Agarose Mikrokammern für Langzeit Calcium Imaging von
24. Juni 2015
Die Abbildung von Verhalten und neuronaler Aktivität über lange Zeitskalen ohne Immobilisierung des Tieres ist eine Voraussetzung, um Verhalten zu verstehen. Die mikrofluidische Kammerbildgebung (AMI) von Agarose kann verwendet werden, um die neuronale Aktivität und das Verhalten für alle Lebensstadien von Caenorhabditis elegans abzubilden.
Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Verhaltensentwicklung und neuronale Aktivität mehrerer erwachsener Exemplare von *C. elegans* zu überwachen. Dies wird erreicht, indem die Würmer in mit Nahrung gefüllte mikrofluidische Kammern (Aros) kultiviert werden. Langzeit-Calcium-Bildgebung wird mithilfe einer E-M-C-C-D-Kamera und TTL-getriggerten kurzen Belichtungszeiten durchgeführt.
Das Verfahren kann hochskaliert werden, indem mehrere Kammern nacheinander gescannt oder mehrere Kammern gleichzeitig aufgezeichnet werden. Die Ergebnisse zeigen das Verhalten von Larven und erwachsenen Tieren sowie kalziumbasierte transiente Vorgänge in Command-Interneuronen. Der Hauptvorteil dieser Mikrokammer-Technik besteht darin, dass Verhalten und Entwicklung über einen langen Zeitraum mit hochwertiger Bildgebung verfolgt werden können.
Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da es schwierig ist, die Mikrokammern mit der richtigen Menge an Nahrung und Wärme zu befüllen. Beginnen Sie damit, ein Mikroskop mit Deckelheizung, automatischem Probentisch und E-M-C-C-D-Kamerasystem einzurichten. Stellen Sie Polymethylsuboxan-Stempel in einer Mikrofluidik-Einrichtung oder mithilfe einer kommerziellen Fertigungsanlage her.
Schneiden Sie den PDMS-Chip mit einem Skalpell in 16 einzelne Stempel. Danach werden sowohl der Stempel als auch eine Objektträgerplatte etwa eine Minute lang Luftplasma ausgesetzt, bevor der Stempel auf der Platte befestigt wird. Arbeiten Sie langsam, um das Schmelzen des Kunststoffs zu vermeiden.
Schneiden Sie einen quadratischen Bereich aus dem Boden einer 3,5 cm-Dish aus. Bereiten Sie mehrere Dishes gleichzeitig vor. Bereiten Sie sterile Aliquote sowohl von Aero mit hohem als auch mit niedrigem Schmelzpunkt vor der Verwendung vor.
Geben Sie drei Aliquote mit Aeros mit hohem Schmelzpunkt auf einen Heizblock. Schmelzen Sie außerdem ein Eloqua mit niedrigem Schmelzpunkt und geben Sie es auf einen separaten Heizblock. Nehmen Sie zunächst die Kunststoffschale mit der zuvor angefertigten quadratischen Öffnung und stellen Sie sie verkehrt herum auf, sodass die Öffnung nach oben zeigt.
Verwenden Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband, um die Öffnung abzudecken. Drehen Sie die Petrischale um, sodass sich das Klebeband an der Unterseite befindet, und stellen Sie die Schale auf eine harte Oberfläche. Befreien Sie die Öffnung mit einem Skalpell.
Füllen Sie anschließend den Bereich, der die Öffnung umgibt, mit zwei Millilitern Agarose mit hohem Schmelzpunkt. Warten Sie, bis der Agarose erstarrt ist. Sobald er fest ist, entfernen Sie den Schutzfilm, der das doppelseitige Klebeband auf der anderen Seite bedeckt.
Dadurch entsteht ein feiner Ring aus Klebeband, der die Außenseite der Öffnung umgibt. Das Agar fungiert als Feuchtigkeitsreservoir, das später die Probe umgeben wird. Bevor die Mikrokammern gebaut werden, bereiten Sie die PDMS-Stempeloberfläche vor, indem Sie sie 20 bis 60 Sekunden lang einer Luft-Plasma-Behandlung aussetzen.
Erstellen Sie zwei Abstandshalter gleicher Höhe, indem Sie fünf bis neun Glasobjektträger stapeln. Legen Sie einen einzelnen Glasobjektträger zwischen die beiden Stapel. Platzieren Sie anschließend den Glasobjektträger mit dem PDMS-Stempel über die Abstandshalter.
Stellen Sie die Höhe der Abstandshalter so ein, dass ein 1,5 Millimeter großer Spalt zwischen der Prägfläche und dem Objektträger besteht. Wenn Sie bereit sind, geben Sie einen Tropfen heißen, hochschmelzenden Aros auf den Objektträger in die Nähe des PDMS-Stempels und schieben Sie den Stempel schnell horizontal in die flüssige Aros. Sobald die Aros erstarrt ist und undurchsichtig erscheint, ziehen Sie den Stempel mit einer einzigen Bewegung vertikal ab.
Überführen Sie die Eier oder Würmer mithilfe eines feinen Platin-Draht-Höckers gemeinsam mit OP 50-Bakterien auf das Aros-Präparat. Verteilen Sie mit einer Wimper ein Ei oder einen Wurm pro Kammer zusammen mit Nahrung. Ein Aros-Präparat sollte etwa 30 Würmer enthalten.
Schneiden Sie den Aros-Schlitz, der die Mikrokammern enthält, zu einem Quadrat zurecht, sodass er gut in die Öffnung der Schale passt. Heben Sie den Schlitz mit einer Pinzette an und legen Sie ihn nach dem Einsetzen verkehrt herum auf einen Glasdeckel; heben oder verschieben Sie den Deckel danach nicht mehr, um zu vermeiden, dass Inhalte aus ihren Kammern gedrückt werden.
Die Kammern sind nun verschlossen. Als Nächstes platzieren Sie den Deckglaser in die Öffnung der Kunststoffschale. Drücken Sie den Deckglaser vorsichtig auf den Ring aus doppelseitigem Klebeband.
Achten Sie darauf, das Glas nicht zu zerbrechen. Drehen Sie die Schale um und verwenden Sie Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt, um den Spalt zwischen der Agarose-Schicht und dem Agarose-Reservoir zu füllen, sobald die Agarose erstarrt ist. Versiegeln Sie die Schale mit einem Deckel und Parafilm.
Nach Abschluss der Herstellung der Mikrokammern diese unter einem Stereomikroskop überprüfen. Das Befüllen der Kammern und die Feuchtigkeitskontrolle sind entscheidend für den Erfolg. Zunächst wird die Schale mit den Mikrokammern auf das Mikroskop gestellt und scharfgestellt. Alle 30 Minuten werden über einen Zeitraum von 24 Stunden jeweils 40 Bildsequenzen innerhalb von 20 Sekunden aufgezeichnet.
Richten Sie als Nächstes den Scan so ein, dass er jeden Wurm mithilfe des Stages abfährt. Ziel sollte es sein, etwa 30 Würmer in einem Durchlauf aufzuzeichnen. Mehrere Würmer können durch Herauszoomen abgebildet werden.
Verwenden Sie eine niedrigere Vergrößerung, um mehrere Mikrokammern abzudecken, und filmen Sie mehrere benachbarte Mikrokammern gleichzeitig. Nach Beendigung der Bildaufnahme trennen Sie die Daten für jede einzelne Kammer, indem Sie einen interessierenden Bereich, der ein Tier umfasst, zuschneiden. Eine Bildfolge-Subtraktion kann verwendet werden, um Beweglichkeitsdaten schnell auszuwerten.
Nach der Bildgebung wird die Kalziumbildgebung an einem Compound-Mikroskop durchgeführt, das für die Weitfeld-Epi-Fluoreszenz ausgestattet ist. Um die Lichtexposition zu begrenzen, verwenden Sie ein Transistor-Transistor-Logik-Signal, das eine LED auslöst, um die Probe zu beleuchten. Gleichzeitig nimmt die Kamera einen Bildrahmen auf.
Führen Sie einen Burst-Film über 24 Stunden durch, der jeden Wurm alle 15 bis 30 Minuten abbildet. Nehmen Sie zunächst 20 Sekunden mit DIC auf.
Danach 20 Sekunden mit GFP-Fluoreszenz. Und schließlich ein Bild des MK2-Signals zur Kontrolle der Expressionslevel. Verwenden Sie zur visuellen Dateninspektion eine Falschfarbendarstellung, um die Sichtbarkeit kleiner Änderungen der Fluoreszenzintensität zu verbessern.
Zum Schluss erfolgt die Analyse der Kalziumdaten mithilfe standardisierter Verfahren. Dieses Beispiel zeigt das Verhalten von Larven. Eine Kammer mit größeren Abmessungen ermöglicht die Entwicklung vom Ei bis zum erwachsenen Tier über einen langen Zeitraum; hier werden Verhaltensänderungen dargestellt.
Die Dauerlarve hier ist ein alternatives Entwicklungsstadium, das unter ungünstigen Umweltbedingungen eingenommen wird. Dieser erwachsene Wurm hat viele Eier in die Kammer abgelegt. Schließlich zeigt dieses Bild einen erwachsenen Hermaphroditen und ein Männchen beim Paaren innerhalb einer erwachsenen Kammer.
Kalzium-Imaging des Command-Interneurons A VA für eine L1-Larve ist hier dargestellt. Diese Bilder zeigen die Kalziumaktivität desselben Neuronentyps in einem erwachsenen Tier. Durch die Hochskalierung der Langzeit-Bildgebung können 30 Würmer auf einem einzigen Kamerachip abgebildet werden.
Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Kammern mit der richtigen Menge Nahrung zu füllen und die korrekten Bewegungen von Agarro sicherzustellen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Aros-Mikrokammer-Bildgebung an verschiedenen Entwicklungsstadien von Sea Elegance anwendet.
Übersicht
Diese Studie stellt eine Methode zur Überwachung des Verhaltens und der neuronalen Aktivität von Caenorhabditis elegans unter Verwendung von Agarose-Mikrofluidik-Kammern vor. Die Technik ermöglicht die Langzeit-Aufnahme von Kalziumtransienten und des Verhaltens über verschiedene Entwicklungsstadien des Organismus hinweg.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Verhaltensbiologie
- Bildgebende Verfahren
Hintergrund
- Das Verständnis von Verhalten erfordert die Beobachtung neuronaler Aktivität über längere Zeiträume.
- Agarose-Mikrofluidikkammern erleichtern diese Beobachtung, ohne die Versuchstiere zu immobilisieren.
- Die Kalzium-Bildgebung liefert Einblicke in die neuronale Aktivität während Veränderungen des Verhaltens.
- Visuelle Demonstrationen der Methode sind für eine erfolgreiche Umsetzung unerlässlich.
Zweck der Studie
- Entwicklung von Verhalten und neuronaler Aktivität in C. elegans verfolgen.
- Wirksamkeit von Agarose-Mikrofluidikkammern für Langzeit-Aufnahmen demonstrieren.
- Calcium-Transiente in Kommando-Interneuronen während verschiedener Entwicklungsstadien analysieren.
Verwendete Methoden
- Würmer wurden in mit Nahrung gefüllten Agarose-Mikrofluidikkammern kultiviert.
- Langzeit-Calcium-Bildgebung wurde mit einer E-M-C-C-D-Kamera durchgeführt.
- Mehrere Kammern wurden sequenziell oder gleichzeitig abgebildet.
- Die Datenanalyse umfasste die Bildsubtraktion zur Beurteilung der Beweglichkeit sowie die Analyse der Calciumdaten.
Hauptergebnisse
- Verhaltensmuster und Kalziumtransienten wurden sowohl für die larvalen als auch für die adulten Stadien aufgezeichnet.
- Die erfolgreiche Abbildung von Befehlsinterneuronen wurde erreicht.
- Langfristige Veränderungen im Verhalten wurden dokumentiert, einschließlich Paarung und Eiablage.
- Die Methode erwies sich als wirksam zur Beobachtung von Entwicklungsveränderungen in einer kontrollierten Umgebung.
Schlussfolgerungen
- Agarose-Mikrofluidikkammern sind ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung des Verhaltens und der neuronalen Aktivität von C. elegans.
- Mit dieser Technik können Forscher Entwicklungsveränderungen über längere Zeiträume verfolgen.
- Hochwertige Bildgebung ermöglicht eine detaillierte Analyse der neuronalen Aktivität in Zusammenhang mit dem Verhalten.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Langzeitüberwachung der neuronalen Aktivität bei frei beweglichen Organismen ermöglicht die Risikominimierung bei der Zielvalidierung, indem molekulare Störungen über längere Zeiträume hinweg mit funktionellen Phänotypen verknüpft werden. Dieser Ansatz stärkt das Vorhersagevertrauen in der frühen Entdeckungsphase, indem er verhaltensbezogene und physiologische Dynamiken erfasst, die für Krankheitsmodelle relevant sind. Die skalierbare Bildgebung mehrerer Probanden erhöht den Durchsatz für die Assay-Entwicklung und die Identifizierung von Leitstrukturen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Korrelation neuraler Aktivität mit verhaltensbezogenen Ausgabewerten bei intakten Organismen.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch langfristige Beobachtung der Zielinteraktion und der phänotypischen Konsequenzen.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Portfolio-Priorisierung, indem quantitative, zeitlich aufgelöste Daten zur funktionellen Zielmodulation bereitgestellt werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte, krankheitsrelevante Systeme für die Wirkstoffbewertung vor, indem der physiologische Kontext über längere Zeiträume erhalten bleibt.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit der Assays durch kontrollierte Umweltbedingungen und Futterverfügbarkeit.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die parallele Bildgebung von bis zu 40 Würmern und unterstützt damit Screening-Workflows mit mittlerer Durchsatzleistung.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Erhält die Relevanz von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem natürliche Verhaltensweisen und Entwicklungsverläufe bewahrt bleiben.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Verknüpft molekulare Interventionen mit systemebenen Ausgabewerten und reduziert damit Mehrdeutigkeiten bei der Interpretation des Zielmechanismus.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem eine nachhaltige Zielmodulation und phänotypische Antwort nachgewiesen werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows, indem sie funktionelle Messgrößen bereitstellt, die genetische oder chemische Störungen mit beobachtbaren Phänotypen verknüpfen und somit die Identifizierung von Leitstrukturen sowie die präklinische Weiterentwicklung unterstützen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch langzeitige Kalzium-Bildgebung definierter neuronaler Populationen.
- Screening: Liefert quantitative, reproduzierbare Ergebnisse mittels EMCCD-basierter Messung von Kalzium-Transienten und ermöglicht den Vergleich von Substanzeffekten.
- Analysen: Erzeugt Beweglichkeits- und Fluoreszenzdaten, die für statistische Analysen geeignet sind, und erleichtert Vergleiche zwischen verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Forschung, indem natürliche Verhaltensweisen und Entwicklungsveränderungen über Lebensabschnitte hinweg erfasst werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Dient als wiederverwendbare Plattform für langzeitliche phänotypische Screenings über mehrere Projekte und Zielstrukturen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem mechanistische Unklarheiten bei Target-Validierungsstudien reduziert werden.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung durch ein geschlossenes Kammerdesign und Umweltkontrolle.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitalnutzungseffizienz, indem hochinformative, langdauernde Studien mit minimalem Tierhandling ermöglicht werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem kontinuierliche phänotypische und funktionelle Daten bereitgestellt werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Herstellung von Mikrofluidik, der Kalzium-Bildgebung und im Umgang mit C. elegans.
- Setzt EMCCD-Kamerasysteme, präzise Temperaturkontrolle und automatisierte Objekttischansteuerung voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen bei der Herstellung der Kammern, dem Beladen mit Nahrung und den Bildgebungsprotokollen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn die Methode auf unterschiedliche genetische Hintergründe oder Krankheitsmodelle ausgeweitet wird.
- Ist durch die Stabilität der Kammern über längere Zeiträume sowie durch die Notwendigkeit einer konstanten Nahrungsversorgung und Feuchtigkeitskontrolle begrenzt.
