Name: Viral-vermittelte Kennzeichnung und Transplantation von Medial Ganglienhügel (MGE) Zellen für In-vivo- Studien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Lernen Sie die virale Transduktion und Transplantation von MGE-Zellen für In-vivo-Studien zur Untersuchung GABAerger Interneuronen in natürlicher Umgebung. Diese Methode ermöglicht präzise genetische Modifikation.

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Nina Irland, Weston Havens Foundation, NIMH R01 MH081880 und NIMH R37 MH049428 Autism Speaks,: Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus JLRR unterstützt. PRW wurde durch ein Stipendium der National Science Council von Taiwan unterstützt. SFS wurde durch F32 (MH103003) unterstützt.

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<li>Batista-Brito, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+integration+of+cortical+interneurons+into+a+functional+network%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">The developmental integration of cortical interneurons into a functional network.</a> Curr. Top. Dev. Bio. 87, 81-118 (2009).</li>
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<li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Resource+of+Cre+Driver+Lines+for+Genetic+Targeting+of+GABAergic+Neurons+in+Cerebral+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Resource of Cre Driver Lines for Genetic Targeting of GABAergic Neurons in Cerebral Cortex.</a> Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li>
<li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Bio%22%5BJournal%5D)">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Bio. 3 (5), e159(2005).</li>
<li>Southwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneurons+from+embryonic+development+to+cell-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interneurons from embryonic development to cell-based therapy.</a> Science. 344 (6180), 1240622(2014).</li>
<li>Hunt, R. F., Girskis, K. M., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+progenitors+grafted+into+the+adult+epileptic+brain+control+seizures+and+abnormal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABA progenitors grafted into the adult epileptic brain control seizures and abnormal.</a> Nature Neuroscience. 16 (6), 692-697 (2013).</li>
<li>Braz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forebrain+GABAergic+Neuron+Precursors+Integrate+into+Adult+Spinal+Cord+and+Reduce+Injury-Induced+Neuropathic+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Forebrain GABAergic Neuron Precursors Integrate into Adult Spinal Cord and Reduce Injury-Induced Neuropathic Pain.</a> Neuron. 74, 663-675 (2012).</li>
<li>Vogt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lhx6+Directly+Regulates+Arx+and+CXCR7+to+Determine+Cortical+Interneuron+Fate+and+Laminar+Position%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Lhx6 Directly Regulates Arx and CXCR7 to Determine Cortical Interneuron Fate and Laminar Position.</a> Neuron. 82 (2), 350-364 (2014).</li>
<li>Alvarez-Dolado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+inhibition+modified+by+embryonic+neural+precursors+grafted+into+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 26 (4), 7380-7389 (2006).</li>
<li>Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKX2.1+specifies+cortical+interneuron+fate+by+activating+Lhx6%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6.</a> Development. 135 (8), 1559-1567 (2008).</li>
<li>Arguello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dapper+Antagonist+of+Catenin-1+Cooperates+with+Dishevelled-1+during+Postsynaptic+Development+in+Mouse+Forebrain+GABAergic+Interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dapper Antagonist of Catenin-1 Cooperates with Dishevelled-1 during Postsynaptic Development in Mouse Forebrain GABAergic Interneurons.</a> PLoS ONE. 8 (6), e67679(2013).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons+in+prefrontal+cortex+receive+subtype-specific+forms+of+excitation+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons in prefrontal cortex receive subtype-specific forms of excitation and inhibition.</a> Neuron. 81 (1), 61-68 (2014).</li>
<li>Chen, Y. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+%E2%80%9CMGE+Enhancers%E2%80%9D+for+Labeling+and+Selection+of+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Medial+Ganglionic+Eminence+%28MGE%29+Progenitors+and+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Use of “MGE Enhancers” for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons.</a> PLoS ONE. 8 (5), e61956(2013).</li>
<li>Pattabiraman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+enhancers+active+in+protodomains+of+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of enhancers active in protodomains of the developing cerebral cortex.</a> Neuron. 82 (5), 989-1003 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die Verwendung von GABAergen kortikalen Internvorstufen aus den embryonalen Ganglien Eminenzen (GES) für Zelltherapien ist vielversprechend für viele Bedingungen 12 -1 4. Präzise molekulare Techniken sind erforderlich, um zu verfolgen und Express Gene von Interesse in bestimmten Interngruppen. Hier stellen wir ein ausführliches Protokoll zur Markierung embryonalen MGE Zellen mit Lentiviren vor der Transplantation, und zeigen, wie diese Technik verwendet werden, um Gene von Interesse in spezifischen kortikalen...

GABAerge kortikalen Interneuronen umfassen ~ 20-30% der Neuronen im Säuger-Neocortex, der Rest entsprechen, glutamatergen Neuronen Haupt exzitatorischen. Inter sind sehr unterschiedlich in elektrophysiologischen Eigenschaften, Axon und Dendriten Morphologie und synaptischen Ziel 1 und Ungleichgewichte in exzitatorischen / hemmende Ton werden die Hypothese aufgestellt, einige Phänotypen der neurologischen / neuropsychiatrische Störungen einschließlich Autismus, Schizophrenie und Epilepsie 2 zugrunde liegen. Das Gesamtziel des hierin beschriebenen Protokolls ist es, eine Einrichtung zu GABAergen kortikalen Intern Progenitoren vor der Transplantation in vivo Analysen effizienter genetisch zu verändern ist. Kortikale GABAergen Interneuronen sind in den medialen und kaudalen Ganglien Eminenzen (MGE und CGE, beziehungsweise) 3,4 sowie die präoptischen Bereich 5 geboren. Kortikale Intern Vorfahren unterziehen Fern tangentiale Migration gefolgtdurch radiale Migration ihrer endgültigen Ziele zu erreichen. Nach der Ankunft am Zielort, müssen diese kortikale Inter richtig in die bestehende neuronale Netzwerk zu integrieren, und jedes einzelne Interngruppe wird auf kortikale Schaltkreise in spezifischer Weise bei. Vier Hauptgruppen können durch molekulare Marker unterscheiden: MGE-abgeleitete Somatostatin (SST) + und Parvalbumin (PV) + Untergruppen und CGE-abgeleitete vasoaktive intestinale Peptid (VIP) + und Reelin +, SST - 6 Untergruppen. Verschiedenen kortikalen Interngruppen werden über verschiedenen Zeiten während der Embryonalentwicklung im MGE und CGE 7, 8 getragen. Diese und andere kortikalen GABAergen Intern Marker wurden verwendet, um spezifische Cre-Treiberleitungen für viele dieser Untergruppen 9-11 zu erzeugen. Die Transplantation von MGE Vorfahren hat als potenzielle zellbasierte Therapie zu Störungen, die durch Ungleichgewichte verursacht werden können, zu behandeln tauchtin Anregungs- / Hemmung 12-24. Diese therapeutische Nutzen kann zum Teil auf der einzigartigen Fähigkeit von MGE Vorfahren (zu zerstreuen, zu differenzieren und in eine Wirts Gehirn integriert) oder möglicherweise, weil viele Rand somatischen hemmende PV + Zellen aus dem MGE abgeleitet sein. MGE Zellen können auch schnell und effizient mit Lentiviren vor der Transplantation 15 transduziert, so dass Zellen, die in vitro genetisch modifiziert sind, um in vivo untersucht werden. Der Grund für die Entwicklung dieses Ansatzes war es, Hindernisse bei der Untersuchung GABAergen kortikalen Intern Entwicklung und Reifung zu überwinden. Insbesondere erlaubt MGE Transplantation Forscher die Entwicklung von mutierten Zellen in vivo zu untersuchen, wenn das mutierte Maus sonst haben starb in einem frühen Zeitpunkt. Weiterhin kann durch die Einführung von Genen von Interesse vor der Transplantation, die Auswirkungen spezifischer Gene auf einem mutierten Phänotyp könnte in einer eff beurteileniziente Weise. Hier bieten wir ein ausführliches Protokoll zu MGE Zellen mit Lentiviren vor der Transplantation zu transduzieren. Darüber hinaus zeigen wir, wie diese Technik angepasst werden, um ein Gen von Interesse an bestimmten Interngruppen aus einer heterogenen Gruppe von kortikalen Intern Vorläufer zu exprimieren, mit einer Kombination von Cre-abhängige Expression Lentiviren und verfügbare Cre-Treibermauslinien. Außerdem führt dieses Protokoll Techniken und eine Plattform für Forscher auf genetisch GABAergen kortikalen Intern Vorstufen zur in-vivo-Studien zu modifizieren in einer einzigartigen Weise. Ein Vorteil dieser Technik gegenüber anderen aktuellen Ansätzen ist, dass die transplantierten Zellen MGE wird von der Injektionsstelle zu zerstreuen. Auch im Gegensatz zu Schwervirusinjektionen nach MGE Zellen verteilen ihre Morphologie ist leichter zu beurteilen. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um den Effekt der Einführung von Genen von Interesse in Wildtyp- oder mutierte Zellen, die Einführung eines Zelltyp-spezifische studierenReporter Morphologie beurteilen, oder potentiell, um die Wirkung des Krankheits Allele in vivo zu studieren.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagenzien und Ausrüstung für die MGE-Zelltransplantation</td></tr><tr><td>1 ml Spritze</td><td>REF 309602</td><td>BD, Becton Dickinson und Firma</td><td></td></tr><tr><td>30 1/2 G Nadel</td><td>305106</td><td>BD, Becton Dickinson und Firma</td><td></td></tr><tr><td>Präzisionsbohrung zur Lieferung von 5 & Mikro; l (kommt mit Kolben)</td><td>5-000-1005</td><td>Drummond wissenschaftliches Unternehmen</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PM-999</td><td>Polysciences, Inc.</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop mit Galgenstativ **</td><td>MZ6</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Digital nur für Mäuse stereotaktisches Instrument **</td><td>51725D</td><td>Firma</td><td></td>Stoelting</tr><tr><td>Einachsiger ölhydraulischer Feinmikromanipulator **</td><td>MO-10</td><td>Narishige</td><td></td></tr><tr><td>Diamantbeschichteter Rotationsanfaser</td><td></td><td>made in house</td><td></td></tr><tr><td>Nadelpipettenabzieher</td><td>730</td><td>Kopf Instrumente</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td></td><td>Jede Drogerie oder Apotheke</td><td></td></tr><tr><td>Jede Pipette und Spitzen, die zuverlässig messen können 1 & Mikro; l des Volumens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">** Dies sind die speziellen Modelle, die wir verwenden, aber viele andere Setups sollten funktionieren</td></tr><tr><td colspan="4">Optionale Reagenzien (zur Herstellung von Lentiviren)</td></tr><tr><td>25 mm, 0,45 &micro; m filter</td><td>09-719B</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Ultraklare Zentrifugenröhrchen (25 x 89 mm)</td><td>344058</td><td>Beckman Coulter&reg;</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 (1,5 ml Größe)</td><td>11668019</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Andere kommerziell erhältliche Verbrauchsmaterialien</td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE-Plasmidkodierung gag/pol</td><td>12251</td><td>Addgene</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev Plasmidkodierung Rev</td><td>12253</td><td>Addgene</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G Plasmid kodiert VSVG</td><td>12259</td><td>Addgene</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-Flex-GFP</td><td>28304</td><td>Addgen</td><td></td></tr></tbody></table>

viral-vermittelte kennzeichnung und transplantation von medial ganglienhügel (mge) zellen für<em&gt; in-vivo-</em&gt; studien

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies

GABAerge kortikale Inter, aus dem embryonalen medialen und kaudalen Ganglien Eminenzen (MGE und CGE) abgeleitet ist, sind funktionell und morphologisch vielfältig. Eingriffe in das Verständnis der Rolle der unterschiedlichen kortikalen Interngruppen hergestellt worden ist, aber es gibt immer noch viele Mechanismen ausgearbeitet werden, die zur Entwicklung und Reifung von verschiedenen Arten von GABAergen Zellen beitragen können. Darüber hinaus kann verändert GABAergen Signalisierung an Phänotypen von Autismus, Schizophrenie und Epilepsie beitragen. Spezifische Cre-Treiberleitungen begonnen, parzellieren die Funktionen einzigartige Interngruppen. Trotz der Fortschritte in Maus-Modellen, ist es oft schwierig, GABAergen kortikalen Intern Progenitoren effizient Studie mit molekularen Ansätzen in vivo. Eine wichtige Technik verwendet, um die Zelle autonom Programmierung dieser Zellen zu studieren, ist die Transplantation von MGE Zellen in Wirts Rinden. Diese transplantierten Zellen wandern ausführlich, zu differenzieren, einend funktional zu integrieren. Zusätzlich kann MGE Zellen effizient mit Lentivirus unmittelbar vor der Transplantation transduziert werden, so dass für eine Vielzahl von molekularen Ansätzen. Hier werden wir ausführlich ein Protokoll zu MGE-Zellen effizient zu transduzieren vor der Transplantation für die in vivo-Analyse, unter Verwendung verfügbarer Cre-Treiberleitungen und Cre-abhängigen Expressionsvektoren. Dieser Ansatz ist vorteilhaft, weil sie vereint präzise genetische Manipulation die Fähigkeit dieser Zellen nach einer Transplantation zu dispergieren, der eine größere Zelltyp-spezifische Auflösung in vivo.

Seit MGE Zellen haben die einzigartige Fähigkeit, Migration und Integration, wenn in eine Wirts Neocortex 16 transplantiert, bieten sie eine ausgezeichnete Modellsystem für die genetische Manipulation vor der in vivo-Studien. Hier zeigen wir, wie man MGE Gewebe von E13.5 Embryonen zu isolieren (1 und 2), die dann mit Lentiviren entweder in vitro oder in einer schnellen Art und Weise vor der Transplantation in vivo Studien transduziert werden kann. Labeling MGE über ...

GABAerge kortikalen Internvorläuferzellen zu verteilen, zu entwickeln und synaptisch in eine Wirtsrinde nach der Transplantation zu integrieren. Diese Zellen können leicht vor der Transplantation für in vivo-Studien mit gentechnisch veränderten GABAerge Vorläufer transduziert werden. Hier zeigen wir virale Markierungstechniken auf bestimmte Interngruppen mit bestehenden Linien und Cre Cre-abhängigen Reporter Ziel.

Viral-vermittelte Kennzeichnung und Transplantation von Medial Ganglienhügel (MGE) Zellen für<em&gt; In-vivo-</em&gt; Studien

GABAergic cortical interneurons, derived from the embryonic medial and caudal ganglionic eminences (MGE and CGE), are functionally and morphologically ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, GABAerge Neuronenvorläuferzellen aus dem MGE vor der Transplantation in einen Wirt für In-vivo-Studien schnell viralmittels zu transduzieren. Dies wird erreicht, indem zunächst MGE-Zellen aus einem Embryo eines Cre-positiven Spenders isoliert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die isolierten MGE-Zellen schnell und effizient mit einem für einen bestimmten Zweck konstruierten Virus zu markieren, beispielsweise um einen spezifischen Zelltyp zu kennzeichnen.Anschließend werden die transduzierten Zellen in einen Wirt transplantiert und in vivo entwickeln gelassen. Letztendlich können Geruchsmikroskopie oder andere Methoden verwendet werden, um die transduzierten und transplantierten Zellen zum geeigneten Zeitpunkt zu untersuchen. Einer der Hauptvorteile dieses Ansatzes im Vergleich zu anderen Techniken wie der direkten Virusinjektion besteht darin, dass sich MGE-Zellen über weite Strecken vom Injektionsort – einer Verletzungsstelle – wegbewegen, wodurch die Untersuchung der Zellen in einer physiologischeren Umgebung möglich wird.Da MGE-Zellen Vorläuferzellen kortikaler und neuronaler Zelltypen sind, die bei neuropsychiatrischen Erkrankungen wie Autismus, Schizophrenie und Epilepsie beteiligt sind, gehen wir davon aus, dass die hier beschriebenen Techniken tatsächlich zur Aufklärung der biologischen Grundlagen einiger dieser neuropsychiatrischen Erkrankungen beitragen werden. Darüber hinaus ermöglicht diese Technik eine schnelle genetische Modifikation dieser Zellen für In-vivo-Studien. Nachdem das Lentivirus hergestellt und das MGE gemäß den Anweisungen im schriftlichen Protokoll disseziert wurde, sammeln Sie beide Hemisphären des MGE und geben das Gewebe in zwei Sammelgefäße mit je 1,5 Milliliter, die jeweils 500 Mikroliter DMEM mit 10 % FBS enthalten. Bewahren Sie die Proben bis zum vollständigen Sammeln des gesamten Gewebes auf Eis auf.Überführen Sie die Röhrchen dann in eine zertifizierte BSL-2-Werkbank. Aspirieren Sie vorsichtig das Medium, ohne das am Boden des Röhrchens abgesetzte MGE-Gewebe zu stören. Geben Sie anschließend etwa 500 µL vorgewärmtes DMEM mit 10 % FBS-Medium hinzu.Geben Sie Poly-Brain unter Rühren bis zur Endkonzentration von acht Mikrogramm pro Milliliter hinzu und pipettieren Sie mit einer P-1000-Pipettenspitze, bis eine Einzelzell-Suspension vorliegt. Anschließend geben Sie 15 bis 20 Mikroliter des konzentrierten Lentivirus in jedes Reaktionsgefäß. Verschließen Sie danach jedes Gefäß fest, drehen Sie es zum Mischen um und stellen Sie alle Gefäße in einen 37-Grad-Celsius-Inkubator.Die Zellen mindestens 30 Minuten, jedoch nicht länger als eine Stunde, mit dem Lentivirus inkubieren, da längere Zeiträume zu einer verminderten Zellviabilität geführt haben. Nach der Inkubation die Röhrchen alle 10 Minuten umdrehen.Entfernen Sie die Röhrchen aus dem Inkubator und zentrifugieren Sie sie bei 700 × g bei vier Grad Celsius für drei Minuten. Um die Zellen in der BSL-2-Werkbank zu pelletieren, entfernen Sie das Überstand und entsorgen Sie ihn in 10 % Bleiche. Fügen Sie anschließend ein Milliliter DMEM mit 10 % FBS und Retro hinzu.Sediment zwei- bis dreimal zur Wäsche nach der Zentrifugation. Wie zuvor beschrieben, diesen Waschschritt zwei- bis dreimal wiederholen, um überschüssiges Virus zu entfernen. Nach dem letzten Waschschritt so viel Medium wie möglich abnehmen und jedes Röhrchen auf Eis stellen, da sich an den Röhrchenwänden restliches Medium befinden kann.Ungefähr zwei bis drei Mikroliter Medium bedecken das Zellpellet, wenn das Transplantationsverfahren beginnt. Unter Einhaltung steriler Technik Mineralöl in eine Ein-Milliliter-Spritze aufziehen und dann mit einer Nadel der Stärke 30½ Gauge die Glaspipette vollständig mit dem Mineralöl rückwärts auffüllen. Anschließend die Glaspipette am stereotaktischen Gerät befestigen und mithilfe eines Assistenten den Kolben mit dem hydraulischen Antrieb laden.Bewegen Sie den Kolben etwa zur Hälfte in die Glaspipette hinein und entfernen Sie das austretende Mineralöl mit einem sauberen Papierhandtuch. Drehen Sie danach die Ecke eines sterilen Papierhandtuchs zu einer feinen Spitze und verwenden Sie diese, um überschüssiges Medium über dem mge-Zellpellet vorsichtig zu entfernen. Dadurch wird die Zelldichte konzentriert, sodass geringere Injektionsvolumina erreicht werden können.Verwenden Sie anschließend eine P2-Pipette, um den Zellpellet langsam aufzusaugen und ihn ein- bis zweimal umzupipettieren, bevor Sie ihn auf einer hydrophoben Oberfläche abgeben. Das Volumen sollte knapp unter einem Mikroliter liegen. Führen Sie die Pipettenspitze in die Zellsuspension ein und saugen Sie mithilfe des hydraulischen Antriebs die Zellsuspension in die Pipette auf.Nach der Anästhesie überprüfen Sie mithilfe einer Hypothermie-Prüfung die Wirksamkeit der Anästhesie. Durch das Anzupfen der Haut zwischen den Zehen mit einer Pinzette sollte keine Reaktion zu beobachten sein. Danach platzieren Sie das Tier auf einer Form unter dem Injektionsgerät und straffen die Haut, indem Sie die Haut am Kopf zurückziehen und anschließend fixieren.Manipulieren Sie mit handelsüblichem Laborklebeband schnell den Stereotaxiearm, um die Spitze der Glaspipette senkrecht zur Kopfoberfläche auf dem Kopf des Welpen zu positionieren. Sobald die Pipette den Kopf berührt, betrachten Sie dies als Nullpunkt. Drücken Sie anschließend die Pipette durch die Hautoberfläche und den Schädel in die Großhirnrinde hinein.Danach die Pipette zweimal einführen und zurückziehen, bevor die Zielsteuerung der Zellen in den Neokortex gestoppt wird. Die Injektionen werden durchgeführt, wenn sich die Mikropipette auf einer Tiefe von 0,1 Millimeter befindet. Sobald die Nadel in Position ist, wird das hydraulische Gerät gedreht, um den Kolben in die Glaspipette vorzuschieben, und 50 bis 70 Nanoliter pro Injektionsstelle injiziert.Wiederholen Sie diesen Vorgang an drei bis sechs verschiedenen Stellen auf unterschiedlichen rostralen Kordelhöhen. Wenn eine breite Verteilung transformierter Zellen im gesamten Neokortex erforderlich ist, nehmen Sie das Jungtier nach Abschluss der Injektionen vom Präparationsstadium und markieren Sie es gemäß den genehmigten Verfahren. Sobald sich das Jungtier erholt hat und sich eigenständig bewegen kann, setzen Sie es zu dem säugenden Weibchen und dem Rest des Wurfs zurück.Überprüfen Sie die Welpen nach dem Eingriff und am folgenden Tag, um sicherzustellen, dass in diesem Experiment keine Anzeichen einer Verschlechterung der Gesundheit vorliegen. E 13.5 Somatostatin-Iris-Crew-positive AI 14-Schwarm plus MGE-Zellen wurden statt in Wildtyp-Neokortizes transplantiert oder vor der Transplantation mit dem CAG flex GFP-Lentivirus transduziert und sieben Tage nach der Transplantation untersucht. Diese immunfluoreszenten Aufnahmen von Neokortizes sieben oder 35 Tage nach der Transplantation zeigen repräsentative transplantierte, tomato-positive MGE-Zellen; hier werden immunfluoreszente Aufnahmen von MGE-Zellen dargestellt, die mit dem CAG flex GFP-Lentivirus transfiziert und sieben Tage nach der Transplantation (DPT) analysiert wurden.Dieses Histogramm zeigt die Quantifizierung des Anteils an 2D-Tomato-positiven Zellen, die sieben Tage nach der Transplantation GFP exprimierten. Für die folgenden Bilder wurden MGE-Zellen von E 13,5 Somatostatin-IRIS-CRE-positiven Mäusen gewonnen, mit einem CAG-Flex-GFP-Lentivirus transduziert und in die Neokortex von P1-wildtypischen Wirtsorganismen transplantiert, bevor die Beurteilung erfolgte. 35 Tage nach der Transplantation zeigt dieses repräsentative Bild aus der Neokortex der transplantierten Wirtsorganismen die Expression von GFP aus dem Flex-Vektor.Hier wurde das Gewebe auf Somatostatin gefärbt, um die Ko-Expression von GFP und somatostatinexprimierenden GABAergen Neuronen zu bestimmen, und hier wurde das Gewebe auf Parvalbumin gefärbt. Diese überlagerten Bilder, die zusätzlich mit DAPI gefärbt wurden, zeigen das Ausmaß der Kolokalisation von GFP mit Somatostatin und Parvalbumin. Schließlich zeigt dieses Histogramm die Quantifizierung des Anteils der GFP-Zellen, die Somatostatin oder Parvalbumin koexprimierten. Nach den Methoden dieses Verfahrens können auch andere molekulare Werkzeuge, beispielsweise ein dentales assoziiertes Virus, verwendet werden, um Zellen für In-vivo-Studien zu markieren. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Lentiviren äußerst gefährlich sein kann; Arbeitsschutzmaßnahmen wie die Verwendung geeigneter PSA und die Arbeit in einer BSL sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens stets beachtet werden.

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Dieses Video zeigt die virale Markierung und Transplantation von Zellen der medialen ganglionären Eminenz (MGE) für in vivo-Studien. Es beschreibt die Schritte, die bei der Transduzierung von MGE-Zellen mit einem viralen Reporter, der Transplantation dieser transduzierten Zellen in den Kortex eines Maus-Welpen und der Ermöglichung der Reporterexpression in bestimmten Interneuronen-Subtypen erforderlich sind.

Viral-vermittelte Markierung und Transplantation von medialen ganglionären Eminenzzellen für in vivo Studien

Quelle: Pereira, M. et. al., In vivo direkte Reprogrammierung von residenten Gliazellen in Interneuronen durch intrazerebrale Injektion viraler Vektoren. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt die stereotaktische Injektion eines Adeno-assoziierten Virus in die Großhirnrinde einer transgenen Maus, um Cre-abhängige neuronale Reprogrammierung und fluoreszierende Reportergene in Gliazellen zu bringen.

Stereotaktische Injektion von viralen Vektoren für die Reprogrammierung von Gliazellen in einem Mausmodell

Quelle: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt das Verfahren zur Injektion eines Plasmidvektors, der das interessierende Gen trägt, in Interneuron-Vorläuferzellen in einem embryonalen Hirnschnitt, gefolgt von einer Elektroporation für den Plasmideintritt und die Genexpression. Diese modifizierten Vorläuferzellen können später zur Behandlung von Hirnerkrankungen...

Agarose-eingebetteter Elektroporations-unterstützter Gentransfer in kortikalen Interneuronen-Vorläuferzellen der Maus

Hier beschreiben wir ein Verfahren, das auf der Verwendung von lentiviralen Partikeln zur langfristigen genetischen Modifikation von neuralen Stammzellen und/oder ihren benachbarten ependymalen Zellen in der adulten ventrikulär-subventrikulären neurogenen Nische basiert und die getrennte Analyse von zellautonomen und nicht-autonomen, nischenabhängigen Effekten auf neurale Stammzellen ermöglicht.

Stabile und effiziente genetische Veränderung von Zellen in der erwachsenen Maus V-SVZ für die Analyse von Neural Stem Cell Autonome und Nicht autonome Effekte

Hier bieten wir eine kostengünstige und zuverlässige Methode um elektroporiert Gehirn organotypischen Slice Kulturen von mäuseembryonen geeignet für konfokale Mikroskopie und Leben-bildgebende Verfahren zu generieren.

Ex Utero Elektroporation und organotypischen Slice Kulturen der embryonalen Mäusegehirnen für Live-Aufnahmen von Migration Gabaergen Interneuronen

Dieses Protokoll zielt darauf ab, direkt umprogrammierte Interneuronen in vivo zu erzeugen, indem ein AAV-basiertes Virussystem im Gehirn und ein FLEX synapsingesteuerter GFP-Reporter verwendet werden, der die Zellidentifikation und weitere Analyse in vivo ermöglicht.

In Vivo Direkte Reprogrammierung von Resident Glial Cells in Interneurons durch Intracerebral Injection of Viral Vectors

Lasermikrodissektion (LMD) ist eine empfindliche und hochreproduzierbare Technik, die verwendet werden kann, um Wege aufzudecken, die Gliomheterogenität und Invasion vermitteln. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll zur Isolierung diskreter Bereiche aus Gliomgewebe mittels Laser LMD, gefolgt von transkriptomischer Analyse.

Lasercapture Mikrodissektion von Glioma Subregionen für räumliche und molekulare Charakterisierung der intratumoralen Heterogenität, Oncostreams und Invasion

Wir stellen verbesserte Protokolle für die retrovirale Transduktion von Transportrezeptoren und kompetitives Homing vor, um die Rezeptor-vermittelte organ- und mikroumgebungsspezifische Lymphozytenpositionierung zu untersuchen. Diese Methode bietet wertvolle Einblicke in die Mechanismen des Transports von Immunzellen und hat potenzielle Anwendungen in der zukünftigen Grundlagen- und Therapieforschung.

Effiziente retrovirale Transduktion und kompetitives Homing zur Untersuchung der GPCR-vermittelten T-Zell-Lokalisierung in verschiedenen Gewebemikroumgebungen

Lernen Sie die virale Transduktion und Transplantation von MGE-Zellen für In-vivo-Studien zur Untersuchung GABAerger Interneuronen in natürlicher Umgebung. Diese Methode ermöglicht präzise genetische Modifikation.

Viral-vermittelte Kennzeichnung und Transplantation von Medial Ganglienhügel (MGE) Zellen für

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