ex-vivo- Manipulation von Signalwegen und dreidimensionale Live-Imaging von Zotte Entwicklung

Dieses Einführungsprotokoll beschreibt die Reagenzien, Geräte und Techniken, die erforderlich sind, um die immunhistochemische Färbung von Nagetiergehirnen durchzuführen, am Beispiel von Markern für Mikroglia und neuronale Elemente.

Primer für die Immunhistochemie auf gefriergeschnitten Rat Brain Tissue: Beispiel Färbung für Mikroglia und Neuronen

Das enterische Nervensystem (ENS) ist ein Netzwerk von Neuronen und Gliazellen in der Darmwand, das die Darmreflexe steuert. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Aufzeichnung der Aktivität von enterischen Neuronen und Gliazellen in Lebendpräparaten von ENS unter Verwendung von Ca2+-Bildgebung.

In Situ Ca 2+ Imaging des enterischen Nervensystems

Ein ganzheitlicher immunhistochemischer Ansatz, um die Neurofilament-Protein-Expression im extrahepatischen Gallengang in Suncus murinus zu visualisieren. Wird hier vorgestellt. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Innervation aller viszeralen Organe in S. murinus oder anderen Spezies zu analysieren.

Mit einer vollständigen immunhistochemischen Methode, um die Innervation der Gallenwege zu studieren<em&gt; Suncus murinus</em

Hier beschreiben wir die Isolation der magensaftresistenten Gliazellen aus Darm-Submukosa mit sequentiellen EDTA Inkubationen chelatkomplex zweiwertigen kationen und dann Inkubation in nicht-enzymatische Zelle-Recovery-Lösung. Beschichtung der daraus resultierenden Zellsuspension auf Poly-D-Lysin und Laminin führt zu einer hoch angereicherten Kultur der submucosal Gliazellen für Funktionsanalyse.

Isolierung der magensaftresistenten Gliazellen aus der Submukosa und Lamina Propria der Erwachsenen Maus

Menschliche Darmorganoide müssen innerviert werden, um die Struktur und Funktion des nativen menschlichen Darms besser rekapitulieren zu können. Hier stellen wir eine Methode vor, um ein enterisches Nervensystem in diese Konstrukte einzubauen.

Innervation menschlicher Darmorganoide

Lernen Sie Immunfärbung zur Visualisierung des murinen enterischen Nervensystems. Diese Methode zeigt Neurotransmitterexpression in Darmneuronen und erleichtert die Erforschung von Neuralleisten-Differenzierung.

Immunfärbung zu Murine enterische Nervensystem Entwicklung visualisieren

Weitere Videos entdecken