In Vivo Dynamics of Retinal Mikrogliaaktivierung Während Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoskopische Imaging and Cell Morphometrie in Maus Glaucoma

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Dynamik der Mikroglia in einem Mausmodell des chronischen Glaukoms mittels in-vivo-Konfokalmikroskopie der Retina zu charakterisieren. Dies wird durch eine nichtinvasive monatliche konfokale Ophthalmoskopie oder CSLO erreicht, um die fluoreszierenden Mikrogliazellen in der Retina und am Sehnervenkopf sichtbar zu machen. Die Analyse von Live-Bildern unter Verwendung einer schwellenbasierten SOMA-Segmentierung der Zellen und einer morphologischen Auswertung quantifiziert Veränderungen in der Anzahl der Mikrogliazellen und deren Aktivierung.

Die Ergebnisse zeigen, dass monatliche CSLO-Bildgebung bei lebenden Mäusen verwendet werden kann, um die Kinetik der Verteilung der Mikrogliazelldichte und der morphologischen Aktivierung während des frühen Fortschreitens einer chronischen Neurodegeneration zu überwachen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Zweiphotonen-Konfokalbildgebung von GFP-positiven Mikroglia im Maushirn besteht darin, dass die CSLO-Bildgebung der Retina eine direkte Beobachtung und Überwachung von Mikrogliazellen während des gesamten Verlaufs neurodegenerativer Erkrankungen des Alterns im intakten Organismus ermöglicht. Die Idee zu dieser Methode hatte ich erstmals, nachdem wir ex vivo gezeigt hatten, dass Mikroglia eine starke Aktivierung und Clusterbildung im zentralen Bereich junger DBA/2J-Mäuse in Altersstadien zeigten, die einer nachweisbaren Neurodegeneration vorausgingen.

Um zu untersuchen, ob diese frühen angeborenen Immunveränderungen, die einer nachweisbaren Glaukomerkrankung vorausgingen, ihre Neurodegeneration verursachten, mussten wir eine in-vivo-Methode etablieren, um mikrogliale Veränderungen verfolgen zu können. Die Demonstration des Verfahrens zur Live-Bildaufnahme wird Caesar Romero, ein Techniker in meinem Labor, durchführen. Um die Arbeiten zu beginnen, starten Sie das CSLO-System und geben Sie die Sitzungsinformationen ein. Bereiten Sie anschließend die Bildaufnahme sicher vor.

Befestigen Sie eine saubere 55-Grad-Weitwinkel-Objektivlinse. Platzieren Sie eine Maus zwei Minuten nach der Verabreichung des Anästhetikums auf der Bildgebungsplattform und weiten Sie beide Pupillen mit Mydriatika-Tropfen. Fünf Minuten später bestätigen Sie, dass die Maus anästhesiert ist.

Danach jedes Auge mit Kontaktlinsen unter geringstem Druck bedecken. Das Tier so ausrichten, dass das rechte Auge auf das Objektiv trifft und die Augenhöhle parallel zur Linse liegt. Das Tier muss nicht fixiert werden, sollte aber in konstantem Abstand zum Objektiv gehalten werden.

Während die nächsten 10 bis 15 Minuten, in denen das Auge ausgerichtet bleibt, bewegt sich die Maus nicht und blinzelt nicht, während ihre Augenbewegungen vom CSLO-Echtzeitbildgebungssystem verfolgt werden. Beginnen Sie die Bildgebungssitzung, indem Sie eine Fundusaufnahme der inneren Netzhaut aufnehmen. Hierfür.

Wählen Sie den Infrarotmodus aus, der einer Anregungswellenlänge von 820 Nanometern entspricht. Stellen Sie anschließend die Laserleistung auf 100 % und die Empfindlichkeit auf einen Wert zwischen 40 und 60 % ein. Suchen Sie dann mit hoher Geschwindigkeit mithilfe des Joysticks das Auge, indem Sie das Augenspiegelgerät ausrichten, und bereiten Sie die Aufnahme einer Fundusaufnahme der Papille und der retinalen Gefäße vor. Untersuchen Sie die Hornhaut und die Linse auf Verletzungen oder Trübungen.

Schließen Sie Augen mit Defekten oder Verletzungen, die die Bildaufnahme beeinträchtigen könnten, von der Studie aus. Bewegen Sie nun das Objektiv näher an das Auge heran und lokalisieren Sie den Bereich der Papille, also die Oberfläche des Sehnervkopfes oder ONH. Zentrieren Sie anschließend das Bild auf der ONH.

Die korrekte Positionierung des Sehnervenaustritts ist entscheidend, um eine gleichmäßige Fokussierung und Lichtemission über das gesamte Bild zu erzielen. Im nächsten Schritt werden die inneren Ebenen der Retina sowie der Sehnervenaustritt sichtbar gemacht. Als Referenz-Fokusebene dienen die großen Blutgefäße an der vitrealen Oberfläche der Retina, die 59 und 60 Dioptrien entsprechen, oder noch tiefere Ebenen bei 55 Dioptrien in ausgehöhlten Bereichen der Sehnervpapille.

Passen Sie anschließend die Bildsättigung mithilfe des Drehreglers auf dem Touch-Panel so an, dass ein weißer Beleuchtungshof den größten Teil des Fundus um die Papille herum umschließt. Wählen Sie dann die niedrigere Sättigung, die einen gleichmäßigen Hof anzeigt, der auf einen optimalen Kontrast für dieses Auge hinweist. Falls dunkle Bereiche bestehen bleiben, kann es notwendig sein, die Kamera erneut auszurichten.

Sammeln Sie nun ein hochauflösendes Fundusbild der zentralen Netzhaut, indem Sie 30 in Echtzeit aufgenommene Einzelbilder mitteln, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern. Dies entspricht 4,7 Bildern pro Sekunde, die unmittelbar normalisiert und an derselben Position vorbereitet werden, um ein Fluoreszenzbild der GFP-positiven Zellen aufzuzeichnen. Wechseln Sie im Touchscreen-Panel in den Fluoreszenz-Aufnahmemodus, wodurch der blaue Laser mit einer Anregung von 488 Nanometern und ein Sperrfilter im Bereich von 460 bis 490 Nanometern ausgewählt wird, und stellen Sie die Aufnahme auf 100 % Laserleistung und 100 bis 125 % Empfindlichkeit ein.

Sammeln Sie nun ein einzelnes zweidimensionales Fluoreszenzbild im XY-Punkt des ONH, wobei 100 x-Scans gemittelt werden. Erfassen Sie anschließend ein Mehrpunktbild der Netzhaut um das ONH herum, wählen Sie im Bedienfeld „Komposit“ aus und bewegen Sie dann das Augenspiegel entlang der nasalen und temporalen Achse. Die Software mittelt neu gescannte Bereiche automatisch und fügt sie in Echtzeit zusammen.

Wenn die Bildqualität von Bereichen der Netzhaut unzureichend ist, um eine Mittelung zu ermöglichen, wird der grüne Kreis, der einen zu scannenden Bereich kennzeichnet, rot. Das resultierende Zusammengesetzte Bild umfasst einen Bereich von bis zu 1,7 bei vier Millimetern. Während der Aufnahme des zusammengesetzten Bildes ist Vorsicht geboten.

Bilder mit hoher Auflösung können verloren gehen, wenn das Objektiv zu schnell bewegt wird, bevor die Scan-Averaging- und Bildnahtung abgeschlossen ist. Wenn die Anästhesie nachlässt, muss die Bildaufnahmesitzung beendet werden, da die Maus beginnt, schwer zu atmen, und die Bildgebung damit unpraktikabel wird. Beginnen Sie damit, die Fundusbilder einer Zeitreihe nacheinander anhand der Gefäße und der Aderhautpapille als Orientierungspunkte auszurichten.

Stellen Sie mithilfe herkömmlicher Bildbearbeitungssoftware alle Bilder so aus, dass ihre O hs übereinanderliegen. Das obere Bild wird während des Ziehens halbtransparent angezeigt. Drehen Sie anschließend jedes Bild in der Sequenz, bis seine Hauptblutgefäße mit der Gefäßstruktur des vorherigen Bildes übereinstimmen, und speichern Sie die Anordnung für zukünftige Referenzen.

Notieren Sie den korrigierten Winkel für jedes Bild und wenden Sie ihn auf das entsprechende einzelne XY-Punkt-Fluoreszenzbild an. Nun ist es möglich, einzelne GFP-positive Mikrogliazellen, die in der zentralen Netzhaut lokalisiert sind, zu identifizieren, indem die ausgerichteten TIFF-Dateien in Fluor render geöffnet werden. Um alle Zellen sichtbar zu machen, füllen Sie den Bildschirm mit dem Bild und definieren Sie die Renderansicht als zusammengesetzte orthogonale und interpolierte Darstellung.

Danach die Eigenschaften 0,58 Gamma, 255 Sättigungspunkt, 255 Helligkeit, 195 Alpha bei 1,00 Schattierung definieren. Beenden Sie die Auswahl, indem Sie beide RG-Kanäle als sichtbar wählen. Verbergen Sie den B-Kanal, indem Sie im Arbeitsbereichsfenster darauf doppelklicken, um einzelne Zellen zu segmentieren.

Wählen Sie den roten Kanal aus und setzen Sie den Schwellenwert, indem Sie den niedrigen Schwellenwert erhöhen, bis der Großteil der Zellen mit minimalem Überlapp maskiert ist und Zellfortsätze ausgeschlossen sind, während Sie den hohen Schwellenwert konstant halten. Speichern Sie abschließend die Datei mit den maskierten Zellen mithilfe des Capture-Befehls. Öffnen Sie das Bild mit den maskierten Zellen anschließend im Rastergrafikeditor.

Stellen Sie die Graustufen invertiert für die direkte Beobachtung dar und passen Sie die Auflösung auf 300 DPI oder höher an. Das RGB-Bild wird als TIF-Datei gespeichert. Der nächste Schritt der Live-Bildanalyse betrifft die Mikroglia, sodass eine Segmentierung und morphologische Analyse durchgeführt wird, um SATA zur Flächenquantifizierung zu identifizieren.

Verwenden Sie eine Software, die Intensitätsmessungen und Objektzählungen basierend auf einer Schwellenwertmethode ermöglicht. Öffnen Sie die TIFF-Datei mit segmentierten Zellen und wählen Sie die Spline-Neuskalierung für maximale Auflösung sowie den roten Kanal in Schwarzweiß zur besseren Visualisierung. Kalibrieren Sie anschließend das Bild, indem Sie den horizontalen Durchmesser je nach Alter auf 1,4 bis 1,7 Millimeter festlegen, um einzelne Zellen zu segmentieren.

Wenden Sie also die Intensitätsschwellenbildung auf den roten Kanal an. Öffnen Sie die Schwellenintensitätsfunktion unter dem Befehl Objektzählung und Aktualisierung der Erfassung. Nutzen Sie diese Funktion, um bidimensionale Parameter für jede Schwelle des interessierenden Bereichs, die eine Einzelperson darstellt, zu verfolgen.

Definieren Sie als Nächstes den Intensitätsschwellenwert im Intensitätshistogramm. Wählen Sie die unteren 50 bis 60 % der 255 Stufen aus und verfeinern Sie den endgültigen Schwellenwert für die einzelnen Zellen. Bewerten Sie visuell die Überlappung zwischen der blauen Farbmaske für den Schwellenwert und der grauen Umrandung des Zellsomas mithilfe der Steuerelemente der Binärsymbolleiste oder des Objektkatalogs.

Manuell somatische Regionen von Interesse mit mehreren Zellen identifizieren. Trennen Sie diese Elemente, indem Sie die Regionen von Interesse separieren. Verwenden Sie dabei die Umschaltfunktion, um die Zellen mithilfe der Bereichsbeschränkung direkt zu visualisieren.

Klassifizieren Sie Mikrogliazellen als aktiviert, wenn ihre Soma-Areale größer als 50 bis 60 Quadratmikrometer sind. Klassifizieren Sie die Mikroglia als deaktiviert, wenn sie kleinere Somata aufweisen.

Schließlich den Prozess verifizieren und die Verzweigungskomplexität in jeder aktivierte Mikrogliazelle überprüfen, indem die Somamaskierung und das einzelne XY-Punktbild mit um 50 % erhöhtem Kontrast überlagert werden. Das beschriebene Protokoll wurde verwendet, um Mikrogliazellen über einen großen Bereich der zentralen Netzhaut sichtbar zu machen. Bei jungen DBA/2J-Mäusen, die heterozygot CX3CR1-GFP exprimieren, ermöglichte die hohe Zellauflösung in Kombination mit Live-Bildern, Schwellenwertbestimmung und morphometrischer Analyse die automatische Segmentierung einzelner GFP-positiver Zellen, sodass die Zellen basierend auf der Fläche differenziert werden konnten. Das DBA/2J-Mausmodell zeigt ein chronisches Glaukom und wurde monatlich abgebildet, um die Entwicklung lokaler Mikroglion und Mikroglia-Aktivierung in Altersstadien vor nachweisbarer Neurodegeneration zu überwachen, was mit dem variablen Fortschreiten der Neurodegeneration in einzelnen Augen übereinstimmt. Diese Analyse zeigte zeitabhängige Veränderungen in der Aktivierung der Netzhaut-Mikroglia und der Mikroglion.

Die Analyse detektierte zudem dynamische Veränderungen in der Dichte von gesamt- und aktivierten Mikrogliazellen innerhalb einzelner Netzhäute. Die Populationsdichte der Mikrogliazellen war nicht mit Veränderungen der Dichte GFP-exprimierender Zellen gekoppelt, was mit anderen Befunden übereinstimmt. Somit könnte die CSLO-Analyse als Indikator für einen frühen Krankheitsverlauf dienen.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Sättigungsstufen des fluoreszierenden Bildes von GFP plus Mikroglia, lokalisiert in der inneren Netzhaut, sorgfältig zu optimieren, da die Reproduzierbarkeit der CSLO-Bilder der zentralen Netzhaut sowie die konsistente Auflösung zellulärer Details über die gesamte zentrale Netzhaut hinweg entscheidend von diesem Schritt nach der Entwicklung abhängen. Dieses Live-Imaging-Protokoll wird in unserem Labor angewandt und könnte tatsächlich den potenziellen Zusammenhang zwischen frühen Veränderungen der Mikroglia in der Netzhaut und im Bereich des Sehnervkopfs und dem späteren Fortschreiten des Glaukoms bei DBA/2J-Mäusen sowie in anderen Modellen chronischer Netzhautdegeneration aufzeigen. Diese Live-Imaging-Strategie könnte zudem eine frühe Erkennung anderer chronischer Erkrankungen ermöglichen, die ebenfalls die Netzhaut und den Sehnerv zum degenerativen Ziel haben, wie beispielsweise multiple Sklerose, Alzheimer-Krankheit und Parkinson-Krankheit.