Name: Maus Naive CD4 + T-Zell-Isolierung und In-vitro- Differenzierung in T-Zell-Populationen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und In-vitro-Differenzierung von naiven CD4+ T-Zellen aus Maus-Lymphknoten und Milz in verschiedene T-Helfer-Subpopulationen mit magnetischer Zellseparation und zytokinbasierter Polarisation.

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Die Autoren bedanken sich bei allen Mitgliedern der Reynolds Labor an Rosalind Franklin Universität für Medizin und Wissenschaft, und das Chen Dong Labor an der University of Texas MD Anderson Cancer Center für die Optimierung dieses Protokolls zu danken. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss zu JMR von der National Institutes of Health (K22AI104941) unterstützt.

Alle experimentellen Verfahren werden durchgeführt unter Verwendung von Protokollen vom Büro des Environmental Health and Safety an der Rosalind Franklin Universität für Medizin und Wissenschaft genehmigt. C57BL / 6-Mäuse (von NCI gekauft) für dieses Protokoll wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen untergebracht sind, und alle Tierversuche wurden unter Verwendung von Protokollen, die von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) genehmigten an der Rosalind Franklin Universität für Medizin und Wissenschaft. 1. Vorbereitung der Instrumente, Zubehör und Reagenzien <ol><li> Mantel mit 48 Vertiefungen oder 24-Well-Platten mit anti-CD3 und anti-CD28 (Tabelle 1) in sterilem PBS, abdecken und wickeln Sie sie in Parafilm, um Verdunstung und Kontamination zu vermeiden, und dann inkubiert O / N bei 4 o C Vortag T Zellisolierung. Alternativ Mantel Brunnen 1 h bei 37 ° C. Führen Th0, Th1, Th2 und iTreg Bedingungen durch die Beschichtung sowohl anti-CD3 und anti-CD28 bei 1 ug / ml in 0,5 bis 1 ml bistal Volumen (48-Well-Platte). Für Th17 wir typischerweise Mantel anti-CD3 bei 2 ug / ml und Anti-CD28, auf 1 ug / ml. HINWEIS: Wir haben festgestellt, daß eine niedrigere Anti-CD3-Konzentration ist optimal für Th1, Th2 und iTreg Generation während eine höhere anti-CD3-Konzentration ist optimal für Th17 Generation. So sollte anti-CD3 und anti-CD28-Konzentrationen titriert und für einzelne Laboratorien (Tabelle 2) optimiert werden. </li><li> Sterilisieren Sie eine Reihe von Dissektionswerkzeuge (Schere und Pinzette) von Autoklaven oder Desinfektionslösung. Ein Rohr oder kleinen Becherglas mit 70% Ethanol wird für die schnelle Sterilisation von Instrumenten zwischen Dissektionen benötigt. Schließlich wird eine Sprayflasche, die 70% Ethanol zum Sterilisieren der Oberfläche der Maus vor Dissektion erforderlich. </li><li> Bereiten Sie eine Dissektion Oberfläche, indem ein flaches Stück Styropor oder Pinnwand mit Aluminiumfolie. Zergliedern Stifte oder Nadeln verwendet werden, um das Tier zu fixieren. </li><li> Bereiten die Gerichte oder Platten für die Sammlung von tiHEMEN. Wenn die Bündelung Geweben, separate 60mm Gerichte 3 ml mit steriler PBS + 1% FBS (PBS +) für Milz und Lymphknotengewebe ausreichend ist. Wenn halten Gewebe von einzelnen Mäusen zu trennen, bereiten Sie eine 24-Well-Platte mit 1 ml PBS + in die gewünschte Anzahl von Brunnen. </li><li> Bereiten vollständigen RPMI-Medium für die Zellkultur und Vorwärmen vor der Anwendung (Tabelle 1). HINWEIS: Es wird routinemäßig RPMI aber auch andere Medien wie IMDM und DMEM ebenso effektiv oder überlegen je Labor und Experiment. </li><li> Cut 2x2 cm große Quadrate von Nylon Netz mit einem 120 &amp; mgr; m Porengröße und Autoklaven zu sterilisieren (Tabelle 1). </li><li> Optional: Wenn mit dem Hochgeschwindigkeits-Magnetzellsortiersystem wie autoMACS für CD4 + Zellanreicherung, vorge fließend warmem und Spülen Puffer in einem 37 ° C Wasserbad, um Schäden an der Maschine zu vermeiden. </li><li> HINWEIS: Die Anreicherung wird empfohlen, die Sortierausbeute erhöhen und Sortierzeit. </li><li> AlleHerstellungsschritte, mit Ausnahme für die Präparation sollte in einem sterilen Gewebekulturhaube durchgeführt werden. </li></ol> 2. Isolierung von Lymphknoten und Milz von Mäusen <ol><li> Euthanize die erforderliche Anzahl von Tieren mit einem institutionell anerkannte Technik. Verwenden weibliche C57BL / 6 Mäuse im Alter von 5-10 WKS aufgrund ihrer hohen Prozentsatz von naiven T-Zellen und den Körperfettanteil im Vergleich zu Männern oder älteren Mäusen. Hinweis: Zellen von männlichen Mäusen werden in ähnlicher Weise in vitro durchzuführen, und die Protokollschritte bleiben dieselben. Weibliche Mäuse, 5-10 Wochen alt, werden in der Regel ergeben 3-6 x 10 6 naiven CD4 + T-Zellen pro Maus. Jedoch kann unter Verwendung verschiedener Mäusestämme Ausbeute und Leistung beeinflussen. Beispielsweise können Zellen aus C57BL / 6-Mäuse sind besser zur Erzeugung von Th1-Zellen, während Zellen von Mäusen Balb.c besser zur Erzeugung von Th2-Zellen. </li><li> Verbreiten Sie die Gliedmaßen des Tieres und hänge sie an Ort und Stelle, wie in Abbildung 1 dargestellt. Schneiden Sie die Haut langitudinally von den Anus bis zum Kinn, während man aufpassen, nicht zu tieferen Gewebepunktion. </li><li> Verbreiten Sie öffnen Sie die Haut mit einer Pinzette und stecken Sie die Haut an Ort und Stelle, um einen einfachen Zugang zu den Lymphknoten zu ermöglichen, wie in Abbildung 1 dargestellt. </li><li> Ernten Sie die zugänglichen Lymphknoten aus den in Abbildung 1 gezeigten Stellen. Wir packen die Lymphknoten mit einer Pinzette, während Trenngewebe mit einer anderen Pinzette wird für die einfache Entfernung ermöglichen. Legen Sie das Gewebe in der Auffangschale. </li><li> Ernten der Milz aus der in Figur 1 gezeigten Position. In diesem Fall wird vorsichtig Schneid ins Peritoneum benötigt, um Zugang zu der Milz erhalten. Legen Sie das Gewebe in einer Sammlung Gericht. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang, wenn mehr Gewebe geerntet werden. Ansonsten mit den nächsten Schritten fortfahren. An dieser Stelle führen Sie alle weiteren Schritte auf Eis, bis die Beschichtung der T-Zellen nach dem Sortieren. </li></ol> 3. Gewebeverarbeitung und CD4 + Enrichment<ol><li> Verarbeiten Sie die Lymphknoten und Milz in verschiedenen Gerichten, die Ausbeute als Lymphknotenzellpräparate nicht Erythrozytenlyse erfordern, die zu leichten Leukozyten Tod erhöhen. Daher sind die folgenden Schritte beschreiben ein Verfahren zur Verarbeitung von Milz und Lymphknoten-Populationen getrennt durch Kombination vor der Markierung für die Sortierung folgt. </li><li> Entfernen Sie das Gewebe (Milz oder Lymphknoten gebündelt) von der Auffangschale und in einen neuen 60-mm-Schale mit 3 ml PBS +. Legen Sie ein Quadrat von sterilen Nylon Netz über das Gewebe mit sterilisierten Pinzette. </li><li> Mit der Daumenseite eines Spritzenkolbens (3-10 ml) und sanft zerschlagen das Gewebe gegen die mesh. Nahezu das gesamte Gewebe sollte in Suspension gehen. Sie können auch den Gewebe zwischen zwei autoklaviertem mattierte Folien und geschliffen in Suspension. </li><li> Pipettieren Sie die Aussetzung nach oben und unten ein paar Mal zum Aufbrechen der verbleibende lösliche Klumpen. Legen Sie ein neues quadratisches Stück Nylon-Mesh über die Öffnung ein15 ml konischen Röhrchen und Filtern der Suspension durch, um den verbleibenden Schmutz zu entfernen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2-4 für zusätzliche Lymphknoten und Milz-Gewebe. </li><li> Nachdem die Suspension in eine 15ml Tube gefiltert füllen den Rest des Schlauchs mit PBS + und schwenken. Zentrifugiere die Zellen bei 475 g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Für die Milzzellen, saugen Sie den Überstand nach der Zentrifugation und Zellpellet in 1 ml eiskaltem 1X ACK-Lösung pro Milz für 1 Minute, um Erythrozyten zu lysieren. Dann gibt man 10 ml PBS + auf der Oberseite des ACK, das Röhrchen und zentrifugieren 475 xg für 5 min bei 4 ° C </li><li> Für Lymphknotenzellen, saugen Sie den Überstand und resuspendieren in 2 ml PBS +. Falls gewünscht können diese mit den Milzzellen nach ihrem ACK Lyse und Waschschritt kombiniert werden. </li><li> Saugt den Überstand nach Zentrifugation der Splenozyten und resuspendieren in weiteren 10 ml PBS +. An dieser Stelle kann der Lymphknoten Suspension einauf der Oberseite der Milz Suspension dded wenn zur Sortierung Gewebe Bündelung erforderlich. Zentrifugieren Sie das Röhrchen wieder bei 475 xg für 5 min bei 4 ° C </li><li> Das Zellpellet kann jetzt CD4 Anreicherung hergestellt werden. Wenn dieser Schritt nicht ausgeführt wird, zu den Sortiervorbereitungsschritte ablaufen. </li><li> Für CD4 Bereicherung mit dem Hochgeschwindigkeits-Magnetzellsortiersystem, resuspendieren Zellpellet mit CD4-Perlen. Typischerweise 15 &amp; mgr; l Perlen in 85 ul PBS + verdünnt wird verwendet, um das Gewebe zwischen 1 Maus kennzeichnen. Rampe auf das Volumen der Perlen-Mischung nach Bedarf, das Pellet, und Inkubieren für 15-30 min bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit 10 ml PBS +, vorbei an der Suspension durch Nylon in eine neue 15-ml-Tube, um Schmutz und Zentrifuge wieder bei 475 xg für 5 min bei 4 ° C zu entfernen </li><li> Das Pellet in 100 ul PBS + pro Maus und fahren Sie mit positiven Selektion auf der Hochgeschwindigkeits-Magnetzellsortiersystem. Wenn Sie eine manuelle Trennsystem, follow die Anweisungen des Herstellers für die Anreicherung. Alternativ Resuspendieren der Proben in FACS-Puffer: PBS mit 1 mM EDTA (pH = 8) und 1% BSA, sterilfiltriert. </li><li> Entfernen Sie die positive Fraktion und waschen Sie einmal mit 10 ml PBS +. Das angereicherte CD4 + Bruchteil ist nun bereit für die Sortierung gekennzeichnet werden. </li></ol> 4. Sortier Naive CD4 + T-Zellen <ol><li> Beschriften Sie die Zellpellets mit PBS + mit fluoreszierenden Antikörpern gegen CD62L, CD44, CD25 und CD4 gerichtet. Bei Verwendung der in Tabelle 1 aufgeführten Antikörper werden Verdünnungen für jeden zur Verfügung gestellt. Zur Färbung wird ein Volumen von 100 ul der Antikörpercocktail pro Geweben von einer Maus. </li><li> Das Pellet in Antikörper-Cocktail und Inkubation für 15 bis 30 Minuten bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Die Zellen werden mit 10 ml PBS + und Zentrifuge 475 × g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Übergeben Sie die Mischung über eine andere Nylonfilter oder Zellsieb Kappe neubewegen alle übrig gebliebenen Trümmer. Pipettieren markierten Zellen in eine Röhre, die für den Zellsortierer kompatibel ist. Halten Sie Zellen auf Eis und von der Licht bis die Art geschützt. </li><li> Bereiten Sammelröhrchen durch Pipettieren 1-2ml kompletten RPMI Medium oder FBS in den Boden der Röhrchen zum Sammeln kompatibel auf einem Zellsortierer. </li><li> Sortieren Sie die naiven CD4 + T-Zellen als CD4 + CD25 - CD62L + CD44 - Population (Abbildung 2). Waschen der gesammelten Zellen mit vollständigem RPMI-Medium und Zentrifugieren wie oben beschrieben. </li><li> Das Pellet in komplettem RPMI, zählen die naive Zellen, und stellen Sie die Konzentration auf 1 x 10 6 Zellen / ml. </li></ol> 5. Einrichten des In-vitro-Differenzierung <ol><li> Absaugen Vertiefungen der anti-CD3 und anti-CD28-beschichteten Platten und Waschen jeder Vertiefung mit 1 ml sterilem PBS (ohne FBS). Für Platten mit 48 Vertiefungen, die Platte 0,5 x 10 6 Zellen / Vertiefung in 0,5 ml RPMI. Für Platten mit 24 Vertiefungen, die Kultur 1 x 10 6 Zellen / Vertiefung in 1,0 ml RPMI. </li><li> Wenn die Prüfung des Einflusses eines Faktors, wie ein Arzneimittel hinzuzufügen der Substanz in die entsprechenden Vertiefungen entweder vor, während oder nach dem Differenzierungsprozeß je nach Experiment. Weiter, ergänzen die Kulturmedien mit entsprechend Zytokinen und blockierende Antikörper. Th0: 30 U / ml hIL-2. Th1: 15 ng / ml rmIL-12, 30 U / ml hIL-2 und 5.000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml rmIL-4, 30 U / ml hIL-2, 2000 ng / ml löslich 37.51, und 5.000 ng / ml XMG1.2. iTreg: 15 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml hIL-2, 5000 ng / ml XMG1.2 und 5.000 ng / ml 11B11. Th17: 20 ng / ml rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, 5,000 ng / ml XMG1.2 und 5.000 ng / ml 11B11. HINWEIS: Die oben dargestellten Bedingungen als optimal für die Maximierung der Produktion von Zytokinen, wie am Ende des Differenzierungs Experiment (Repräsentative Ergebnisse Abschnitt) gemessen werden. Allerdings sollte jede Bedingung für einzelne Laboratorien (Tabelle 2 optimiert werden </strong&gt;). Weiterhin ist der Zusatz von löslichem Anti-CD28 neben der Platte gebundenen Anti-CD28 wurde gefunden, dass Th2-Cytokin-Produktion in unserem Labor erweitern, hat keine Auswirkung auf andere T-Zellen-Untergruppen, aber: </li><li> Inkubieren der Platte bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 4-5 vor der Analyse der Genexpression und Cytokinproduktion d. Alternativ zu entfernen, die Zellen aus den TCR Reize nach 2 d, 1 x 10 6 Zellen / ml mit frischem Medium angepasst, und die Platte in neue Vertiefungen (nicht beschichtet), um die Proliferation und die endgültige Ausbeute verbessern. In diesem Fall, werden frische polarisierenden Cytokine und Antikörper nicht benötigt aber 10 U / ml IL-2 soll auf die neuen Medien für Th0, Th1, Th2 und iTreg Kulturen hinzugefügt. </li></ol> 6. Analyse der Differenzierung <ol><li> Für Cytokin-Analyse durch Durchflusszytometrie restimulieren jede Vertiefung mit 10 ng / ml PMA und 1.000 ng / ml Ionomycin oder 1 &amp; mgr; g / ml anti-CD3 für 4-6 Stunden in Gegenwart eines Golgi-Inhibitor, wie Brefeldin A (Tabelle1). Führen intrazellulärem Zytokinfärbung je nach Experiment (Figur 3). Hinweis: Beize nicht linienspezifischen Zytokine oder Transkriptionsfaktoren, wie beispielsweise IL-4 (nicht gezeigt) und IFN &amp; gamma; (3) für Th17 Kulturen, für jede Bedingung als Negativkontrolle und als Indikator für die Differenzierung Effizienz. Ferner kann Flecken Foxp3 für Th17 Kulturen als Kehr Entwicklung Treg unter Zusatz von TGFß auftreten. </li><li> Zur Proteinquantifizierung, sammeln die Überstände aus jeder Vertiefung und Assay von zytokinspezifischen ELISA (Figur 3). Wenn es Bedenken, dass der Faktor getestet wurde Proliferation beeinflußt, verglichen mit Kontrollproben, können die Zellen gewaschen, gezählt, normalisiert und dann mit 1 &amp; mgr; g / ml Anti-CD3 für 24 h vor dem Sammeln Stände für ELISA-Assays restimuliert. Wenn Untersuchung IL-4 von Th2 Bedingungen, Waschen und Restimulation notwendig ist, um IL-4 zu entfernen, die l sein kanneftover von der ersten Differenzierung Kultur. </li><li> Für die Genexpressionsanalyse von Echtzeit-PCR, Ernte-Zellen nach der Inkubation, Waschen, zu normalisieren und wieder anzuregen für 2-6 h mit 1 ug / ml des anti-CD3 vor der Ernte mRNA (Abbildung 3). </li></ol>

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<li>Ghoreschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pathogenic+T%28H%2917+cells+in+the+absence+of+TGF-beta+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling.</a> Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).</li>
<li>Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+in+the+context+of+an+inflammatory+cytokine+milieu+supports+de+novo+differentiation+of+IL-17-producing+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells.</a> Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).</li>
<li>Avni, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T%28H%29+cell+differentiation+is+accompanied+by+dynamic+changes+in+histone+acetylation+of+cytokine+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes.</a> Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).</li>
<li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD4%2B+T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), (2007).</li>
<li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+th17+differentiation+of+naive+CD4+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes.</a> J Vis Exp. (79), e50765(2013).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Während die Milz naiven Th-Zellen enthält, ist der Anteil dieser Population in Lymphknoten viel höher. Eine nicht fachgerechte Ermittlung und Beseitigung Lymphknoten in diesem Protokoll wird in einer schlechten Ausbeute von naiven Zellen führen. Dies kann besonders schwierig bei älteren Mäusen oder männlichen Mäusen, die mehr Fettgewebe haben. Wie in Abbildung 1, die richtige Befestigung und Verstiftung der tierischen Gliedmaßen und der Haut gezeigt werden zur leichteren Visualisierung der zugänglichen ...

Das Konzept der verschiedenen Linien oder Teilmengen von CD4 + T-Helferzellen (Th) gibt es schon seit der zweiten Hälfte des 20. Jahrhunderts 1 gewesen. Anerkennung der verwandten Antigen in Gegenwart von kostimulatorischen Signalen resultiert in mehreren Runden der Zellproliferation und die eventuelle Differenzierung in Th-Zellen. Der Typ der Th-Zell während dieses Prozesses erzeugt wird, ist abhängig von der während der Aktivierung 2 vorhanden Zytokin-Umgebung. Anfänglich wurden naiven Th-Zellen vermutlich in 2 unterschiedliche Linien folgenden T-Zell-Rezeptor (TCR) Aktivierung kostimulatorischen CD28 Ligation und Zytokin-Signalisierung zu polarisieren. Typ-1-Helfer-Zellen (Th1) mit ihren Effektorfunktionen Produktion des IFN Cytokin sowie deren Erfordernis für IL-12-Signalisierung während des Differenzierungsprozesses 3,4 gekennzeichnet. Schließlich wurde entdeckt, dass differenzierte Th1-Zellen eine genetische Profil, das am meisten ausgeprägt auszeichnet b habeny der Ausdruck der T-Box-Familie Transkriptionsfaktor, Tbx21 (T-bet), die als die Hauptregulator des Th1 genetische Programm 5 ist. Darüber hinaus kann IL-12 sowie IFNy T-bet Ausdruck 6,7 fördern. In der Immunantwort sind Th1-Zellen wichtig für die Wirtsabwehr gegen intrazelluläre Pathogene sowie starke Promotoren von Autoimmunentzündung. Demgegenüber Typ 2-Helfer-Zellen (Th2) erfordern IL-4 für ihre Entwicklung und ihre Effektorfunktion Cytokine, einschließlich IL-4, IL-5 und IL-13, sind für den Antrieb B-Zell-Antworten und sind pathogen Allergie 8, 9. Ähnlich wie Th1-Zellen wurden Th2-Zellen gefunden, um ihre eigenen Master Transkriptionsregulator zum Ausdruck, bezeichnet GATA-3 10,11. Interessanterweise ist das Vorhandensein von polarisierenden Cytokine und die Erzeugung eines spezifischen Th Linie antagonistisch auf die Entwicklung anderer 2,12, was darauf hindeutet, daß nur eine bestimmte Teilmenge Th kann während einer Immunwieder dominantAntwort. Da die Identifizierung der Th1 und Th2-Linien hat weitere Arbeit noch einzigartig Gruppen von T-Helfer-Zellen, einschließlich follikulären helper (TFH), IL-9-produzierenden (Th9) und IL-22-produzierenden (Th22) (kürzlich gezeigt in 13 überprüft). Für die Zwecke der in vitro Differenzierungsexperimente wird dieses Protokoll nur an zwei weiteren Th Subsets konzentrieren, genannt regulatorischen T-Zellen (Treg) und IL-17-produzierenden CD4 + T-Zellen (Th17). CD25 + regulatorische T-Zellen können natürlich (nTreg) im Thymus auftreten; naiven Th-Zellen können auch induziert werden (iTreg) Regulierungs in der Peripherie (in 14,15 prüft) zu werden. Beide Arten von Treg exprimieren eine charakteristische Transkriptionsfaktor, bezeichnet als forkhead Feld P3 (Foxp3), die kritisch für ihre Effektorfunktion Unterdrückungsmechanismen, die lösliche entzündungshemmende Mediatorproduktion, IL-2 -Verbrauch und Zell-Kontakt-abhängige Mechanismen 14,15 enthalten ist. Das Fehlen Foxp3-Expression führt zu einer schweren, Multiorgan-Autoimmunerkrankung bezeichnet Immundysregulation, Polyendokrinopathie, Enteropathie, X-chromosomale Syndrom (IPEX), was die wichtige Rolle dieses Th Teilmenge der Lösung Entzündung und Regel periphere Toleranz gegen Selbst-Antigene 16. In vitro, naive CD4 + T-Helfer-Zellen hochreguliert Foxp3 und sich verpflichtet, die Treg-Programm nach der Stimulation mit IL-2 und TGF-β 14,15. Es kann mäßige bis erhebliche Plastizität in CD4 + T-Zelllinien, vor allem, wenn man bedenkt, nur Zytokin-Produktion (in 17,18 prüft). Jedoch für die Zwecke der in vitro Differenzierungsprotokollen, werden wir uns mit jeder Untermenge als einmalige Linie. Vor kurzem wurde eine Teilmenge von Th17 Zellen, die den IL-17-Zytokin produziert als einmalige Linie mit proinflammatorischen Funktionen, die während Autoimmunentzündung 19-21 besonders pathogene identifizierten. Th17-Zellen exprimieren eine einzigartige Transkriptionsfaktor, genannt Retinoid bezogenen Orphan-Rezeptor gamma t (RORγt), die die Th17 genetische Programm 22 koordiniert. TGF &amp; bgr; ist durch die Induktion RORγt wichtig für die Erzeugung von Th17 Linie. Allerdings ist die Wirkung von TGF &amp; beta Signalisierungs Vermutlich nur veran Th17 Verpflichtung auf synergizing mit IL-6 (in 12 überprüft). Weitere Studien haben gezeigt, dass eine Vielzahl von anderen Signalen, die positiv regulieren Th17 Vereinbarung, einschließlich IL-1β, erhöhte Natrium und TLR 23-26. Andere Berichte haben vorgeschlagen, daß die pathogenen Th17 Zellen in vivo sind diejenigen, die tatsächlich zu umgehen TGFß Signalisierung und sich stattdessen auf eine Kombination von IL-1, IL-6 und IL-23 für ihre Differenzierung 27 verlassen. Somit kann Th17 Zellen aus einer Vielzahl von Signalwegen abgeleitet werden; für die Zwecke dieses Protokolls, die gemeinsam verwendete (TGFß und IL-6) Weg für Th17 Linienfestlegungvorgestellt. Die im folgenden für alle Effektor Linien beschriebenen Differenzierungsprotokollen beruht auf fixierten Antikörper als Stimuli für die TCR und CD28 über den gesamten Verlauf des Experiments. Allerdings haben andere gezeigt, dass TCR-Aktivierung mit Antigen-präsentierenden Zellen 28 oder vernetzendem Anti-CD3 und Anti-CD28-Antikörper mit Hamster-Antikörper für 2 Tage 29 sind auch sehr wirksames Mittel zur Induktion der Erzeugung von verschiedenen Th Teilmengen. Die hier vorgestellte Protokoll baut auf die zuvor berichtete Verfahren zur Isolierung von murinen CD4 + T-Zellen von sekundären lymphatischen Organe 30 und erzeugen Th17 Zellen 31. Ein wichtiger Unterschied ist, dass dieses Protokoll beruht auf der Verwendung eines Zellsortierers, naive CD4 + T-Zellen aus lymphoiden Geweben zu isolieren. Viele Firmen bieten inzwischen schnelle Trennung Kits, die für naive CD4 + T-Zellen anreichern können, die vielleicht die Voraussetzungen f umgehen sein könnenoder Sortier je nach Experiment. Die Methoden und Reagenzien in diesem Protokoll vorgestellt werden sind, was wir routinemäßig und zu finden, um die effektivste. Aber bedenken Sie, dass alternative Reagenzien und Methoden für viele der Schritte im folgenden dargestellt existieren und es ist bis zu den einzelnen Labor, um festzustellen, was am besten für ihre Zwecke zu arbeiten.

<table><tbody><tr><td>Vollständiges RPMI:</td><td></td><td></td><td>Vor Gebrauch in einem 37 <o/sup>C Wasserbad erwärmen</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>10 % FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>1000X 2-Mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>100X Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>100X L-Glutamin</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>120 Mikron Nylonnetz</td><td>Amazon</td><td>CMN-0120-10YD</td><td>In 2 cm2 Quadrate schneiden und autoklavieren</td></tr><tr><td>Alternativ: 100 Mikron Zellsiebe</td><td>Fisher</td><td>08-771-19</td><td>Alternative zum Schneiden von Nylongewebe</td></tr><tr><td>autoMACS Laufpuffer</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td>Vor Gebrauch in einem 37 oC Wasserbad erwärmen</td></tr><tr><td>autoMACS Spüllösung</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-222</td><td>Vor Gebrauch in einem 37 oC Wasserbad erwärmen</td></tr><tr><td>CD4Kügelchen</td><td>Miltenyi</td><td>130-049-201</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysepuffer</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Zytokine:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Mensch (h) IL-2</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante Maus (rm) IL-4</td><td>Peprotech</td><td>214-14</td><td></td></tr><tr><td>rmIL-6</td><td>R & D Systems</td><td>406-ML-025</td><td></td></tr><tr><td>rmIL-12</td><td>Peprotech</td><td>210-12</td><td></td></tr><tr><td>hTGFb</td><td>R & D Systems</td><td>240-B-010</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2C11 (anti-CD3)</td><td>BioXcell</td><td>BE0001-1</td><td></td></tr><tr><td>37.51 (anti-CD28)</td><td>BioXcell</td><td>BE0015-1</td><td></td></tr><tr><td>11B11 (anti-IL-4)</td><td>BioXcell</td><td>BE0045</td><td></td></tr><tr><td>XMG1.2 (anti-IFNg)</td><td>BioXcell</td><td>BE0055</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD62L-FITC</td><td>BioLegend</td><td>104406</td><td>Verwendung bei 1:100</td></tr><tr><td>anti-CD25-PE</td><td>BioLegend</td><td>102008</td><td>Verwendung bei 1:400</td></tr><tr><td>anti-CD4-PerCP</td><td>BioLegend</td><td>100434</td><td>Verwendung bei 1:1000</td></tr><tr><td>anti-CD44-APC</td><td>BioLegend</td><td>103012</td><td>Verwendung bei 1:500</td></tr><tr><td>Phorbol&nbsp; 12-Myristat-13-acetat (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8139</td> Herstellung <td>einer Brühe von 0,1 mg/ml in DMSO und Einfrieren von Aliquoten bei -20 oC</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-0634</td><td>Bereiten Sie eine Brühe mit 0,5 mg/ml in DMSO vor und frieren Sie die Aliquoten bei -20 oC</td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>eBioscience</td><td>00-4506-51</td><td>Bei 1:1000 verwenden</td></tr></tbody></table>

maus naive cd4<sup&gt; +</sup&gt; t-zell-isolierung und<em&gt; in-vitro-</em&gt; differenzierung in t-zell-populationen

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen-unerfahrene (naive) CD4+ T-Zellen durchlaufen eine Expansion und Differenzierung zu Effektor-Untergruppen zum Zeitpunkt der T-Zell-Rezeptor (TCR)-Erkennung des verwandten Antigens, das auf MHC Klasse II präsentiert wird. Die Zytokinsignale, die zum Zeitpunkt der TCR-Aktivierung in der Umwelt vorhanden sind, sind ein wichtiger Faktor bei der Bestimmung des Effektorschicksals einer naiven CD4+ T-Zelle. Obwohl die Zytokinumgebung während der naiven T-Zell-Aktivierung komplex sein kann und in vivo sowohl redundante als auch gegensätzliche Signale enthält, kann die Zugabe verschiedener Zytokinkombinationen während der naiven CD4+ T-Zell-Aktivierung in vitro die Etablierung von Effektor-T-Helferlinien mit charakteristischer Zytokin- und Transkriptionsfaktorexpression leicht fördern. Solche Differenzierungsexperimente werden häufig als erster Schritt zur Bewertung von Zielen verwendet, von denen angenommen wird, dass sie die Entwicklung bestimmter CD4+ T-Helfer-Untergruppen fördern oder hemmen. Die Zugabe von Mediatoren, wie z. B. Signalagonisten, Antagonisten oder anderen Zytokinen, während des Differenzierungsprozesses kann auch verwendet werden, um den Einfluss eines bestimmten Ziels auf die T-Zell-Differenzierung zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein grundlegendes Protokoll für die Isolierung naiver T-Zellen aus der Maus und die nachfolgenden Schritte, die zur Polarisierung naiver Zellen zu verschiedenen T-Helfer-Effektorlinien in vitro erforderlich sind.

Der Zeitpunkt für die Analyse der Differenzierung in Abhängigkeit von der Th Zustand variieren und getestet, wie die Stärke der T-Zell-Rezeptor-Aktivierung. Nach 2-3 Tagen der Differenzierung, können die Zellen durch Lichtmikroskopie sichtbar gemacht, um das Ausmaß der T-Zellproliferation zu bestimmen. Wells umfassenden Proliferation und Verklumpung der Zellen, die wahrscheinlich für die Analyse am Tag 4. Differenzierung Bedingungen sich auf die Zugabe von exogenem IL-2, wie Th1 und Th2 ist, wird wahrscheinlich erschöpf...

Naive CD4+ T-Zellen polarisieren in verschiedene Untergruppen, abhängig von der Umgebung zum Zeitpunkt der Aktivierung. Die Differenzierung naiver CD4+ T-Zellen zu verschiedenen Effektor-Untergruppen kann in vitro durch die Zugabe von T-Zell-Rezeptor-Stimuli und spezifischen Zytokinsignalen erreicht werden.

Maus Naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zell-Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Differenzierung in T-Zell-Populationen

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Das allgemeine Ziel des folgenden Verfahrens besteht darin, naive CD4-positive T-Zellen, die aus den Lymphknoten und der Milz von Mäusen isoliert wurden, in unterschiedliche T-Helfer-Subpopulationen zu differenzieren. In vitro wird dies erreicht, indem zunächst Milz und Lymphknoten, die von erwachsenen Wildtyp-Mäusen gewonnen wurden, aufgearbeitet werden. Im zweiten Schritt wird die Population der CD4-positiven Zellen durch magnetische Säulenseparation angereichert und anschließend anhand der Expression von Markern für naive T-Zellen weiter sortiert.Im letzten Schritt werden die Zellen mit aktivierenden Faktoren für den T-Zell-Rezeptor und polarisierenden Zytokinen behandelt, um ihre Differenzierung in verschiedene T-Helfer-Zell-Linien zu induzieren. Abschließend werden Durchflusszytometrie, ELISA und Echtzeit-PCR verwendet, um die Effizienz der Differenzierung von T-Helfer-Zellen zu bewerten.Mithilfe dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der T-Helferzellen beantworten, beispielsweise wie die Expression spezifischer Moleküle oder die Behandlung mit bestimmten Wirkstoffen die Art einer T-Zell-Antwort beeinflusst. Beginnen Sie damit, die Gliedmaßen einer fünf bis zehn Wochen alten C57BL/6-Maus am Präparationsbrett festzustecken, und schneiden Sie anschließend die Haut längs vom After bis zum Kinn, wobei darauf geachtet werden muss, das darunterliegende Peritonealgewebe nicht zu verletzen. Danach wird die Haut auseinandergeklappt und mit einem Paar Pinzetten der Lymphknoten erfasst, während mit einem weiteren Paar Pinzetten das Gewebe von jeder der in der Abbildung angegebenen Positionen gelöst wird.Während jedes Lymphknoten entnommen wird, legen Sie ihn in eine Sammelschale, die PBS mit 1% FBS oder PBS plus enthält, und öffnen Sie anschließend vorsichtig das Peritoneum, um die Milz zu entfernen. Legen Sie die Milz ebenfalls in die Sammelschale und bringen Sie die Schale in einen Eiskübel, um die CD4-positiven Zellen anzureichern. Teilen Sie die Lymphknoten und die Milz mit sterilen Pinzetten auf zwei separate 60-Millimeter-Schalen auf, die jeweils drei Milliliter PBS plus enthalten.Als Nächstes ein Quadrat sterilen Nylonnetzes über die Milzen legen und mit der Daumenseite eines Spritzenkolbens vorsichtig darauf drücken, bis fast das gesamte Gewebe in Suspension geht. Die Suspension mehrmals auf- und abpipettieren, um verbleibende lösliche Klumpen aufzubrechen, und anschließend ein neues Stück Nylonnetz über die Öffnung eines 15-Milliliter-Konischgefäßes legen. Die Suspension durch das Netz in das Gefäß filtrieren, um eventuell verbliebene Partikel zu entfernen.Wiederholen Sie nun die mechanische Dissoziation für die Lymphknoten und füllen Sie beide Röhrchen mit gefilterten Zellen mit PBS plus auf. Drehen Sie die Röhrchen anschließend mehrmals um und zentrifugieren Sie die Zellen. Resuspendieren Sie das Lymphknoten-Pellet in zwei Milliliter PBS.Geben Sie je Maus ein Milliliter eiskalte CK-Lösung zum Milzzellpellet hinzu. Nach einer Minute die roten Blutkörperchen-Lyse mit 10 Milliliter PBS plus stoppen. Den Probengefäß umdrehen und die Zellen erneut abzentrifugieren.Resuspendieren Sie das Milz-Pellet anschließend in weiteren 10 Millilitern PBS plus, geben Sie die Lymphknotenzellen hinzu und zentrifugieren Sie die vereinigte Zellsuspension. Dieses Mal resuspendieren Sie das Pellet in 15 µL CD4-Magnetbeads, die in 85 µL PBS plus pro Maus verdünnt wurden, und inkubieren Sie für 15 bis 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Verdünnen Sie die Zellen anschließend in 10 Millilitern PBS plus.Filtrieren Sie die Suspension durch ein Nylon-Sieb in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen. Zentrifugieren Sie das Pellet erneut in 100 Mikrolitern PBS plus pro Maus und isolieren Sie die CD4-positiven Zellen mittels magnetischer Bead-Selektion gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nach der Gewinnung des CD4-positiven Zellanteils waschen Sie die Zellen in 10 Millilitern PBS plus, um den CD4-positiven T-Zell-Fraktion zu sortieren.Als Nächstes markieren Sie die Zellen nach dem Waschen 15 bis 30 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln mit den geeigneten fluoreszierenden Antikörpern. Filtern Sie die markierten Zellen, um Verunreinigungen zu entfernen, überführen Sie sie in ein FACS-Röhrchen auf Eis und schützen Sie sie vor Licht. Sortieren Sie die CD4-positive, CD25-negative, CD62L-positive, CD44-negative Population in vollständiges RPMI-Medium. Sobald alle Zellen gesammelt wurden.Waschen Sie die naiven T-Zellen in frischem, vollständigem Medium. Anschließend resuspendieren Sie das Pellet in vollständigem RPMI, zählen die naiven T-Zellen und stellen die Konzentration auf eine Million Zellen pro Milliliter ein, um die Differenzierung in T-Helfer-Subtypen in vitro zu induzieren. Danach waschen Sie jede Vertiefung von Zellkulturplatten, die zuvor mit anti-CD3 und anti-CD28 beschichtet wurden, mit einem Milliliter steriler, FBS-freier PBS und beimpfen die Zellen. Die Zellen ergänzen schließlich das Kulturmedium mit den entsprechenden Zytokinen und blockierenden Antikörpern, wie in der Tabelle dargestellt, und inkubieren die Zellen vier bis fünf Tage nach vier bis fünf Tagen in Kultur bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Eine intrazelluläre Zytokin-Färbung der CD4-positiven T-Zellen aus den in vitro differenzierten TH1-, TH2-, induzierbaren Treg- und TH17-Kulturen kann durchgeführt werden, um zu bestätigen, dass jedes T-Zell-Subset das erwartete Zytokinprofil aufweist.Tatsächlich zeigt A, dass die Subpopulationen nach 24-stündiger Reizstimulation mit anti-CD3-EISs ebenfalls die entsprechende extrazelluläre Produktion der intrazellulär exprimierten Zytokinproteine aufweisen. Die Echtzeit-PCR für linien-spezifische Transkriptionsfaktoren bestätigt zudem die geeigneten Transkriptionsfaktorprofile der in vitro differenzierten CD4-positiven T-Helferzell-Subpopulationen. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man murine Lymphknoten- und Milzzellen isoliert und verarbeitet, um naive CD4-positive T-Helferzellen zu erhalten.Außerdem können Sie diese T-Zellen in TH1-, TH2-, TH17- oder ireg-Zellen differenzieren.

mouse-nave-cd4-t-cell-isolation-vitro-differentiation-into-t-cell

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Maus Naive CD4

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