Maus Naive CD4 + T-Zell-Isolierung und In-vitro- Differenzierung in T-Zell-Populationen
16. April 2015
Naive CD4+ T-Zellen polarisieren in verschiedene Untergruppen, abhängig von der Umgebung zum Zeitpunkt der Aktivierung. Die Differenzierung naiver CD4+ T-Zellen zu verschiedenen Effektor-Untergruppen kann in vitro durch die Zugabe von T-Zell-Rezeptor-Stimuli und spezifischen Zytokinsignalen erreicht werden.
Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens besteht darin, naive Zöliakie-4-positive T-Zellen, die aus Mauslymphknoten und Milz isoliert wurden, in unterschiedliche T-Helfer-Untergruppen zu polarisieren. In vitro wird dies erreicht, indem zunächst Milz und Lymphknoten verarbeitet werden, die von adulten Wildtyp-Mäusen entnommen wurden. Im zweiten Schritt wird die CD 4 positive Zellpopulation durch magnetische Bead-Trennung angereichert und anschließend weiter nach ihrer naiven T-Zell-Marker-Expression sortiert.
Im letzten Schritt werden die Zellen mit T-Zell-Rezeptor-aktivierenden Faktoren und polarisierenden Zytokinen behandelt, um ihre Differenzierung in verschiedene T-Helferlinien zu induzieren. Letztendlich die Durchflusszytometrie. Elis A und real-time PCR werden verwendet, um die Effizienz der Differenzierung der T-Helferzellen zu beurteilen.
Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der T-Helferzellen zu beantworten, z. B. wie die Expression bestimmter Moleküle oder die Behandlung mit bestimmten Medikamenten die Art einer T-Zell-Antwort beeinflusst. Beginnen Sie damit, die Gliedmaßen einer fünf bis 10 Wochen alten C 57 black six Maus an das Präparierbrett zu heften, und schneiden Sie dann die Haut in Längsrichtung vom Anus bis zum Kinn ein, wobei Sie darauf achten, das darunter liegende Peritonealgewebe nicht zu punktieren. Als nächstes stecken Sie die Haut auf und verwenden Sie eine Pinzette, um den Lymphknoten zu greifen, und eine andere, um das Gewebe von jeder der im Bild gezeigten Stellen zu trennen.
Wenn jeder Lymphknoten entnommen wird, legen Sie ihn in eine Auffangschale, die PBS enthält, das mit 1% FBS oder PBS plus ergänzt ist, und öffnen Sie dann vorsichtig das Peritoneum und entfernen Sie die Milz. Legen Sie die Milz ebenfalls in die Auffangschale und geben Sie die Schale in einen Eiskübel, um für die CD vier positive Zellen anzureichern. Teilen Sie die Lymphknoten in der Milz mit einer sterilen Pinzette in zwei separate 60-Millimeter-Schalen auf, die jeweils drei Milliliter PBS plus enthalten.
Legen Sie dann ein Quadrat steriles Nylonnetz über die Milz und schlagen Sie sie mit dem Daumen eines Spritzenkolbens vorsichtig gegen das Netz, bis fast das gesamte Gewebe in Suspension geht. Spritzen Sie die Suspension einige Male auf und ab, um die verbleibenden löslichen Klumpen aufzubrechen, und legen Sie dann ein neues Stück Nylonnetz über die Öffnung eines konischen 15-Milliliter-Rohrs. Filtern Sie die Suspension in das Rohr, um alle verbleibenden Ablagerungen zu entfernen.
Wiederholen Sie nun die mechanische Dissoziation für die Lymphknoten und füllen Sie beide Röhrchen mit gefilterten Zellen mit PBS plus. Dann drehen Sie die Röhren ein paar Mal um und schleudern Sie die Zellen nach unten. Suspendieren Sie das Lymphknotenpellet in zwei Millilitern PBS.
Geben Sie einen Milliliter eiskalte, eine CK-Lösung pro Maus zum Milzzellpellet. Stoppen Sie nach einer Minute die Lyse der roten Blutkörperchen mit 10 Millilitern PBS plus. Drehen Sie das Röhrchen um und schleudern Sie die Zellen wieder nach unten.
Dann resuspendieren Sie das Milzpellet in 10 weiteren Millilitern PBS plus, fügen Sie die Lymphknotenzellen hinzu und schleudern Sie die gepoolte Zellsuspension herunter. Diesmal resuspendieren Sie das Pellet in 15 Mikrolitern CD, vier magnetischen Kügelchen, verdünnt in 85 Mikrolitern PBS plus pro Maus für 15 bis 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Verdünnen Sie dann die Zellen in 10 Millilitern PBS plus.
Filtern Sie die Suspension durch ein Nylonsieb in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen und schleudern Sie die Zellen herunter. Auch hier wird das Pellet in 100 Mikrolitern PBS plus pro Maus erneut gedreht und für die CD vier positive Zellen durch magnetische Perlenauswahl gemäß den Anweisungen des Herstellers positiv ausgewählt. Nachdem Sie die vier positive, positive Zellfraktion erhalten haben, waschen Sie die Zellen in 10 Millilitern PBS plus, um die vier positive T-Zellfraktion der CD zu sortieren.
Anschließend markieren Sie die Zellen nach dem Waschen 15 bis 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln mit den entsprechenden fluoreszierenden Antikörpern. Filtern Sie die markierten Zellen, um Schmutz zu entfernen, und übertragen Sie sie in ein Faxrohr auf Eis und schützen Sie es vor Licht. Sortieren Sie die CD vier positiv, CD 25 negativ, CD 62 L, positiv CD 44 negativ in das vollständige RPMI-Medium. Wenn alle Zellen gesammelt wurden.
Waschen Sie die naiven T-Zellen in frischem, vollständigem Medium. Resuspendieren Sie dann das Pellet und die vollständige RPMI, zählen Sie die naiven T-Zellen und passen Sie die Konzentration auf eins mal 10 für die sechs Zellen pro Milliliter an, um in vitro eine Differenzierung der T-Helfer-Untergruppe zu induzieren. Waschen Sie anschließend jede Vertiefung der Zellkulturplatten, die zuvor mit Anti-CD 3 und Anti CD 28 beschichtet waren, in einem Milliliter sterilem FBS-freiem PBS und einer sterilen Platte.
Die Zellen ergänzen schließlich die Nährmedien mit den entsprechenden Zytokinen und blockierenden Antikörpern, wie in der Tabelle dargestellt, und inkubieren die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für vier bis fünf Tage nach vier bis fünf Tagen in Kultur. Es kann eine intrazelluläre Zytokinfärbung der CD vier positiven T-Zellen aus den in vitro differenzierten Kulturen TH ein, TH zwei induzierbare Treg und TH 17 Kulturen durchgeführt werden. Um zu bestätigen, dass jede T-Zell-Untergruppe das erwartete Zytokinprofil aufweist.
Tatsächlich zeigt A nach 24-stündiger Restimulation mit drei Anti-Zöliakie-Proteinen, dass die Untergruppen auch die entsprechende extrazelluläre Produktion der intrazellulär exprimierten Zytokinproteine aufweisen. Die Echtzeit-PCR für linienspezifische Transkriptionsfaktoren verifiziert die geeigneten Transkriptionsfaktorprofile der in vitro differenzierten CD vier positiven T-Zell-Untergruppen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man spiegelnde Lymphknoten- und Milzzellen isoliert und verarbeitet, um naive Zöliakie-4-positive T-Helferzellen zu erhalten.
Darüber hinaus können Sie diese T-Zellen in TH eins, TH zwei, TH 17 oder ireg Zellen unterscheiden.
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Übersicht
In diesem Artikel wird ein Verfahren beschrieben, um naive CD4+-T-Zellen mithilfe von In-vitro-Techniken in unterschiedliche T-Helfer-Subtypen zu polarisieren. Der Prozess umfasst die Isolierung von Zellen aus den Lymphknoten und der Milz von Mäusen, die Anreicherung der CD4+-T-Zell-Population sowie die Behandlung mit spezifischen Stimuli und Zytokinen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunologie
- Zellbiologie
- Neurowissenschaften
Hintergrund
- Naive CD4+-T-Zellen können sich in verschiedene Effektor-Subpopulationen differenzieren.
- Der Differenzierungsprozess wird durch Umweltfaktoren während der Aktivierung beeinflusst.
- In-vitro-Methoden ermöglichen die kontrollierte Untersuchung der T-Zell-Polarisierung.
- Die Differenzierungseffizienz wird mittels Durchflusszytometrie und PCR bewertet.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Polarisation naiver CD4+-T-Zellen etablieren.
- Die Auswirkungen von T-Zell-Rezeptor-Stimuli und Zytokinen auf die Differenzierung untersuchen.
- Einen Rahmen zur Untersuchung von T-Helferzell-Linien bereitstellen.
Verwendete Methoden
- Isolierung von naiven CD4+-T-Zellen aus den Lymphknoten und Milzen von Mäusen.
- Magnetische Bead-Separation zur Anreicherung der CD4+-T-Zell-Population.
- Sortierung basierend auf der Expression von Markern für naive T-Zellen.
- Behandlung mit aktivierenden Faktoren des T-Zell-Rezeptors und polarisierenden Zytokinen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Polarisation naiver CD4+-T-Zellen in unterschiedliche T-Helfer-Subtypen.
- Bestätigung der Differenzierungseffizienz mittels Durchflusszytometrie und Echtzeit-PCR.
- Nachweis des Einflusses spezifischer Zytokine auf das Schicksal der T-Zellen.
- Gewonnene Erkenntnisse zur T-Zell-Biologie und potenziellen therapeutischen Anwendungen.
Schlussfolgerungen
- Die Methode polarisiert na茂ve CD4+-T-Zellen effektiv in vitro.
- Die Ergebnisse vertiefen das Verst盲ndnis der Mechanismen der T-Zell-Differenzierung.
- M枚gliche Implikationen f眉r die Immuntherapie und die Impfstoffentwicklung.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Die Isolierung und Differenzierung von naiven CD4+-T-Zellen der Maus ermöglicht die mechanistische Untersuchung von Zytokinsignalwegen, die die Differenzierung in T-Helfer-Subtypen steuern. Dieser Ansatz unterstützt die Zielvalidierung bei der entdeckung immunmodulatorischer Wirkstoffe, indem molekulare Störungen mit funktionellen Immunphänotypen verknüpft werden. Die Methode bietet ein skalierbares und reproduzierbares System zur Risikominimierung von Biologika oder niedermolekularen Substanzen, die darauf abzielen, die adaptive Immunität zu modulieren.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Hypothesenprüfung darüber, wie spezifische Moleküle oder Wirkstoffe das Differenzierungsschicksal von T-Zellen beeinflussen.
- Operativer Wert: Bietet ein kontrolliertes In-vitro-System, um Variablen zu isolieren, die die Linienentscheidung für Th1-, Th2-, Th17- oder Treg-Zellen beeinflussen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem die Modulation eines Zielmoleküls mit linien-spezifischen Zytokin- und Transkriptionsfaktor-Ausgaben verknüpft wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Eignung: Erzeugt differenzierte T-Helfer-Subpopulationen mit quantifizierbaren Zytokin- und Transkriptionsfaktor-Signalen.
- Reproduzierbarkeit: Standardisierte Isolations- und Polarisationsabläufe ermöglichen eine konsistente Wirkstoffprüfung über verschiedene Experimente hinweg.
- Skalierbarkeit: Die Anreicherung mittels magnetischer Sphären und die FACS-Sortierung erlauben die Verarbeitung ausreichender Zellzahlen für Mehrbraden-Assay-Formate.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert zytokinvermittelte T-Helfer-Zellpathologien, die für autoimmune, entzündliche und infektiöse Erkrankungen relevant sind.
- Translationale Kontinuität: Differenzierte Subpopulationen können erneut stimuliert und hinsichtlich ihrer funktionellen Zytokinproduktion analysiert werden, wodurch in-vitro-Ergebnisse mit ex-vivo-Validierungen verknüpft werden können.
- Biomarker-Korrelation: Linien-spezifische Transkriptionsfaktoren (z. B. T-bet, GATA3, RORγt, FoxP3) dienen als mechanistische Biomarker für das Target-Engagement.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis hin zu präklinischen mechanistischen Studien ein und ermöglicht die iterative Entwicklung von Immunmodulatoren.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen der TCR-Signalgebung und des Zytokinspiegels auf die Schicksalsentscheidungen von T-Zellen.
- Screening: Bereitstellung standardisierter, polarisierter T-Zellpopulationen zur Beurteilung des Einflusses von Substanzen auf die Differenzierung von Subpopulationen.
- Analytik: Die Durchflusszytometrie und die Echtzeit-PCR liefern quantitative, multiparametrische Messwerte zur Linienzugehörigkeit und Signalwirksamkeit.
- Translationale Forschung: Ermöglicht die Beurteilung der Funktionalität differenzierter Subpopulationen durch erneute Zytokinstimulation und unterstützt damit die präklinische Validierung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Der zentrale Workflow zur Isolierung und Differenzierung kann an verschiedene Zielklassen und Zytokinbedingungen angepasst werden.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Mechanistische Einblicke in die Wirkung von Zielstrukturen auf die Differenzierung von T-Helfer-Zelllinien und die Immunpolarisierung.
- Operativer Wert: Standardisierte Zellisolierung, Differenzierung und analytische Messgrößen verbessern die Reproduzierbarkeit des Assays.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem bereits früh im Entdeckungsprozess eine Verbindung zwischen der Modulation des Targets und funktionellen Immunantworten hergestellt wird.
- Portfolio-Beitrag: Ermöglicht die Priorisierung immunmodulatorischer Kandidaten basierend auf vorhersagenden Profilen der T-Zell-Differenzierung.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Mausgewebeaufbereitung, magnetischen Bead-Separation und fluoreszenzaktivierten Zellsortierung.
- Benötigt eine sterile Zellkulturausstattung, Zytokinreagenzien sowie Durchflusszytometrie- oder qPCR-Geräte.
- Erfordert eine Standardisierung zwischen verschiedenen Bedienern, um eine konsistente Isolierung naiver T-Zellen und Polarisation von Subpopulationen zu gewährleisten.
- Die Anpassung an alternative Mausstämme oder Krankheitsmodelle kann eine Optimierung der Zytokinbedingungen erfordern.
- Zu den Einschränkungen gehören die Variabilität zwischen Spendern und die Notwendigkeit, zu überprüfen, ob die Ergebnisse aus In-vitro-Experimenten die biologischen Gegebenheiten im lebenden Organismus widerspiegeln.
