Name: Live-Imaging von Nikotin induzierte Calcium Signaling und Neurotransmitterausschüttung Zusammen Ventral Hippocampus Axone (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Erfahren Sie Live-Imaging von prä- und postsynaptischen Mechanismen im ventralen Hippocampus-Nucleus-accumbens-Schaltkreis. Diese Methode ermöglicht die Analyse von nikotininduziertem Calcium-Signaling und Neurotransmitterfreisetzung in Echtzeit.

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Wir danken Yehui Qin und Mallory Myers für die technische Unterstützung. Wir danken auch Dr. Sigismund Huck für die Bereitstellung des Anti-α4-ECD-Antikörpers. Diese Arbeit wird durch Zuschüsse der National Institutes of Health unterstützt, die an L. W. R. NS22061 wurden.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt (NIH Publications No. 80-23, überarbeitet 2012) und Studien wurden von Institutional Animal Care genehmigt und Verwenden für Forschung Ausschüsse at Stony Brook University (# 1618 und # 1792). 1. vHipp-NACC Synaptic Co-Kulturen <ol><li> Sacrifice Mäuse (postnatalen Tag 0-3, aus Wildtyp (WT) oder α7 nAChR transgene Mauslinie) mit CO 2. Enthaupten jeder Welpe und speichern Sie das Heck in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen für post facto Genotypisierung. Führen Sie folgende Schritte in einem sterilisierten Kapuze. </li><li> Entfernen Sie die Oberseite des Schädels mit Schere und Pinzette, um das gesamte Gehirn aus. Beginnend an der Verbindungsstelle, wo die zerebralen Kortex Teil voneinander kaudal, erhalten einen Frontalschnitt, der die hinteren Kortex einschließlich der vHipp 5,21 unter einem Binokular enthält. </li><li> Sezieren vHipp Gewebestreifen, die die CA1-Region subiculum gemäß einem entwickelnden Mausgehirnatlas 22 (Figur 1A). Übertragung auf eine 35 mm Kulturschale mit kaltem Kulturmedien (4 ° C), in kleine dünne Scheiben (ca. 100 &amp; mgr; m × 100 &amp; mgr; m microslices) geschnitten. </li><li> Pre-inkubiere 12 mm Poly-D-Lysin / Laminin beschichteten Deckgläschen Inneren 24-Well-Gewebekulturplatten mit Kulturmedien (~ 500 &amp; mgr; l) für mindestens 30 min im Brutschrank bei 37 ° C. Entfernen Sie das Medium vor dem Ausplattieren microslices. </li><li> Platte mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette in der Mitte des Deckglases mit einer minimalen Menge an Medium (~ 50 &amp; mgr; l, enthaltend ~ 20 Stücke microslices), um die Befestigung der Explantate erleichtern. Platte vHipp microslices aus einer tierischen Ursprung (entweder der + / + oder - / - Genotyp der transgenen α7 Linie) für jedes Deckglas. </li><li> Nachdem die Explantate auf das Deckglas absetzen, sanft fügen Sie zusätzliche Medien (~ 100 &amp; mgr; l) von the Wand, so dass der Pegel des Mediums hoch genug ist, um die Explantate am Umfang vollständig abdecken, nicht aber die in der Mitte des Deckglases. </li><li> Nach einer O / N Inkubation in 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator, zerstreuen NACC Neuronen von embryonalen Tagen 18 bis postnatalen Tag 1 WT-Mäusen und zu den Explantaten. <ol><li> Sezieren NACC Gewebe gemäß einer entwickelnden Mausgehirnatlas 20 (1B). </li><li> In kleine Stücke geschnitten (ca. 500 &amp; mgr; m × 500 &amp; mgr; m microslices) aufnehmen und in einem 15-ml-Tube. </li><li> Behandlung mit 0,25% Trypsin (2 ml) für 15 min bei 37 ° C. Dreimal mit kaltem Waschmedien (5 ml, 4 ° C), gefolgt von einer Wäsche in kaltem Kulturmedium (5 ml, 4 ° C) Waschgewebebrocken. Erlauben Suspension für 5 Minuten in jedem Waschschritt ausruhen und dann abgießen Stand vorsichtig. </li><li> Dissoziieren Zellen durch vorsichtiges Zerreiben in 2 ml Kulturmedium mit einem leicht feuerpolierten Pasteur-Pipette. </li><li> Transfer Zellsuspension in einen anderen 15 ml-Tube und Zentrifugation bei 2.000 x rpm für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Zellen in Kulturmedium bei 1 ml pro 6 Welpen. Zerstreuen Zellen durch vorsichtiges Pipettieren in Medien mehrmals mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette. </li><li> Zugabe von 0,25 ml dispergiert NACC-Zellen zu jedem Deckglas mit vHipp Explantate. </li><li> Aufrechtzuerhalten, die Kulturen in einer befeuchteten 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. Zeigen Kulturplatten auf gedämpft steriler Gaze-Pads, um mechanisch zu stabilisieren und zu pflegen Feuchtigkeit, Synapsenbildung zu erleichtern. </li></ol></li></ol> 2. Immunocytochemistry <ol><li> Fix Kulturen (5 - 7 Tage die in vitro) in 4% Paraformaldehyd / 4% Saccharose / PBS (~ 500 &amp; mgr; l pro Deckglas, 20 min, RT). </li><li> Permeabilisieren Kulturen mit 0,25% Triton X-100 / PBS (~ 500 &amp; mgr; l pro Deckglas, 5 min, RT). </li><li> Block Kulturen mit 10% normalem Eselserum in PBS (~ 500 &amp; mgr; l pro Deckglas, 30 min, RT) vor Antibody Färbung. Inkubieren mit primären Antikörpern O / N bei 4 ° C. Verwenden Sie die folgenden primären Antikörpern: anti nAChRs (α 4 -ECD 1: 500; anti-α-Untereinheiten 5, 1: 500), anti-vesikulären Glutamattransporter 1 (1: 250), anti-GAD65 (1: 100). </li><li> Waschen Sie primäre Antikörper mit PBS (3 mal / ~ 500 ul pro Deckglas, 5 min) und dann inkubieren Kulturen in Sekundärantikörper Alexa 488 konjugierten (~ 500 &amp; mgr; l pro Deckglas, 1: 500) oder Alexa 594 (~ 500 &amp; mgr; l pro Deckglas , 1: 500) für 1 h bei 37 ° C. </li><li> Vor der Fixierung für Etikettieroberfläche α7 * nAChRs für 45 min bei 37 ° C: Kulturen in αBgTx Alexa 594 konjugiert inkubieren (1000 in Kulturmedien ~ 500 ul pro Deckglas 1). </li><li> Halterung und Dichtung Deckgläser. </li><li> Machen Sie Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop mit Plan-Apochromat Objektive (20x mit 0,8 NA oder 63X Öl mit 1,4 NA) ausgestattet und einer CCD-Kamera. </li></ol> 3. FM1-43 Based Vesicular Fusion <ol><li> Pflegen Kulturen (5 - 7 Tage die in vitro) in einem bildgebenden Kammer, montieren Sie die Kammer auf Spinning Platten konfokalen Mikroskop. Kontinuierlich durchströmen (1 ml / min) mit HBS-Cocktail bei RT. </li><li> Stoppen Perfusion und Last Kulturen mit 10 &amp; mgr; M in 56 mM FM1-43 K + ACSF (~ 500 &amp; mgr; l) für 90 sec (Färbung), waschen externen Farbstoff entfernt 15 Minuten mit Ca 2+ frei HBS, enthaltend ADVASEP-7 (0,1 mm) membrangebundene FM1-43 abzufangen. </li><li> Stimulieren die Kulturen mit 56 mM K + ACSF (~ 500 &amp; mgr; l) ohne FM1-43 für 120 sec (Entfärben), laden Kulturen mit FM1-43 unter den gleichen Bedingungen und nachwaschen mit Ca 2+ frei HBS, enthaltend ADVASEP-7 15 min. </li><li> Erwerben FM1-43 Fluoreszenzbilder mit sich drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop mit einem Plan-Apochromat Objektiv (60X Wasser mit 1,4 NA, Anregung 488 nm, Emission 530 nm) und die Aufnahmen mit einer CCD-Kamera ausgestattet. </li><li> Sammeln Basis FM1-43 Fluoreszenzbilder (alle 2 s 1 min) Als Pre-Nikotin-Steuerung; gelten Nikotin (1 uM) durch schnelle Durchblutung (2 ml / min) für 1 min, und dann waschen Nikotin mit HBS-Cocktail. Halten Sie Capture-Zeitraffer-Bilder vor, während und nach dem Nikotin-Anwendung alle 2 Sek 5 Min. </li><li> Quantifizieren FM1-43 Fluoreszenzintensität vor (F-Färbung) und nach (F Entfärben) Nikotin-Anwendung an jedem synaptischen bouton. </li><li> Berechnen Gesamtmenge an freisetzbarem FM1-43 Fluoreszenz entlang vHipp Axone durch Quantifizierung der Differenz FM1-43 Fluoreszenzintensität vor und nach dem Nikotin-Anwendung (&amp; Dgr; F = F Färbung -F Entfärbung). Analyse Fraktion von Fluoreszenzintensitätsabnahme nach Nikotin mit der folgenden Gleichung: F = &amp; Dgr; F% Abnahme / F-Färbung. </li></ol> 4. Calcium Imaging <ol><li> (- 7 Tage in vitro 5) schnell mit normalen HBS, dann laden Kulturen mit 5 &amp; mgr; M Fluo-4 Ca 2+ Anzeige (Kulturen SpülenAM-Ester) und 0,02% Pluronic F-127 in HBS (2 ml) für 30 min bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Waschen Sie Fluo-4-Lösung mit HBS (3-mal / 5 min). Zurück Kulturen Inkubator (37 ° C / 5% CO 2) für mindestens 30 min. </li><li> Aufrechtzuerhalten Kulturen in derselben Abbildungskammer und gleichen Bedingungen wie in FM1-43 basierend Vesikelfusion Abschnitt beschrieben (siehe Schritt 3.1). </li><li> Sammeln Fluo-4 Fluoreszenzbilder der axonalen Projektionen von den vHipp Mikro-Scheiben mit einem Plan-Apochromat Objektiv (60X Wasser mit 1,4 NA, Anregung 488 nm, Emission 530 nm) und einer CCD-Kamera. </li><li> Sammeln Basis Fluo-4 Fluoreszenzbilder (alle 10 s für 2 min) als vorge Nikotin Steuer gelten Nikotin (1 uM) durch rasche Perfusion (2 ml / min) für 1 min, und dann waschen Nikotin mit HBS-Cocktail. Halten Sie Capture-Zeitraffer-Bilder vor, während und nach dem Nikotin-Anwendung alle 10 Sek 30 Min. </li><li> Speichern Sie alle Bilder der Ausgangs Fluo-4 Fluoreszenz-Aufnahmen, Export als eine Reihe vonTIFF-Format Bilder für die weitere Analyse. </li><li> Sammeln Sie die integrierte Intensität der Fluo-4 Fluoreszenz entlang vHipp Axone vor und nach Nikotin-Anwendung. </li><li> Normalisieren integrierten Fluoreszenzintensität mit der folgenden Gleichung: &amp; Dgr; F / F 0 = (FF 0) / F 0 ist, wobei F 0 die hintergrundkorrigierten vorge Nikotin integrierten Fluoreszenzintensität und F ist die integrierte Fluoreszenzintensität entlang vHipp Axone zu jedem Zeitpunkt nach Nikotin-Anwendung. Zu analysieren und zu plotten normalisierte integrierte Fluoreszenzintensität. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das Co-Kulturpräparat beschrieben re-capitulates ventralen Hippocampus-accumbens-Schaltungen in vitro. Diese Zubereitung ermöglicht relativ einfache und sichere Überprüfung der räumlichen und zeitlichen Verläufe von denen die Aktivierung des präsynaptischen nAChRs ELICIT verbesserte glutamaterge Transmission 5, 21. Co-Kulturen werden als das Wachstum der verschiedenen spezifischen Zelltypen in eine Schüssel, die physiologischen Bedingungen in vitro zur Verfügung ...

Cholinergen Modulation Schaltung Erregbarkeit trägt zur grundlegenden Aspekte des Erkennens und verändert cholinergen Modulation ist eine Funktion von neurodegenerativer und neuropsychiatrischen Störungen, einschließlich Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Schizophrenie und Sucht 1-4. Eine etablierte Mechanismus der cholinergen Erleichterung der synaptischen Übertragung im ZNS ist über eine direkte Aktivierung von nAChR in präsynaptischen Websites lokalisiert. Aktivierung dieser präsynaptischen Rezeptoren führt zur intrazellulären Ca 2+ ([Ca 2+] i) in präsynaptischen Terminals erhöht - sowohl direkt, aufgrund der relativ hohen Calcium Leitfähigkeit bestimmter nAChR-Subtypen, und indirekt über die intrazellulären Signalkaskaden 5, wodurch die Freisetzung von Neurotransmittern. In der Tat hat die Aktivierung der präsynaptischen nAChRs mit Veränderungen in der Freisetzung von einer Vielzahl von Neurotransmittern wie Glutamat, GABA, Acetylcholin, in Verbindung gebracht worden einnd Dopamin 6-10. Obwohl dieser Prozess wurde indirekt mit elektrophysiologischen Methoden an verschiedenen Synapsen untersucht, optische Reportern von [Ca 2+] i und synaptischen Vesikel-Recycling ermöglichen mehr direkte und zeitlich präzise Messung der präsynaptischen Phänomene. Präsynaptischen Lokalisation nAChRs überzeugend mit direktem Immunogold-Markierung von nAChR in der elektronenmikroskopische (EM) Ebene 11,12 demonstriert. Mehrere andere Verfahren wurden ebenfalls verwendet, um die Lokalisierung nAChR indirekt zu adressieren, einschließlich Erfassen Standorte nAChRs subunit- fluoreszierendes Protein-Chimären in kultivierten Neuronen 13,14, elektrophysiologischen Aufzeichnung von nAChR Ströme in synaptische Anschlüssen 15,16, Überwachung Nikotin induzierte Veränderungen von [Ca 2+] i in synaptischen Nervenendigungen durch Live Cell Imaging 17 und indirekte Überwachung der Freisetzung von Neurotransmittern im synaptischen Terminal durchLive Cell Imaging-Techniken mit Fluoreszenzindikatoren, einschließlich Exozytose synaptischer Vesikel durch styryl amphipathischen FM Farbstoffe (FM1-43 und FM4-64) und / oder synapto-pHluorin und durch spezifische fluoreszierende Neurotransmitter Reportern, wie CNiFERs für ACh und iGluSnFr für Glutamat angesehen 18-20. Insgesamt sind diese aktuelle Ansätze zur Identifizierung von präsynaptischen Lokalisierung nAChRs sind kompliziert und erfordern spezielle Systeme und Techniken, um eine zuverlässige Identifizierung und physiologische Überwachung der präsynaptischen Aktivität zu ermöglichen. Hier beschreiben wir Protokolle und Ausrüstung für die in vitro Co-Kultursystem eines ventralen Hippocampus (vHipp) - Nucleus accumbens (NAKR) Schaltung, die einen direkten Zugang zu identifizieren und zu analysieren, sowohl vor als auch postsynaptischen Komponenten der synaptischen Übertragung bietet. Wir zeigen Beispiele von präsynaptischen Lokalisierung nAChRs und Live Cell Imaging von nAChR vermittelte Ca 2+ Signalisierung und die Freisetzung von Neurotransmittern along vHipp Axone. Eine natürliche (und unkompliziert) Erweiterung der hier vorgestellten Protokoll ist die Herstellung von Pre- und Post-synaptische Kontakte von Nervenzellen aus unterschiedlichen Genotypen besteht. Auf diese Weise wird der Beitrag eines bestimmten Genprodukts an der Vor- und / oder postsynaptische Mechanismen der Modulation kann direkt bewertet werden.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Nährmedien (50 ml)</td></tr><tr><td>Neurobasal&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10888022</td><td>48 ml</td></tr><tr><td>B-27 Nahrungsergänzungsmittel</td><td>GIBCO</td><td>0080085-SA</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>GIBCO</td><td>10908-010</td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>GlutaMAX Nahrungsergänzungsmittel</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>Neurotropher Faktor des Gehirns (BDNF)</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td colspan="4">2. Waschmedien (HBSS, 100 ml)</td></tr><tr><td>HBSS, kein Calcium, kein Magnesium, kein Phenolrot</td><td>GIBCO</td><td>14175-095</td><td>99 ml</td></tr><tr><td>HEPES ( 1M)</td><td>GIBCO</td><td>15630-130</td><td>1 ml</td></tr><tr><td colspan="4">3. HEPES gepufferte Kochsalzlösung&nbsp; (HBS)&nbsp; &nbsp; pH=7,3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&nbsp;</td><td>ca. 135 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333&nbsp;</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>CaCl2,Sigma</td><td></td> <td>C1016&nbsp;</td><td>ca. 2 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375&nbsp;</td><td>ca. 10 mM</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>ca. 10 mM</td></tr><tr><td colspan="4">4. HBS Cocktail für Live-Bildgebung pH=7,3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&nbsp;</td><td>ca. 135 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333&nbsp;</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>CaCl2,Sigma</td><td></td> <td>C1016&nbsp;</td><td>ca. 2 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375&nbsp;</td><td>ca. 10 mM</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>ca. 10 mM</td></tr><tr><td>Tetrodotoxin&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>1078</td><td>2 &micro; M</td></tr><tr><td>bicuculline</td><td>Tocris</td><td>131</td><td>10 &micro; M</td></tr><tr><td>D-AP-5</td><td>Tocris</td><td>105</td><td>50 &micro; M</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris</td><td>1045</td><td>20 & Mikro M</td></tr><tr><td>LY341495</td><td>Tocris</td><td>1209</td><td>10 &micro; M</td></tr><tr><td colspan="4">5. Frei von Kalzium&nbsp; HBS&nbsp; &nbsp; pH=7,3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&nbsp;</td><td>ca. 135 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333&nbsp;</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375&nbsp;</td><td>ca. 10 mM</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>ca. 10 mM</td></tr><tr><td colspan="4">6. 56 mM Kalium ACSF pH=7,4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>119 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>56 mM</td></tr><tr><td>MgSO4,7H</td><td>Sigma</td><td>M1880</td><td>1,3 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td>2,5 mM</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>26,2 mM</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>ca. 10 mM</td></tr></tbody></table>

live-imaging von nikotin induzierte calcium signaling und neurotransmitterausschüttung zusammen ventral hippocampus axone

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Anhaltende Verstärkung der axonalen Signalübertragung und erhöhte Neurotransmitterfreisetzung durch die Aktivierung präsynaptischer nikotinischer Acetylcholinrezeptoren (nAChRs) ist ein wichtiger Mechanismus für die Neuromodulation durch Acetylcholin (ACh). Die Schwierigkeit des Zugangs zur Untersuchung der Signalmechanismen in intakten Axonen und an Nervenendigungen sowohl in vitro als auch in vivo hat die Fortschritte bei der Untersuchung der präsynaptischen Komponenten der synaptischen Plastizität begrenzt. Hier stellen wir eine gen-chimäre Präparation des ventralen Hippocampus (vHipp)-accumbens (nAcc) Schaltkreises in vitro vor, die eine direkte Live-Bildgebung ermöglicht, um sowohl die prä- als auch die postsynaptischen Komponenten der Übertragung zu analysieren und gleichzeitig das genetische Profil der prä- und postsynaptischen Neuronen selektiv zu variieren. Wir zeigen, dass Projektionen von vHipp-Mikroschnitten als präsynaptischer axonaler Input mehrere, zuverlässige glutamaterge Synapsen mit postsynaptischen Zielen, den dispergierten Neuronen von nAcc, bilden. Die präsynaptische Lokalisation verschiedener Subtypen von nAChRs wird detektiert und die präsynaptische nikotinische Signalübertragung wird durch gleichzeitige elektrophysiologische Aufzeichnung und Live-Zell-Bildgebung überwacht. Dieses Präparat bietet auch einen informativen Ansatz zur Untersuchung der prä- und postsynaptischen Mechanismen der glutamatergen synaptischen Plastizität in vitro.

Die eingesetzte Zubereitung umfasst chimäre Gen Kokulturen vHipp-NACC Schaltungen in vitro. Projektionen aus vHipp microslices ausgeht, als präsynaptischen Axon Eingang können synaptische Kontakte mit postsynaptischen Ziele, die verteilt Neuronen aus NACC machen. Nikotin induzierte eine anhaltende (≥ 30 min) Erleichterung der glutamatergen Übertragung von NACC Neuronen durch vHipp innerviert Axone 21 und verlängert Calcium-Signal entlang vHipp Axone 5 über präsynaptischen α7 nAChR *. <...

Wir haben ein gen-chimäres Präparat des ventralen Hippocampus-Accumbens-Schaltkreises in vitro entwickelt, das eine direkte Live-Bildgebung ermöglicht, um präsynaptische Mechanismen der durch nikotinische Acetylcholinrezeptoren (nAChRs) vermittelten synaptischen Übertragung zu analysieren. Dieses Präparat bietet auch einen informativen Ansatz zur Untersuchung der prä- und postsynaptischen Mechanismen der synaptischen Plastizität.

Live-Imaging von Nikotin induzierte Calcium Signaling und Neurotransmitterausschüttung Zusammen Ventral Hippocampus Axone

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine genchimäre Präparation der ventralen Hippocampus-Akkumbens-Schaltung in vitro herzustellen, die eine direkte Live-Bildgebung ermöglicht, um prä- und postsynaptische Komponenten der synaptischen Übertragung zu identifizieren und zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Streifen des ventralen Hippocampusgewebes, die die CA1-CIC-Region enthalten, präpariert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die ventralen Hippocampus-Streifen in kleine, dünne Schnitte zu zerschneiden und diese Mikroschnitte über Nacht in die Mitte der Deckgläser innerhalb einer 24-Loch-Gewebekulturplatte zu geben.Als Nächstes wird der Nucleus accumbens aus dem Gehirngewebe isoliert. Im letzten Schritt werden die Nucleus-accumbens-Streifen mit Trypsin in einzelne Neuronen dissoziiert, und die Nucleus-accumbens-Neuronen werden auf den Deckglasplättchen mit ventralen hippocampalen Implantaten kultiviert und fünf bis sieben Tage lang inkubiert. Abschließend erfolgt die Untersuchung der präsynaptischen Lokalisation nikotinischer Acetylcholinrezeptoren sowie der nikotinischen Acetylcholinrezeptor-vermittelten Kalziumsignalisierung und Neurotransmitterfreisetzung.Längs verlaufende axonale Fortsätze des ventralen Hippocampus können mithilfe von Spinning-Disk-Konfokalmikroskopie in lebenden Zellen identifiziert und überwacht werden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Mikroschnitt-Dissociations-Neuronenkoinkubationspräparation eine einfache Erkennung der präsynaptischen Exone und postsynaptischen Zielstrukturen ermöglicht. In vitro rekonstruiert die Koinkubationspräparation die Verbindung vom ventralen Hippocampus zum Nucleus accumbens in vitro.Dies ermöglicht die direkte Live-Bildgebung entweder oder beider synaptischer Kompartimente, des prä- und postsynaptischen. Diese in-vitro-synaptische Präparation erlaubt eine hochauflösende Bildgebung der räumlichen und zeitlichen Effekte der Aktivierung präsynaptischer Rezeptoren auf die glutamaterge synaptische Übertragung. Dadurch können Informationen über prä- und postsynaptische Mechanismen gewonnen werden, die zur glutamatergen synaptischen Plastizität beitragen, noch vor der Gewebesammlung.Präinkubieren Sie 12 Millimeter große, mit Poly-D-Lysin und Laminin beschichtete Glas-Deckgläser in 24-Loch-Gewebekulturplatten mit jeweils 500 Mikroliter Kulturmedium bei 37 Grad Celsius für mindestens 30 Minuten. Anschließend das Medium entfernen, bevor die Mikroschnitte zur Gewebekultur aufgebracht werden. Entfernen Sie die Schädeldecke, um unter einem Stereomikroskop das gesamte Gehirn jedes geopferten Welpen freizulegen.Ausgehend von der Stelle, an der sich die Großhirnrinde voneinander trennt, gewinnen Sie einen koronaren Schnitt, der die hinteren Kortices einschließlich der ventralen Hippocampi enth&auml;lt. Danach dissezieren Sie das ventrale Hippocampusgewebe, das die CA1-Bereiche enth&auml;lt. Anschlie&szlig;end &uuml;berf&uuml;hren Sie das Gewebe in eine 35-Millimeter-Kulturschale, die kaltes Kulturmedium enth&auml;lt.Schneiden Sie die Gewebe anschließend weiter in kleine, dünne Scheiben. Plazieren Sie die Scheiben mit einer feuerpolierten Pasteurpipette in die Mitte der Deckglasoberfläche. Geben Sie 50 Mikroliter Medium dazu, um die Anheftung der X-Explantate zu erleichtern.Danach die ventralen Hippocampus-Mikroschnitte auf dem Deckglas platzieren; nachdem die Explantate sanft auf dem Deckglas abgesetzt haben, weitere 100 Mikroliter Medium entlang der Wand hinzufügen, sodass der Mediumspiegel am Rand ausreicht, um die Explantate vollständig zu bedecken, nicht jedoch die im Zentrum des Deckglases. Anschließend die Explantate über Nacht bei 5 % CO2 und 37 Grad Celsius inkubieren, bevor die Neuronen des Nucleus accumbens dispergiert werden. Nun das Gewebe des Nucleus accumbens von embryonalem Tag 18 bis zum ersten postnatalen Tag von Wildtyp-Mäusen entnehmen, in kleine Stücke schneiden und in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführen.Behandeln Sie die Gewebe mit zwei Millilitern 0,25 %iger Trypsinlösung für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Anschließend waschen Sie die Gewebe dreimal mit je fünf Millilitern Waschmedium bei 4 Grad Celsius und lassen die Suspension in jedem Waschschritt fünf Minuten ruhen. Danach waschen Sie die Gewebe in fünf Millilitern Kulturmedium bei 4 Grad Celsius.Nun werden die Zellen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren in zwei Milliliter Kulturmedium mit einer leicht angeschmolzenen Pasteurpipette dissoziiert. Anschließend wird die Zellsuspension in ein anderes 15-Milliliter-Röhrchen überführt und fünf Minuten lang bei 2000 U/min zentrifugiert. Nach fünf Minuten wird der überstehende Überstand entfernt und die Zellen in Kulturmedium resuspendiert, und zwar mit einem Milliliter pro sechs Würfe, wobei die Zellen durch mehrmaliges vorsichtiges Auf- und Abpipettieren mit einer angeschmolzenen Pasteurpipette verteilt werden.Am Ende werden 25 Milliliter der dispergierten Zellen des Nucleus accumbens auf jeden Deckglaser mit den ventralen Hippocampus-Explantaten gegeben. Die Kulturplatten auf angefeuchteten sterilen Gazetupfern platzieren, um eine mechanische Stabilisierung zu gewährleisten und die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten, was die Synapsenbildung fördert. Anschließend werden die Platten bei 5%CO2 und 37 Grad Celsius inkubiert.Überführen Sie in diesem Verfahren die Kulturen nacheinander in eine Imaging-Kammer. Befestigen Sie die Kammer am Spinning-Disk-Konfokalmikroskop. Perfundieren Sie die Probe kontinuierlich mit HBS-Cocktail bei einem Fluss von einem Milliliter pro Minute bei Raumtemperatur.Danach die Überflutung stoppen und die Kultur 90 Sekunden lang mit 10 Mikromolar FM 1-43 in 56 Millimolar Kalium-A-CSF einfärben. Anschließend die äußere Färbung 15 Minuten lang mit kalziumfreiem HBS, das 0,1 Millimolar A-D-V-A-S-E-P sieben enthält, wegwaschen. Danach die Kultur 120 Sekunden lang mit 56 Millimolar Kalium-A-CSF ohne FM 1-43 reizen.Zum Festhalten. Die Kultur erneut unter denselben Bedingungen mit FM 1 43 beladen und anschließend erneut 15 Minuten mit kalziumfreiem HBS, das A-D-V-A-S-E-P seven enthält, waschen. Anschließend die FM 1 43-Fluoreszenzbilder mit einem Spinning-Disk-Konfokalmikroskop, das mit einem Plan-Apochromat-Objektiv ausgestattet ist, aufnehmen und die Bilder mit einer CCD-Kamera erfassen.Sammeln Sie die Basis-FM-1-43-Fluoreszenzbilder alle zwei Sekunden über eine Minute als Vor-Nikotin-Kontrolle. Anschließend wenden Sie einen Mikromolar Nikotin durch schnelle Perfusionszufuhr mit zwei Millilitern pro Minute über eine Minute an, bevor Sie das Nikotin mit HBS-Cocktail abwaschen. Setzen Sie die Aufnahme der Zeitrafferbilder vor, während und nach der Nikotinanwendung alle zwei Sekunden über fünf Minuten fort.In diesem Schritt spülen Sie die Kulturen kurz mit normalem HBS ab. Anschließend beladen Sie die Kulturen mit fünf Mikromolar Fluohr Vier Kalziumindikator und 0,02 % Igepal F127 in zwei Milliliter HBS für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Danach waschen Sie die Fluohr-Vier-Lösung durch dreimaliges Spülen mit HBS aus, wobei jedes Spülen fünf Minuten dauert.Bringen Sie die Kulturen für mindestens 30 Minuten zurück in den Inkubator. Überführen Sie anschließend die Kulturen nacheinander in die Bildgebungskammer. Unter denselben Bedingungen wie bei den FM 1 43-basierten vesikulären Fusionverfahren beschrieben.Sammeln Sie die Basisfluoreszenzbilder vom Typ flu oh vier der axonalen Projektionen aus den ventralen hippocampalen Mikroschnitten als Vorläuferkontrolle vor der Nikotinanwendung. Anschließend wird eine Konzentration von einem Mikromolar Nikotin durch schnelle Perfution mit zwei Millilitern pro Minute über eine Minute zugeführt und danach mit HBS-Cocktail ausgewaschen. Setzen Sie die Aufnahme der Zeitrafferaufnahmen vor, während und nach der Nikotinanwendung alle 10 Sekunden über einen Zeitraum von 30 Minuten fort.Diese Abbildung zeigt direkt, dass die Projektionen aus ventralen hippocampalen Mikroschnitten glutamaterg sind und dass die Kontakte mit dispersen GABAergen mittelgroßen spiny Neuronen des Nucleus accumbens eingehen. Sowohl alpha-7- als auch nicht-alpha-7-nicotinische Acetylcholinrezeptoren wurden entlang der axonalen Fortsätze des ventralen Hippocampus und speziell an den Stellen gefunden, an denen die Projektionen des ventralen Hippocampus mit Neuronen des Nucleus accumbens in Kontakt treten. Es ist darauf hinzuweisen, dass die dispersen Neuronen des Nucleus accumbens keine alpha-7-nicotinischen Acetylcholinrezeptoren exprimieren, was bedeutet, dass die Rezeptorcluster an den Kontaktstellen strikt präsynaptisch lokalisiert sind.Die Zeitrafferaufnahmen der Fluo-4-Calcium-Fluoreszenz entlang ventraler hippocampaler Axone wurden mit einem 60x-Wasser-Immersionobjektiv alle 10 Sekunden über einen Zeitraum von 30 Minuten mit einem Spinning-Disk-Konfokalmikroskop aufgenommen. Die aufgezeichneten Bilder wurden in einer Pseudofarbskala dargestellt und als Video mit zwei Bildern pro Sekunde wiedergegeben. Dieses Video zeigt, dass die Applikation von Nikotin eine anhaltende Fluo-4-Calcium-Fluoreszenzaktivität entlang lebender ventraler hippocampaler Axone vom Wildtyp induziert.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, die ventralen hippocampalen Mikrostücke in einem minimalen Volumen an Medium zu platzieren und die Kulturplatten auf befeuchteten stereoskopischen Wachstumspfaden zu halten. Diese Schritte sind entscheidend für die Anheftung der Mikrostücke, das Auswachsen der Fortsätze und die Bildung der Synapsen. Diese Kokultur ermöglicht es daher, die Genotypen der präsynaptischen Eingänge unabhängig von ihren postsynaptischen Zielstrukturen zu variieren.Außerdem ermöglicht es die gezielte Expression von exogenen Genen unabhängig in jeweils einem der beiden Kompartimente. Dies bietet ein großes Potenzial, um prä- von postsynaptischen Mechanismen der synaptischen Plastizität zu unterscheiden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie verstehen, wie man genchimäre synaptische Kokulturen erzeugt, die den Schaltkreis vom ventralen Hippocampus zum Nucleus accumbens nachbilden.Anschließend sollten Sie lebende Bildgebungstechniken verwenden können, um sowohl prä- als auch postsynaptische Neuronen zu analysieren.

live-imaging-nicotine-induced-calcium-signaling-neurotransmitter

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir haben eine neue Technik zur Quantifizierung nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors Veränderungen innerhalb subzellulären Regionen spezifischen Subtypen von ZNS-Neuronen zum besseren Verständnis der Mechanismen der Nikotinabhängigkeit, indem eine Kombination von Ansätzen einschließlich fluoreszierendes Protein Markierung des Rezeptors mit dem Knock-in-Ansatz entwickelt und spektrale konfokale Bildgebung.

Spectral konfokale Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Nikotinrezeptoren in Knock-in Mäusen mit chronischer Gabe von Nikotin

Dieses Video zeigt den Prozess der Vorbereitung von ventralem Hippocampus- und Nucleus accumbens-Gewebe aus Mäusegehirnen für die Co-Kultur. Neuronen verlängern Projektionen, um synaptische Verbindungen zwischen dem ventralen Hippocampusgewebe und dem Nucleus accumbens zu bilden. Diese Methode ermöglicht es, neuronale Interaktionen zwischen diesen beiden Gehirnregionen zu untersuchen und Einblicke in Kognition, Verhalten und neurologische Störungen zu erhalten.

Co-Kultivierung des ventralen Hippocampus und des Nucleus accumbens

Dieses Video zeigt, wie die nikotinvermittelte Aktivierung von nikotinischen Acetylcholinrezeptoren im ventralen Hippocampus der Maus zu einer anhaltenden Kalziumsignalisierung entlang der Axone führt.

Bildgebung der Nikotin-induzierten Kalzium-Signalübertragung entlang ventraler Hippocampus-Axone in synaptischen Co-Kulturen

Quelle: Bancroft, E. A., et al{. Quantifizierung spontaner Ca2+ Flüsse und ihre nachgelagerten Effekte in primären Mittelhirnneuronen der Maus. J. vis. exp.  (2020) {{TAG_ 46}}Dieses Video zeigt die Echtzeit-Visualisierung des Kalziumeinstroms in ventralen Mittelhirnneuronen, die aus Mausembryonen stammen. Unter Verwendung eines viralen Vektors zur Expression eines Kalziumindikators werden die Neuronen unter einem konfokalen Mikroskop abgebildet, um Änderungen der Fluoreszenzintensität während...

Visualisierung des Kalziumeinstroms in ventralen Mittelhirnneuronen aus Mausembryonen

Quelle: Lark, A. R., et. al., In-vivo-Ansatz zur funktionellen Bildgebung des Gehirns basierend auf dem biolumineszierenden Calciumindikator GFP-Aequorin. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt die Echtzeit-Bildgebung der Kalziumdynamik mit Green fluoreszierende Protein-Aequorin-Biolumineszenz in den tiefen Hirnstrukturen von Drosophila.

Biolumineszenz-Bildgebung zur Untersuchung von Kalziumtransienten in Drosophila-Gehirnstrukturen

Dieser Artikel stellt eine Methode zur Untersuchung von Nikotinsäure Acetylcholin-Rezeptoren (nAChRs) in Maus Hirnschnitten von Nikotin uncaging. Wenn gepaart mit gleichzeitiger Patch Clamp Aufnahme und 2-Photonen-Laser-scanning-Mikroskopie, verbindet Nikotin uncaging Nikotinsäure Rezeptor-Funktion mit zellulären Morphologie, bietet ein tieferes Verständnis der cholinergen Neurobiologie.

Sondieren Nikotinsäure Acetylcholin-Rezeptor-Funktion in Maus Gehirnscheiben per Laser Flash Photolyse von Photoactivatable Nikotin

Diese Methode beschreibt eine chronische Zubereitung, die den optischen Zugang zum Hippocampus lebender Mäuse ermöglicht. Dieses Präparat kann verwendet werden, um längsinale optische Bildgebung der neuronalen strukturellen Plastizität und aktivitätsbeschworenen zellulären Plastizität über einen Zeitraum von mehreren Wochen durchzuführen.

Längs-Zwei-Photon-Bildgebung des Dorsal Hippocampal CA1 in lebenden Mäusen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, mit dem vor- und/oder postsynaptisches Kalzium im Kontext des Drosophila-Lernens und -Gedächtnisses visualisiert werden kann. In vivo Kalzium-Bildgebung mit synaptisch lokalisierten Kalziumsensoren wird mit einem klassischen olfaktorischen Konditionierungsparadigma kombiniert, so dass die synaptische Plastizität, die dieser Art des assoziativen Lernens zugrunde liegt, bestimmt werden kann.

In Vivo Optische Calcium-Bildgebung der lerninduzierten synaptischen Plastizität bei Drosophila melanogaster

Das aktuelle Protokoll demonstriert eine einfache Methode zur Rückverfolgung von ventralen Tegmentalflächen (VTA) Glutamatprojektionen auf den Hippocampus. Die Photostimulation von VTA-Glutamat-Neuronen wurde mit CA1-Aufnahmen kombiniert, um zu zeigen, wie VTA-Glutamat-Terminals die mutmaßliche pyramidale CA1-Feuerrate in vivo modulieren.

Kombinierte in vivo anatomische und funktionelle Spurensuche von ventralen Tegmentalflächen-Glutamat-Terminals im Hippocampus

Dieser Artikel zeigt die Vorbereitung eines maßgeschneiderten Bildgebungsfensters, ergänzt mit Infusionskanüle und deren Implantation in die CA1-Region des Hippocampus bei Mäusen.

Kraniotomie-Verfahren zur Visualisierung neuronaler Aktivitäten im Hippocampus von sich benehmenden Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt in vivo die GCaMP-Kalziumbildgebung von intakten Trigeminusganglien (TG)-Neuronen. Diese Beschreibung umfasst TG-Expositionsoperationen, konfokale In-vivo-Mikroskopie-Bildgebung von TG-Neuronen, Anwendung somatischer Stimuli während der mikroskopischen Bildgebung von TG-Neuronen und Analyse von in vivo GCaMP-Calcium-Bildgebungsdaten.

Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung von neuronalen Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neuronen in intakten Trigeminusganglien

Erfahren Sie Live-Imaging von prä- und postsynaptischen Mechanismen im ventralen Hippocampus-Nucleus-accumbens-Schaltkreis. Diese Methode ermöglicht die Analyse von nikotininduziertem Calcium-Signaling und Neurotransmitterfreisetzung in Echtzeit.

Live-Imaging von Nikotin induzierte Calcium Signaling und Neurotransmitterausschüttung Zusammen Ventral Hippocampus Axone

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