In Vivo Dynamics of Retinal Mikrogliaaktivierung Während Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoskopische Imaging and Cell Morphometrie in Maus Glaucoma

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Dynamik der Mikroglia in einem Mausmodell des chronischen Glaukoms durch in vivo konfokale Bildgebung der Netzhaut zu charakterisieren. Dies wird durch eine nicht-invasive monatliche konfokale Ophthalmoskopie (CSLO) zur Betrachtung der fluoreszierenden Mikroglia auf der Netzhaut und dem Sehnervenkopf erreicht. Die Live-Bildanalyse mittels schwellenwertbasierter Zell-SOMA-Segmentierung und Morpho-Quantifizierung quantifiziert Veränderungen der Zellzahl und -aktivierung der Mikrogliazellen.

Die Ergebnisse zeigen, dass die monatliche CSLO-Bildgebung bei lebenden Mäusen verwendet werden kann, um die Kinetik der Zelldichteverteilung und der morphologischen Aktivierung der Mikroglia während des frühen Fortschreitens der chronischen Neurodegeneration zu überwachen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der konfokalen Zwei-Photonen-Bildgebung des GFP-positiven Mikroglia-Mausgehirns besteht darin, dass die CSLO-Bildgebung der Netzhaut die direkte Beobachtung und Überwachung von Mikrogliazellen während des gesamten Fortschreitens neurodegenerativer Erkrankungen des Alterns im intakten Organismus ermöglicht. Ich hatte die Idee zu dieser Methode, nachdem wir exvivo gezeigt hatten, dass Mikroglia in der zentralen Bereitschaft junger DBA- bis J-Mäuse in einem Alter vor der nachweisbaren Neurodegeneration eine intensive Aktivierung und Clusterbildung zeigten.

Um zu untersuchen, ob diese frühen angeborenen Immunveränderungen, die dem nachweisbaren Glaukom vorausgingen, ihre Neurodegeneration auslösten, mussten wir einen in vivo-Ansatz zur Verfolgung von Mikrogliaveränderungen etablieren. Caesar Romero, ein Techniker meines Labors, wird das Verfahren für die Live-Bildaufnahme demonstrieren. Um den Betrieb zu starten, starten Sie das CSLO-System und geben Sie die Sitzungsinformationen ein. Bereiten Sie sich als Nächstes sicher auf das Imaging vor.

Bringen Sie ein sauberes 55-Grad-Weitfeldobjektiv an. Platzieren Sie zwei Minuten nach der Verabreichung des Anästhetikums eine Maus über die Bildgebungsplattform und erweitern Sie beide Pupillen mit meinen tatischen Tropfen. Bestätigen Sie fünf Minuten später, dass die Maus betäubt ist.

Bedecken Sie anschließend jedes Auge mit minimalem Druck mit Kontaktlinsen. Richten Sie die Maus so aus, dass das rechte Auge auf die Objektivlinse trifft und die Orbita parallel zur Linse verläuft. Das Tier muss nicht angeschnallt werden, sondern in einem konstanten Abstand zur Objektivlinse gehalten werden.

Wenn das Auge für die nächsten 10 bis 15 Minuten darauf ausgerichtet ist, bewegt sich die Maus nicht und blinzelt nicht, während ihre Augenbewegungen vom CSLO-Live-Imaging-System verfolgt werden. Beginnen Sie die Bildgebungssitzung mit einer Fundusaufnahme der inneren Netzhaut. Hierfür.

Wählen Sie den Infrarotmodus, der einer Anregungswellenlänge von 820 Nanometern entspricht. Stellen Sie dann die Laserleistung auf 100 % und die Empfindlichkeit auf 40 bis 60 % ein. Lokalisieren Sie dann mit hoher Geschwindigkeit das Auge mit dem Joystick, um das Ophthalmoskop auszurichten, und bereiten Sie sich darauf vor, eine Fundusansicht der Sehscheibe und der retinalen Gefäße zu sammeln. Untersuchen Sie die Hornhaut und die Linse auf Verletzungen oder Trübung.

Schließen Sie Augen mit Defekten oder Verletzungen, die die Bildaufnahme beeinträchtigen können, von der Studie aus. Indem Sie nun das Objektiv näher an das Auge bringen, lokalisieren Sie den Bereich des Sehnervs, der die Oberfläche des Sehnervenkopfes oder ONH ist. Zentrieren Sie dann das Bild auf dem ONH.

Die richtige Positionierung des ONH ist der Schlüssel zu einer gleichmäßigen Fokussierung und Auflösung des Bildes. Der nächste Schritt besteht darin, die inneren Ebenen der Netzhaut sowie des ONH zu visualisieren. Als Referenzfokusebene verwenden Sie die großen Blutgefäße, die sich auf der Glaskörperoberfläche der Netzhaut befinden, was 59 und 60 Dioptrien entspricht, oder noch tiefer bei 55 Dioptrien in exponierten Bereichen der Sehnervyp.

Stellen Sie als Nächstes die Bildsättigung mit dem Knopf auf dem Touchpanel ein, bis ein weißer Beleuchtungskranz den größten Teil des Fundus um die optische Scheibe herum überspannt. Wählen Sie dann die niedrigere Sättigung aus, die einen gleichmäßigen Halo rendert, der auf einen optimalen Kontrast für dieses Auge hinweist. Es kann erforderlich sein, die Kamera neu auszurichten, wenn dunkle Bereiche bestehen bleiben.

Nehmen Sie nun ein hochauflösendes Fundusbild der zentralen Netzhaut auf, indem Sie durchschnittlich 30 Bilder in Echtzeit aufnehmen, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern. Dies entspricht 4,7 Bildern pro Sekunde, die sofort normalisiert und an der gleichen Position vorbereitet werden, um ein Fluoreszenzbild der GFP-positiven Zellen aufzunehmen. Wechseln Sie im Touchscreen-Panel in den Fluoreszenzbildgebungsmodus, der den blauen Laser mit 488-Nanometer-Laseranregung und einem Barrierefiltersatz von 460 bis 490 Nanometern auswählt, und stellen Sie die Erfassung auf 100 % Laserleistung und 100 bis 125 % Empfindlichkeit ein.

Erfassen Sie nun ein bidimensionales Fluoreszenzbild des einzelnen XY-Punktes des ONH mit einem Mittelwert von 100 x Scans. Nehmen Sie als Nächstes ein Mehrpunktbild der Netzhaut um das ONH-Auswahlkomposit in der Systemsteuerung auf und schwenken Sie dann mit dem Ophthalmoskop über die Nasentemporalachse. Die Software mittelt automatisch neu gescannte Bereiche und heftet sie in Echtzeit zusammen.

Wenn die Bildqualität von Bereichen der Netzhaut nicht ausreicht, um eine Mittelwertbildung zu ermöglichen, wird der grüne Kreis, der einen zu scannenden Bereich kennzeichnet, rot. Das resultierende zusammengesetzte Bild deckt eine Fläche von bis zu 1,7 mal vier Millimetern ab. Bei der Aufnahme des zusammengesetzten Bildes ist Vorsicht geboten.

Bilder mit hoher Auflösung können verloren gehen, wenn das Objektiv zu schnell bewegt wird, bevor die Scan-Mittelwertbildung und das Bild-Stitching abgeschlossen sind. Wenn die Anästhesie nachlässt, muss die Bildgebung beendet werden, da die Maus schwer zu atmen beginnt und die Bildgebung nicht mehr praktikabel ist. Beginnen Sie mit der sequentiellen Ausrichtung der Fundusbilder für eine Zeitreihe, wobei Sie das Gefäßsystem und die Sehnervenscheibe als Orientierungspunkte verwenden.

Mit herkömmlicher Bildbearbeitungssoftware werden alle Bilder bis zur Überlappung ihrer Bilder ausgerichtet. Das obere Bild wird beim Ziehen halbtransparent. Drehen Sie dann jedes Bild in der Sequenz, bis sich die wichtigsten Blutgefäße mit dem Gefäßsystem auf dem vorherigen Bild überlappen, und speichern Sie die Anordnung zum späteren Nachschlagen.

Notieren Sie den korrigierten Winkel für jedes Bild und wenden Sie ihn auf das entsprechende Einzel-XY-Punkt-Fluoreszenzbild an. Jetzt ist es möglich, einzelne GFP-positive Mikrogliazellen zu identifizieren, die auf der zentralen Netzhaut lokalisiert sind, indem die ausgerichteten TIFF-Dateien im Fluor-Rendering geöffnet werden. Um alle Zellen zu visualisieren, füllen Sie den Bildschirm mit dem Bild, und definieren Sie die Renderansicht als zusammengesetzt orthogonal und interpoliert.

Definieren Sie dann die Eigenschaften 0,58 Gamma 255 Sättigungspunkt 255 Leuchtdichte 195 Alpha bei 1,00 Schattierung. Schließen Sie die Auswahl ab, indem Sie beide RG-Kanäle als sichtbar auswählen. Blenden Sie den B-Kanal aus, indem Sie im Rahmen der Arbeitsfläche darauf doppelklicken, um einzelne Zellen zu segmentieren.

Wählen Sie den roten Kanal aus und erhöhen Sie den Schwellenwert, indem Sie den unteren Schwellenwert erhöhen, bis die Mehrheit der Zellen mit minimaler Überlappung maskiert ist und Zellprozesse ausgeschlossen werden, während der obere Schwellenwert konstant bleibt. Speichern Sie abschließend die Datei mit maskierten Zellen mit dem Capture-Befehl. Öffnen Sie dort das Bild mit maskierten Zellen im Rastergrafik-Editor.

Kehren Sie die Graustufen für die direkte Beobachtung um und stellen Sie die Auflösung auf 300 DPI oder mehr ein. Das RGB-Bild wird als TIF-Datei gespeichert. Der nächste Schritt der Live-Bildanalyse ist die Mikroglia, also Segmentierung und Morpho zur Identifizierung von SATA für die Flächenquantifizierung.

Verwenden Sie Software, die Intensitätsmessungen und Objektzählungen basierend auf dem Schwellenwert ermöglicht. Öffnen Sie die TIFF-Datei mit segmentierten Zellen und wählen Sie die Spline-Neuskalierung für maximale Auflösung und den Rotkanal als Schwarzweiß für eine bessere Visualisierung. Kalibrieren Sie als Nächstes das Bild, indem Sie seinen horizontalen Durchmesser je nach Alter auf 1,4 bis 1,7 Millimeter definieren, um einzelne Zellen zu segmentieren.

Also MA, wenden Sie den Intensitätsschwellenwert auf den roten Kanal an. Öffnen Sie die Funktion für die Schwellenwertintensität unter dem Befehl Objektanzahl und Kontoaktualisierung. Verwenden Sie diese Funktion, um zweidimensionale Parameter für jeden Schwellenwert des Interessenbereichs, der eine einzelne Person darstellt, zu verfolgen.

Definieren Sie als Nächstes den Intensitätsschwellenwert im Intensitätshistogramm. Wählen Sie die untersten 50 bis 60 % der 255 Stufen aus und verfeinern Sie den abschließenden Schwellenwert der einzelnen Zellen. Beurteilen Sie visuell die Überlappung zwischen der Schwellenwert-Farbmaske in Blau und dem Zellen-Soma-Umfang in Grau mithilfe der Steuerelemente der binären Symbolleiste oder des Objektkatalogs.

Identifizieren Sie somale Regionen von Interesse manuell mit mehreren Zellen. Trennen Sie diese Elemente, indem Sie die interessierenden Bereiche trennen. Verwenden Sie dabei den Umschalter, um die Zellen jetzt mithilfe der Bereichsbeschränkung direkt zu visualisieren.

Mikrogliazellen als aktiviert klassifizieren. Wenn ihre Spaltbereiche größer als 50 bis 60 Quadratmikrometer sind. Klassifizieren Sie die Mikroglia als deaktiviert, wenn sie kleinere Somata haben.

Überprüfen Sie schließlich den Prozess und die Komplexität der Verzweigung in jeder aktivierten Mikrogliazelle, indem Sie die somale Maske und das Einzelpunktbild mit dem um 50 % erhöhten Kontrast überlagern. Das beschriebene Protokoll wurde verwendet, um Mikrogliazellen über einen großen Bereich der zentralen Netzhaut zu visualisieren. Bei jungen DBA-Zwei-J-Mäusen, die heterozygot waren und CX drei C 1 GFP exprimierten, ermöglichte die hohe Zellauflösung in Kombination mit Live-Bild, Schwellenwerten und morphometrischer Analyse eine automatische Segmentierung einzelner GFP-positiver Zellen, und so wurden die Zellen basierend auf der Fläche DBA zwei J-Mäuse modellieren chronisches Glaukom und wurden monatlich abgebildet, um die Entwicklung der lokalen Mikrogliose und Mikrogliaaktivierung im Alter zu überwachen, in dem die nachweisbare Neurodegeneration in Übereinstimmung mit der Variablen fortschreitet Fortschreiten der Neurodegeneration bei einzelnen Augen. Diese Analyse zeigte Veränderungen in der Aktivierung der retinalen Mikroglia und der Mikrogliose im Laufe der Zeit.

Die Analyse detektierte auch dynamische Veränderungen in der Dichte der gesamten und aktivierten Mikroglia innerhalb der einzelnen Netzhaut. Die Populationsdichte der Mikroglia war nicht an Veränderungen der GFP-exprimierenden Zelldichte gekoppelt, die mit anderen Befunden übereinstimmen. Somit könnte die CSLO-Analyse als Indikator für ein frühes Fortschreiten der Erkrankung verwendet werden.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Sättigungswerte des Fluoreszenzbildes von GFP plus Mikroglia, die Lokalisierung der inneren Netzhaut, die Reproduzierbarkeit der CSLO-Bilder der zentralen Netzhaut sowie die konsistenten zellulären Details, die auf der zentralen Netzhaut erkannt werden, entscheidend von diesem Schritt nach seiner Entwicklung zu optimieren. Dieses Live-Bildgebungsprotokoll wird in unserem Labor angewendet, um den potenziellen Zusammenhang zwischen frühen Veränderungen der Mikroglia der Netzhaut und des Sehnervenkopfes und dem späteren Fortschreiten des Glaukoms bei DBA zu JM und bei anderen Modellen der chronischen Netzhautdegeneration wirklich zu sedieren. Diese Live-Bildgebungsstrategie kann auch die Früherkennung anderer chronischer Erkrankungen ermöglichen, die ebenfalls auf die Netzhaut und den Sehnerv abzielen, um Degeneration zu verhindern, wie z. B. Multiple Sklerose, Alzheimer und Parkinson.